超微粉碎輔助酶解法制備海參凍干粉的生物活性分析

金丹莉，程逸潮，洪杏德，董秀萍，陳躍文1，*

（1.浙江工商大學 食品與生物工程學院，浙江 杭州 310018；2.浙江工商大學 東海食品臺州研究院，浙江 臺州 318000；3.青島紐萃生生物健康科技有限公司，山東 青島 266071；4.大連工業大學 食品學院，遼寧 大連 116034；5.國家海洋食品工程技術研究中心，遼寧 大連 116034）

海參（Cucumariafrondosa）是加拿大東海岸數量最多、分布最廣的物種之一，至2017 年，捕撈量已達9 萬t以上，價值在1 830 萬美金以上，常以冷凍、腌制和干品等形式出口到世界市場[1]。但是相較于刺參（Stichopus japonicus），海參仍然屬于低產值品種，有待更多地商業開發。然而，傳統的熱加工方式容易導致海參形態不完整、破壞整體口感等，而且在貯藏過程中，容易變硬、變黏和降低食用品質等，不適合長途運輸和遠距離銷售[2]。將食品原料加工成粉末主要是為了保持其穩定性，便于長途運輸和食用，還能將其用作調味品、色素和功能成分，因此此加工方式廣泛應用于食品領域[3]。超微粉碎是一種能夠改變物料粒徑的新興機械技術，常應用于面粉、奶粉、水果和蔬菜等，但在水產品領域中應用較少。Wu 等[4]利用超微粉碎生產的鯉魚骨粉，其溶解性和蛋白溶解性等均得到了提高。此外，超微粉碎技術能夠提高物料的酶解速率[5]。目前，關于超微粉碎輔助酶解法制備產品的生物活性研究相對較少。冷凍干燥是一種改善蛋白質水解物的穩定性、延長保質期和提高品質的技術手段[6]。例如，Dadi 等[7]研究表明凍干微膠囊的總酚含量、總黃酮含量、抗氧化活性和消化率均明顯高于噴霧干燥微膠囊；Xie 等[8]研究表明水稻蛋白水解物凍干法比噴霧干燥法具有更高的羥基自由基和DPPH 自由基清除活性。研究表明，海參含有20 種酚類化合物，有利于提高產品附加價值[9]。Senadheera 等[10]研究發現海參具有完整的必需氨基酸組成，因此海參蛋白酶解物可作為功能食品成分。然而，針對超微粉碎輔助酶解法制備的海參凍干粉的生物活性研究較少。

本文對超微粉碎輔助酶解法制備的海參凍干粉進行抗氧化、抗腫瘤、抗疲勞和增強免疫力的生物活性研究，以期為海參的精深加工形式提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

海參[體質量（100±10）g，體長（10±2.5）cm]：青島紐萃生生物健康科技有限公司；食品級中性蛋白酶（23 000 U/g）、食品級木瓜蛋白酶（102 000 U/g）：浙江一諾醫藥有限公司；水楊酸：上海麥克林生化科技有限公司；1，1－二苯基-2-三硝基苯肼（1，1-diphenyl-2-picrylhydrazyl，DPPH）：上海阿拉丁生化科技股份有限公司；硫酸亞鐵七水合物、鐵氰化鉀：上海源葉生物科技有限公司；無水三氯化鐵、二甲基亞砜（dimethyl sulfoxide，DMSO）：國藥集團化學試劑有限公司；HeLa 細胞：通派（上海）生物科技有限公司；青霉素-鏈霉素溶液：上海碧云天生物技術股份有限公司；胎牛血清（fetal bovine serum，FBS）、RPMI-1640：武漢普諾賽生命科技有限公司；C57BL/6 雄性小鼠：杭州派思奧生物科技有限公司；無特定病原體（specific pathogen free，SPF）小鼠維持飼料：沈陽茂華生物科技有限公司；注射用環磷酰胺（cyclophosphamide，CY）：江蘇盛迪醫藥有限公司；細胞計數-8（cell counting kit-8，CCK-8）檢測試劑盒、免疫球蛋白G（immunoglobulin G，IgG）測試盒、乳酸（lactic acid，LA）測試盒：南京建成生物工程研究所；以上化學試劑均為分析純。

