基于頂空-氣相色譜-四極桿/飛行時間質譜及相對氣味活度值分析潮汕橄欖菜風味物質組成

王健霞，劉袆帆，徐玉娟*，馬路凱，3*，肖更生

（1.農業農村部嶺南特色食品綠色加工與智能制造重點試驗室，仲愷農業工程學院輕工食品學院，廣東 廣州 510631；2.廣東省農業科學院蠶業與農產品加工研究所，廣東 廣州 510610；3.西藏自治區農牧科學院 農產品開發與食品科學研究所，西藏 拉薩 850000）

橄欖菜（olive vegetable）是以橄欖果和芥菜為原料，經腌制得到有特殊鮮味和香味的醬菜[1]，富含多種營養成分、維生素及人體必需的鈣、碘、鐵鋅等元素，是嶺南潮汕地區特色代表性產品之一，其因特殊風味深受消費者喜愛。根據SB/T 10297—1999《醬腌菜分類》，橄欖菜屬于醬腌菜，醬腌菜原料的來源、用量、腌漬時間、溫度等均有嚴格要求。2007 年商務部頒布了SB/T 10439—2007《醬腌菜》，對醬腌菜制定了商業標準。

腌制蔬菜香味成分豐富，其風味的優劣不僅關乎其品質，還會直接影響其消費市場。目前的研究主要集中在泡菜、酸菜、雪菜、大頭菜等醬腌菜的風味方面，Xiao 等[2]采用氣質聯用儀（gas chromatography-mass spectrometry，GC-MS）對江西腌菜、四川泡菜、東北酸菜揮發性化合物進行探究，得出四川泡菜的主要風味化合物為異普勒醇和芳樟醇，江西腌菜中的主要揮發性化合物是二甲基二硫化物、2，4-二甲基噻唑、4-乙基-5-甲基噻唑和3-甲基-1，2-噻唑，在東北酸菜中，壬酸乙酯、2-甲基戊酸乙酯和二硫化二甲酯為主要揮發性化合物。Zhang 等[3]采用GC-MS 對雪菜中的揮發性物質進行探究得出，異硫氰酸烯丙基酯、乙酸乙酯、3-丁腈、苯酚、乙醇和3-（2，6，6-三甲基-1-環己烯-1-基）丙烯醛是雪菜傳統和現代發酵的主要風味化合物；Luo 等[4]采用GC-MS 對小姜泡菜的揮發性化合物進行分析，發現小姜泡菜中相對含量最高的香氣成分是醋酸香葉酯；張鈺麟等[5]采用GC-MS 對不同溫度腌制大頭菜的風味物質進行研究，并結合相對氣味活度值（relative odor activity values，ROAV）法對主要風味物質進行鑒定，結果表明大頭菜在低溫腌制下的風味物質主要是醇類、酯類、烯類和腈類，其中1-辛烯-3 醇、苯乙醇、2-苯基乙基異硫代氰酸酯、桉葉油醇、苯代丙腈為特征性的風味物質。Yun 等[6]采用GC-MS 對四川、重慶商業泡菜和接種泡菜揮發性化合物進行探究，發現乙酸香葉酯、二甲基三硫醚、桉葉油醇和芳樟醇是影響自然發酵泡菜風味特征的主要化合物，二甲基三硫化物，二甲基二硫化物是接種泡菜的氣味貢獻者。以上研究均表明傳統醬菜風味物質組成較為復雜，且受加工工藝影響，對醬菜風味解析可有效保證其品質。目前對橄欖菜風味的研究較少，關于潮汕地區特色醬菜橄欖菜的風味物質組成，以及其關鍵的風味物質尚缺乏系統研究。

氣相色譜-四極桿/飛行時間質譜（gas chromatography-quadrupole-time of flight-mass spectrometry，GCQTOF/MS）分辨率高，靈敏性好，并且以圖譜進行檢索能夠推測化合物的裂解規律，比單純的串聯質譜結果更加準確可靠，可以通過化合物的裂解規律進行結構鑒定。本研究通過頂空-氣相色譜-四極桿/飛行時間質譜結合ROVA 法及感官評價，對潮汕橄欖菜的風味物質組成進行定性分析，并對其關鍵風味物質進行解析，以期為潮汕橄欖菜的品質分析提供一定的理論基礎。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