1.2 儀器與設備

斬拌機（CM-14）：無錫市哈克遜工貿有限公司；振動式細胞級超微粉碎機（XDW-6J）：濟南達微機械有限公司；冷凍干燥機（SCIENTZ-100FG/A）：寧波新芝凍干設備股份有限公司；二氧化碳細胞培養箱（BPN-150CRH）：上海一恒科學儀器有限公司；小鼠轉棒式疲勞儀（KW-6C）：南京卡爾文生物科技有限公司；電子天平（XPR106DUH/AC）：梅特勒-托利多科技（中國）有限公司；全波長酶標儀（Multiskan SkyHigh）：賽默飛世爾科技（中國）有限公司。

1.3 方法

1.3.1 超微粉碎制備海參凍干粉

海參用流水解凍后浸泡脫鹽4 h。隨后，利用斬拌機和振動式細胞級超微粉碎機物理粉碎海參體壁。加入物料質量1.5%的活性酶（木瓜蛋白酶與中性蛋白酶質量比1∶2）酶解，酶解溫度45 ℃，酶解時間3.5 h。酶解結束后，沸水浴滅酶10 min，將酶解液冷凍干燥48 h，得到海參凍干粉。

1.3.2 海參凍干粉抗氧化活性的測定

1.3.2.1 DPPH 自由基清除能力的測定

參考Wu 等[11]的DPPH 自由基清除能力的測定方法，并作適當修改。配制濃度為0、5、10、15、20 mg/mL的海參凍干粉溶液，吸取1 mL 樣品，加入4 mL 以無水乙醇配制的0.2 mmol/L DPPH 溶液，避光反應30 min后，8 000 r/min 離心5 min。取200 μL 反應后溶液于96 孔板，于517 nm 下用全波長酶標儀測定吸光度A1，同時測定1 mL 樣品溶液與4 mL 無水乙醇溶液混合后的吸光度A2，以及1 mL 去離子水與4 mL 的DPPH 自由基溶液混合后的吸光度A3。平行3 次取平均值。按照以下公式計算樣品對DPPH 自由基清除率（X，%）。

X=[1 - (A1-A2)/A3]× 100

1.3.2.2 羥基自由基清除能力的測定

參考Ren 等[12]的測定羥基自由基清除能力的方法，并作適當修改。分別取1 mL 海參凍干粉溶液、2 mL的6 mmol/L 亞硫酸鐵溶液、2 mL 的6 mmol/L 水楊酸-乙醇溶液和2 mL 的6 mmol/L 過氧化氫溶液，混合均勻，37 ℃孵育60 min，8 000 r/min 離心5 min。在510 nm下測定吸光度A1，去離子水代替過氧化氫溶液測定其吸光度A2，去離子水代替樣品溶液平行測定其吸光度A3。按照以下公式計算樣品對羥基自由基的清除率（Y，%）。

Y=[1 - (A1-A2)/A3]× 100

1.3.2.3 還原力的測定

參考Li 等[13]的測定方法，稍作修改。取1 mL 海參凍干粉溶液、2.5 mL 的0.2 mol/L 磷酸緩沖液（pH 值為6.6）和2.5 mL 的1% 鐵氰化鉀溶液混合均勻，在50 ℃下恒溫孵育20 min。冷卻至室溫后，加入2.5 mL的10% 三氯乙酸溶液，靜置10 min，然后8 000 r/min離心5 min。取2.5 mL 上清液、2.5 mL 蒸餾水和0.5 mL 0.1%三氯化鐵溶液，反應10 min。待體系顏色由黃色變為藍色，取200 μL 于96 孔板，在700 nm 處測定吸光度，吸光度越高代表還原能力越強。

1.3.3 海參凍干粉對HeLa 細胞的影響

1.3.3.1 細胞培養

采用含10% FBS 和1% 青霉素-鏈霉素溶液的RPMI-1640 培養基，在5% CO2、37 ℃的培養箱中進行HeLa 細胞的培養。

待測海參凍干粉溶液：10.0 mg 海參凍干粉用1 mL DMSO 溶解，再用RPMI-1640 培養基稀釋至0、10、100、1 000、2 000、3 000 μg/mL，最終DMSO 在培養體系中的體積含量需小于0.5%，以避免溶劑毒性。最后，利用微孔濾膜（0.22 μm）除菌，于4 ℃儲存備用。

1.3.3.2 CCK-8 法測定細胞增殖抑制率

在倒置顯微鏡下觀察HeLa 細胞的生長狀態。生長良好的細胞，采用0.25%胰蛋白酶消化液消化，制備細胞懸液。利用培養基調整細胞密度約為5×104個/mL，接種于96 孔板。除空白組外，加入100 μL 細胞懸液，在37 ℃、5%二氧化碳條件下培養24 h，使細胞貼壁生長。第2 天棄去舊的培養基，實驗組和空白組加入100 μL 海參凍干粉溶液，陰性對照組加入100 μL DMSO 溶液，培養24、48 h 和72 h。培養結束后，加入10 μL 的CCK-8 溶液，置于細胞培養箱培養1 h 后，在450 nm 測吸光度，按以下公式計算HeLa 細胞增殖抑制率（Z，%）[14]。

Z=[1 - (A1-A2)/(A3-A2)]× 100

式中：A1為實驗組（含有細胞、培養基、CCK-8 和含DMSO 的待測試樣）吸光度；A2為空白組（只含有培養基、CCK-8 和含DMSO 的待測試樣，無細胞）吸光度；A3為陰性對照組（含有細胞、培養基、CCK-8 和DMSO 溶液，無待測樣品）吸光度。

參考王麗嬌[15]的方法，按以下公式計算半數抑制濃度IC50（H）。

H=Ym-B×[H-(3 -Zm-Zn)/4]

式中：Ym為最大藥物劑量，1 g；B為最大藥物劑量/相鄰劑量；H為細胞增殖抑制率之和，%；Zm為最大細胞增殖抑制率，%；Zn為最小細胞增殖抑制率，%。

1.3.4 動物實驗

C57BL/6 雄性小鼠，實驗動物生產許可證編號SCXK（滬）2017-0005，6～8 周齡，18～22 g，每組6 只，共54 只。小鼠飼養條件為SPF 小鼠維持飼料，室溫控制在20～25 ℃，濕度控制在50%～60%，明暗交替各12 h，自由飲水取食，鼠籠每2 d 換洗1 次。基礎飼料適應環境性喂養7 d。

1.3.5 模型建立、實驗分組及給藥

分別進行抗疲勞和增強免疫力實驗，具體實驗方法如下。

急性疲勞小鼠模型的建立[16]：在正式實驗前3 d，將灌胃30 min 后的小鼠放于40 r/min 的小鼠轉棒式疲勞儀上進行5 min 轉棒實驗，作為實驗前的適應性訓練。在連續灌胃14 d 后測定轉棒時間。對照組：0.3 mL生理鹽水；低劑量組：0.3 mL 生理鹽水+200 mg/kg 海參凍干粉；中劑量組：0.3 mL 生理鹽水+400 mg/kg 海參凍干粉；高劑量組：0.3 mL 生理鹽水+800 mg/kg 海參凍干粉。實驗開始時，小鼠禁水不禁食24 h。所有小鼠常規飼養，每日上午9：00～10：00 按照組別設定連續灌胃14 d，小鼠灌胃深度為3 cm。

免疫缺陷小鼠模型的建立[17]：實驗開始時，小鼠禁水不禁食24 h。除對照組外，其他各組小鼠給予環磷酰胺免疫抑制劑（40 mg/kg），腹腔注射連續5 d，與對照組對比，小鼠的體質量和免疫球蛋白IgG 含量出現顯著差異，即造模成功。此后，所有小鼠常規飼養。每日上午9：00～10：00 按照組別設定連續灌胃20 d。對照組：0.3 mL 生理鹽水；模型組：40 mg/kg 環磷酰胺免疫抑制劑+0.3 mL 生理鹽水；低劑量組：40 mg/kg 環磷酰胺免疫抑制劑+0.3 mL 生理鹽水+200 mg/kg 海參凍干粉；中劑量組：40 mg/kg 環磷酰胺免疫抑制劑+0.3 mL生理鹽水+400 mg/kg 海參凍干粉；高劑量組：40 mg/kg環磷酰胺免疫抑制劑+0.3 mL 生理鹽水+800 mg/kg 海參凍干粉。