橄欖菜：廣東蓬盛味業有限公司。

氫氧化鈉（分析純）：天津市科密歐化學試劑有限公司；鹽酸、無水乙醚（均為分析純）：廣東廣試試劑科技有限公司；乙醇（分析純）、石油醚（分析純，沸程30～60 ℃）、乙腈（色譜純）：天津市富宇精細化工有限供公司；碘、碘化鉀、乙酸鋅、亞鐵氰化鉀、硝酸銀、鉻酸鉀（均為分析純）：天津市福晨化學試劑廠。

1.2 儀器與設備

7697-7890B-7200 頂空-氣相色譜-四極桿/飛行時間質譜儀、DB-624 色譜柱（30 m×250 μm，1.4 μm）：美國Agilent 公司；BSA423S-CW 電子天平（感量1 mg）：德國賽多利斯公司；HWS-24 電熱恒溫水浴鍋、BPG-9156A 鼓風干燥箱：上海一恒科學儀器有限公司；DL-400B 智能超聲波清洗器：上海之信儀器有限公司；DF-101S 磁力攪拌器：上海力辰邦西儀器科技有限公司；JB-1042 低速離心機：安徽嘉文儀器裝備有限公司；CBM-20A 高效液相色譜儀：日本島津公司。

1.3 方法

1.3.1 樣品處理

將同一批次的橄欖菜混勻，-80 ℃儲藏，待測。

1.3.2 理化指標測定

參考GB 5009.3—2016《食品安全國家標準食品中水分的測定》第一法測定樣品的水分含量；參考GB 5009.6—2016《食品安全國家標準食品中脂肪的測定》第二法測定樣品的脂肪含量；參照GB 5009.8—2016《食品安全國家標準食品中果糖、葡萄糖、蔗糖、麥芽糖、乳糖的測定》第一法測定樣品的糖分含量；參照GB 5009.42—2016《食品安全國家標準食鹽指標的測定》第一法測定樣品的食鹽含量。

1.3.3 定性分析

1.3.3.1 樣品前處理

精密稱取橄欖菜樣品5.0 g，置于20 mL 頂空瓶中，密封后置于樣品盤上。根據頂空進樣條件（樣品瓶加熱溫度120 ℃，定量環溫度130 ℃，傳輸線溫度140 ℃，平衡時間30 min）進行分析。

1.3.3.2 GC-QTOF/MS 條件

GC 條件：DB-624 色譜柱（30 m×250 μm，1.4 μm）；載氣為氦氣；傳輸線溫度280 ℃。進樣量1 μL，進樣口260 ℃，分流進樣，分流比20∶1，流速1.2 mL/min；色譜柱初始溫度40 ℃，保持3 min，以5 ℃/min 升溫到120 ℃，然后以15 ℃/min 升溫到260 ℃保持5 min。

QTOF/MS 條件：掃描方式為Scan 模式，掃描范圍m/z 35～800，采集頻率500 ms；電離方式為電子轟擊離子源（electron ionization，EI），電子能量70 eV；離子源溫度230 ℃。

1.3.4 定量分析

采用DB-624 色譜柱（30 m×250 μm，1.4 μm），通過NIST 14 數據庫進行化合物檢索并鑒別，以組分面積為依據，采用面積歸一化方法進行定量分析。

1.3.5 關鍵風味物質的評價

參照Zhu 等[7]的方法，根據ROAV 值來確定關鍵揮發性物質對橄欖菜風味的影響，樣品風味貢獻程度最大的物質的ROAV 為100，樣品中其他風味物質的ROAV（W）可通過下列公式計算。

式中：Ca、Cmax分別為不同揮發性成分的相對含量和樣品風味貢獻程度最大的揮發性物質相對含量，%；Tmax、Ta分別為對樣品風味貢獻程度最大的揮發性物質感官閾值和各揮發性成分的感官閾值，mg/kg。

對于所有的風味物質，0≤ROAV≤100。0.1≤ROAV<1，說明對樣品的風味起修飾作用；ROAV≥1 時，說明這種物質為樣品的關鍵風味物質，ROAV 越大，則說明該揮發性物質對樣品風味貢獻越大。