1.3.6 抗疲勞實驗相關指標測定

1.3.6.1 小鼠體質量的測定

記錄小鼠初始體質量，每7 d 及處死前，稱重。

1.3.6.2 小鼠轉棒時間的測定

根據文獻[18]的方法，稍作修改。在14 d 結束時，末次灌胃30 min 后，將小鼠置于30 r/min 小鼠轉棒式疲勞儀進行運動耐力測試。記錄各組小鼠在小鼠轉棒式疲勞儀上運動直至因疲勞而從轉棒上跌倒的時段，該時段即為小鼠的運動耐力時間。如果小鼠抓住桿子并隨著翻轉，則認為跌倒。

1.3.6.3 血乳酸含量的測定

根據Xian 等[19]的測定方法，稍作修改。于轉棒實驗前30 min 時對各組小鼠禁食，在小鼠運動前30 min及運動后立即取血。采血后，將血液于4 ℃冰箱靜置1 h，以3 000 r/min 離心30 min，得到血清。采集的血清嚴格按照LA 測試盒說明書操作。

1.3.7 增強免疫力實驗相關指標測定

1.3.7.1 小鼠體質量的測量

記錄小鼠初始體質量，每5 d 及處死前，稱重。

1.3.7.2 IgG 含量的測定

在末次灌胃后，對小鼠進行采血，3 000 r/min 離心30 min，得到血清。采集的血清嚴格按照IgG 測試盒操作。

1.4 數據處理與分析

采用Excel 2019 軟件分析整理數據，數據以平均值±標準差表示，利用SPSS 13.0 軟件進行統計學分析、OriginPro 2023b 進行作圖。P<0.05 被認為有顯著性差異。

2 結果與分析

2.1 海參凍干粉的抗氧化活性分析

DPPH 自由基清除率、羥基自由基清除率和還原力被用于評估海參凍干粉的抗氧化活性潛力，結果如圖1 所示。

圖1 海參凍干粉的DPPH 自由清除率、羥基自由基清除率和還原力Fig.1 DPPH and hydroxyl radical scavenging activities and reducing power of sea cucumber freeze-dried powder

如圖1 所示，隨著海參凍干粉濃度增加，其對DPPH自由基清除能力逐步增強，呈現出濃度依賴性，且IC50為12.46 mg/mL。羥基自由基是活躍的自由基之一，它對周圍的生物分子會造成嚴重損害，容易引起癌癥、衰老等不良影響[20]。隨著海參凍干粉濃度增加，其對羥基自由基清除能力逐步增強，呈現出濃度依賴性，IC50為15.22 mg/mL。抗氧化能力和還原力一般存在正相關關系，抗氧化劑通過自身的還原作用給出電子，自由基接受電子形成穩定的產物，從而阻斷氧化過程的鏈式反應[21]。海參凍干粉給出電子，將體系中的Fe3+還原成Fe2+，給出的電子越多，產生的Fe2+越多，在700 nm處吸光度越大。吸光度隨著海參凍干粉溶液的濃度增加而增加，當濃度為20 mg/mL 時，還原力為0.35，表明海參凍干粉具備抗氧化能力，且具有量效關系。海參凍干粉中含有大量氨基酸，而甘氨酸被認為是具有抗氧化功能的氨基酸殘基，是有效的質子供體，對抗氧化活性有重要影響[22]。Mamelona 等[23]的研究結果表明海參的抗氧化能力與總酚、類黃酮含量存在顯著相關性，表現出了抗氧化潛力。

2.2 海參凍干粉對HeLa 細胞增殖抑制分析

海參凍干粉對HeLa 細胞的影響如圖2和圖3所示。

圖2 HeLa 細胞形態Fig.2 Morphology of HeLa cells

圖3 不同時間對HeLa 細胞增殖抑制率的影響Fig.3 Effect of different treatment time of sea cucumber freezedried powder on the proliferation inhibition rate of HeLa cells

由圖2 可知，HeLa 細胞本身呈現上皮樣細胞形態，形態飽滿，呈現梭形或為多角形，彼此細胞連接緊密。海參凍干粉組，從細胞連接來看，處理后細胞呈現疏松排布的狀態；從形態方面來看，多數細胞膜邊緣皺縮，失去原本上皮樣細胞形態，整體變圓，細胞膜附近出現膜囊的“小泡”。高劑量組中這種現象更為明顯，一部分細胞還出現了內容物外溢。由圖3 可知，海參凍干粉的濃度越高，對HeLa 細胞增殖抑制率越高，呈現出明顯的劑量-效應關系。濃度增至1 000 μg/mL 時，細胞抑制率可達80%，后趨于平緩。海參凍干粉對HeLa細胞干預24、48 h 和72 h 后的半數抑制濃度IC50分別為556.2、536.60 μg/mL 和611.9 μg/mL，沒有體現出明顯的時間-效應關系。因此，海參凍干粉可以有效抑制HeLa 細胞的生長，表明海參凍干粉具備良好的抗腫瘤作用潛力。王婷等[24]的研究結果顯示，通過純化后的海參精多糖組分2 對HeLa 細胞和HepG2 細胞均有良好的抑制效果，當10 mg/mL 時，抑制率分別為80.28%和83.11%。李超峰[25]利用正丁醇提取的刺參加工廢棄液對HeLa 細胞抑制率為12.29%，而海參凍干粉能夠達到80%左右。

2.3 海參凍干粉的抗疲勞生物活性分析

2.3.1 海參凍干粉對小鼠體質量的影響海參凍干粉對小鼠體質量的影響如圖4 所示。

圖4 海參凍干粉對小鼠體質量的影響Fig.4 Effect of sea cucumber freeze-dried powder on the body weights of mice

由圖4 可知，在連續14 d 的實驗中，小鼠的飲食、飲水、毛發、大小便等均沒有異常。小鼠體質量總體為增長趨勢，但增長情況與對照組相比差異不明顯。

2.3.2 海參凍干粉對小鼠運動耐力的影響

轉棒實驗反映小鼠耐力，轉棒時間的長短反映動物抗阻力運動時的疲勞程度。海參凍干粉對小鼠轉棒時間的影響見表1。

表1 海參凍干粉對小鼠轉棒時間的影響Table 1 Effect of sea cucumber freeze-dried powder on the rotarod exercise duration of mice

如表1 所示，低、中、高劑量組與對照組相比，在單位時間30 min 內，小鼠掉落次數逐漸從11 次減少至2 次，平均運動時間從78.89 s 延長至1 540.12 s，最長運動時間由88.53 s 延長至1 800.00 s。因此，表明海參凍干粉能夠提高小鼠的運動耐力。

2.3.3 海參凍干粉對小鼠血清中LA 含量的影響

在人類或動物中，劇烈或過度的運動可能導致細胞從需氧呼吸轉變為厭氧發酵。這種情況下，會產生大量的乳酸，當活性氧水平、內pH 值和滲透壓不平衡時，會出現疲勞狀態[26]。因此，LA 含量與疲勞程度相關。海參凍干粉對小鼠LA 含量的影響見圖5。

圖5 海參凍干粉對小鼠LA 含量的影響Fig.5 Effects of sea cucumber freeze-dried powder on the lactic acid（LA）content in mice