1.3.6 感官評價

挑選10 名食品專業人員（男女各半）組成感官評價小組，分別從滋味、氣味、色澤和質地4 個方面對橄欖菜進行評分（10 分制）。感官評價標準如表1 所示。

表1 感官評價標準Table 1 Sensory evaluation criteria

1.4 數據處理

每個試驗3 次，結果為平均值±標準差，采用Excel 2010 分析試驗數據平均值和標準差，運用Origin 2019 作圖。

2 結果與分析

2.1 橄欖菜中理化指標結果

橄欖菜中的成分較為復雜，通過對其水分、食鹽、脂肪、糖分檢測，結果顯示每100 g 橄欖菜中含水分（2.33±0.05）g、食鹽（3.10±0.08）%、脂肪（45.40±0.29）g、糖分（0.17±0.02）g。根據SB/T 10297—1999《醬腌菜的分類》可知橄欖菜屬醬油漬菜類，橄欖菜樣品中的水分和食鹽含量均符合SB/T 10439—2007《醬腌菜》規定的理化指標。糖分的含量較少可能原因是蔬菜本身含有的糖分經過加工而析出。橄欖菜中的脂肪含量很大，據相關文獻報道食用植物油含有多種揮發性物質對食品的風味的影響也很大，油脂是橄欖菜的主要風味物質之一[8]。

2.2 橄欖菜揮發性成分組成

橄欖菜因其特殊的香氣，增加消費者的食欲。對橄欖菜的揮發性物質組成進行分析，結果如表2 所示。進一步可視化分析結果如圖1 所示。

圖1 橄欖菜揮發性物質種類三維扇形圖（匹配因子≥80%）Fig.1 Three-dimensional fan chart of volatile substances of olive vegetable（matching factor≥80%）

由表2 可知，橄欖菜中共檢出匹配度大于80%的揮發性風味物質44 種，其中醇類物質6 種、烷類物質6 種、醛類物質4 種、酯類物質4 種、酸類物質3 種、酮類物質2 種、雜環類物質7 種，硫化物4 種，其他物質8 種。

橄欖菜眾多的揮發性物質中，醇類物質（28.06%）含量最高，其次是醛類（23.34%）和酸類（15.24%）物質。在醇類物質中環丙基甲基甲醇（26.93%）含量最高，在醛類物質中，丙醛（23.07%）的含量最高，在酸類物質中乙酸（14.99%）的含量最高。由此可判斷橄欖菜中主要的揮發性物質成分為環丙基甲基甲醇、丙醛（腥味、青草味）、乙酸（酸香）。

橄欖菜中醇類物質中環丙基甲基甲醇含量較多，占比26.93%。其主要是由于溴甲烷經過一系列的反應生成二溴甲烷，二溴甲烷與丁烯酮經過化學反應產生大量的環丙基甲基甲醇。橄欖菜在發酵過程中含有大量微生物，據相關報道，芥菜在發酵過程中醇類物質的增加除了與微生物的次生代謝物有關，還可能是由酯化、氧化和微生物在芥菜葉發酵過程中產生的次生代謝物引起[18]。

經研究發現，橄欖菜中醛類物質產生與脂肪氧化有關，不飽和脂類氧化產生的醛類物質是油脂分為的主要來源，且主要為己醛和丙醛，橄欖菜中油脂含量豐富，油脂經過脂肪氧化產生多種醛類物質，例如亞麻酸經過氧化生成丙醛，呈現出腥味和青草味[15]。此外，蔬菜在加工過程中細胞發生破損，醛類物質得以釋放；發酵過程中也會生成醛類等新的揮發性物質[19]。

橄欖菜中酸類物質中乙酸含量較高，占比14.99%。這是與橄欖菜加工過程所使用的油脂中所含有的酸類呈香物質較多有關，Ivanova-Petropulos 等[20]研究發現，菜籽油、葵花籽油、芝麻油、南瓜籽油中含有大量的乙酸。與本文結果一致。

雜環類化合物也是一類重要的香氣成分，橄欖菜中也含有少量的該類物質，包括吡嗪類和呋喃類物質。這兩類物質主要與非酶促的美拉德反應有關。其中吡嗪類物質是由兩個具有α-氨基羰基結構的化合物經縮合反應，在生成二氫吡嗪后發生自動氧化而產生，在較低濃度下呈現烤堅果香味[21]；呋喃類物質經過脂質過氧化、碳水化合物降解和美拉德反應形成。例如，2-戊基呋喃在橄欖油、亞麻籽油、核桃油、葵花籽油和菜籽油等多種植物油中被檢測出[22]。該物質通過亞油酸中的9-羥基自由基與氧氣反應生成過氧化氫乙烯基，通過烷氧基環化反應使含有這類物質的食品呈現出濃郁的香甜味。