如圖5 所示，運動后，對照組LA 含量明顯上升，說明轉棒運動能夠使小鼠體內的葡萄糖經過無氧酵解產生LA，導致LA 不能快速分解而被大量堆積，出現肌肉酸痛狀態，使小鼠出現運動疲勞狀態[27]。在轉棒運動前，低、中、高劑量組與對照組（43.23 mmol/L）相比，LA 含量顯著減少（P<0.05），分別為25.17、13.74、12.27 mmol/L。而運動后，低、中、高劑量組的LA 含量比對照組（74.00 mmol/L）差距加大，分別為34.96、22.02、19.15 mmol/L。因此，海參凍干粉通過提高小鼠體內的有氧代謝能力，增強了小鼠運動負荷的適應能力，發揮了抗疲勞功能活性[28]。王敏等[29]通過負重游泳實驗結果評估得出海參復合物具有較好的緩解疲勞作用。Wang 等[30]研究結果表明通過調節NRF2 和AMPK 信號通路顯著改善了氧化應激蛋白相對水平和線粒體功能，海參酶解產物可提高運動耐力，發揮抗疲勞作用。

2.4 海參凍干粉的增強免疫力生物活性分析

2.4.1 海參凍干粉對小鼠體質量的作用

研究表明，長期使用CY 會產生有害副作用，如免疫抑制、骨髓抑制和白細胞減少，因此，CY 常被用于建立小鼠免疫抑制模型[31]。海參凍干粉對小鼠體質量的影響如圖6 所示。

圖6 海參凍干粉對小鼠體質量的影響Fig.6 Effect of sea cucumber freeze-dried powder on the body weights of mice

由圖6 可知，0～5 d 內，除對照組外，均出現明顯的體質量下降現象，說明免疫力低下的小鼠造模成功。經過20 d 灌胃喂養，小鼠體質量緩慢上升。小鼠體質量增長情況與對照組相比存在明顯差異，但是與模型組相比差異不明顯。綜上所述，海參凍干粉可以緩解由CY 導致的體質量下降。

2.4.2 海參凍干粉對小鼠IgG 含量的影響

免疫球蛋白IgG 是血清中最豐富和最持久的抗體，它在單核細胞的吞噬作用機制中起至關重要的作用[32]，健康成年人IgG 含量應在7～18 mg/mL[33]。因此，通過測定IgG 含量可反映小鼠的免疫能力，結果如圖7所示。

圖7 海參凍干粉對小鼠IgG 含量的影響Fig.7 Effect of sea cucumber freeze-dried powder on the IgG content in mice

如圖7 所示，小鼠經過CY 誘導后IgG 含量顯著降低（P<0.05），說明CY 可導致小鼠免疫力下降。小鼠組間差異顯著（P<0.05），同時，和模型組（5.66 mg/mL）相比，海參凍干粉灌胃的小鼠IgG 含量增長明顯，特別是高劑量組可達到11.98 mg/mL，但低于對照組IgG 含量（14.56 mg/mL）。結果表明海參凍干粉在一定程度上可以增強CY 誘導免疫缺陷小鼠的免疫力。楊軍楠等[34]通過RAW 264.7 巨噬細胞免疫活性實驗，發現不同蛋白酶酶解的海參都具有增強免疫調節能力的潛力。樂卿清等[35]利用地塞米松誘導免疫低下小鼠，海參肽在200 mg/kg 和400 mg/kg 均具有提高免疫力的作用，且具有量效關系。

3 結論

以超微粉碎輔助酶解法制備海參凍干粉為切入點，在抗氧化實驗中，DPPH 自由基清除率、羥基自由和還原力均呈現了濃度依賴性。海參凍干粉對HeLa細胞增殖的抑制效果顯著，呈現出明顯的劑量-效應關系（P<0.05）。通過小鼠轉棒及血乳酸含量實驗，小鼠的轉棒運動時間明顯延長，血乳酸含量降低。利用CY誘導的免疫缺陷小鼠實驗，海參凍干粉可緩解CY 造成的體質量下降，小鼠IgG 含量增長明顯。綜上，海參凍干粉具有抗氧化能力、抗腫瘤、抗疲勞和增強免疫力的多功能活性潛力，且具有量效關系。這為進一步深入研究其生物學活性、藥理學特性以及安全性提供了基礎。未來，可以聚焦于探索海參凍干粉中活性成分的作用機制，深化對其與其他治療方法的聯合應用的效果以及拓展其在醫學和保健領域的應用前景。