2.3 關鍵風味物質的ROAV 分析

通過查閱《化合物香味閾值匯編》[23]得到橄欖菜揮發性風味物質的感官閾值，橄欖菜每種揮發性風味物質ROAV 見表3。

表3 橄欖菜揮發性物質相對氣味活度值Table 3 Relative odor activity value（ROAV）of volatile substances in olive vegetable

由表3 可知，乙硫醇（ROAV 為100）對其風味的貢獻值最大。ROAV≥1 的關鍵揮發性物質成分為乙硫醇、甲硫醇，0.1≤ROAV<1 的揮發性物質為正丙醛，對橄欖菜風味起修飾作用。

乙硫醇和甲硫醇是由橄欖菜中含有硫化物經過發酵反應生成；通過表2 可知，橄欖菜中含有氧硫化碳、二硫化碳、二甲基三硫等揮發性成分，氧硫化碳遇橄欖菜中的水分后，可生成具有洋蔥、橡膠的味道的乙硫醇，乙硫醇在水中的閾值較低，對風味貢獻較大，因此賦予橄欖菜特殊風味。而二硫化碳和二甲基三硫經過一系列的化學反應會生成具有熏菜味的甲硫醇。有研究發現蘿卜泡菜的特征風味物質也是二甲基三硫，且芳樟醇、辛酸乙酯等香氣物質對蘿卜泡菜的香氣喜好度和整體喜好度貢獻較大[24]，與本文結果相似。李從聰[25]在探究腌制油菜苔風味特征中也發現二甲基三硫是腌制油菜苔的關鍵風味物質。橄欖菜中的成分復雜，因二甲基三硫轉化成甲硫醇的閾值比其自身的閾值更低，因而對橄欖菜的風味貢獻較大。

對橄欖菜風味起修飾作用的丙醛除了因脂肪氧化和美拉德反應產生外，還可能是橄欖菜中添加的大蒜等物質，在加工過程中受到破壞，異蒜氨與酶相互反應生成的硫代醋酸S-甲酯在與蒜氨酸酶和催淚因子合成酶相互反應生成丙醛[26]。橄欖菜中脂肪含有一定量的油脂，油脂中的不飽和脂肪酸（亞油酸和n-3 型脂肪酸）發生氧化分解，生成一定量的丙醛[27]。

2.4 感官評價結果

橄欖菜感官評價結果如表4 所示。

從表4 中可以看出，新制作出的橄欖菜色澤烏艷誘人，質地均勻細膩，油香濃郁，鮮咸可口。由于制作出來的橄欖菜中油脂的氣味、配料的香味的結合使橄欖菜呈現出這樣的特點。

橄欖菜感官評價雷達圖見圖2。

圖2 橄欖菜感官評價雷達圖Fig.2 Sensory evaluation radar map of olive vegetable

由圖2 可知，在橄欖菜感官評價中，橄欖菜整體評分較高，滋味、氣味、色澤、質地較好，深受評價人員喜愛。結合表4 可以看出，色澤和質地評價高于滋味和氣味，這表明新制作的橄欖菜客觀狀態得到消費者的認可，橄欖菜中油脂、配料、及橄欖菜本身會發出的香氣及制作手法因每個人的喜愛程度不同而產生差異。

3 結論

本研究采用HS-GC-QTOF/MS 對潮汕橄欖菜風味物質的組成進行探究，結合ROAV 法對橄欖菜的關鍵風味物質進行分析，發現橄欖菜中共檢出酸類、醇類、烷類、醛類、酯類等揮發性風味物質44 種（匹配度大于80%），其中醇類物質6 種、烷類物質6 種、醛類物質4 種、酯類物質4 種、酸類物質3 種、酮類物質2 種、雜環類物質7 種，硫化物4 種，其他物質8 種。主要揮發性物質為環丙基甲基甲醇、丙醛、乙酸，其關鍵風味物質（ROAV≥0.1）為乙硫醇、甲硫醇、丙醛。本研究為橄欖菜主要揮發性物質分析提供了理論依據，為潮汕橄欖菜產業的發展提供了一定的理論支撐。