HPLC法測定參苓白術散中三種成分的含量

劉旭明 辛蕊華 仇正英 李錦宇 劉 蓮 王貴波

中國農業科學院蘭州畜牧與獸藥研究所/甘肅省中獸藥工程技術研究中心，甘肅 蘭州 730050

參苓白術散，出自《太平惠民和劑局方》[1]。由人參、茯苓、炒白術、甘草、山藥、炒白扁豆、蓮子、炒薏苡仁、砂仁、桔梗等十味中藥粉碎混合，過篩制得，具有益氣、健脾、止瀉的功效[2]。該處方中人參、茯苓、炒白術為君藥，山藥、炒白扁豆、蓮子、炒薏苡仁為臣藥，砂仁為佐藥，桔梗、甘草為使藥，可用于脾虛濕盛型泄瀉、脾虛濕阻型腹瀉、肺脾氣虛證慢性鼻竇炎、慢性阻塞性肺疾病穩定期等的治療[3-7]。處方中白術有“健脾補氣第一要藥”之稱，主要有效成分是倍半萜類，包括蒼術酮、白術內酯Ⅰ等，具有抗炎、抗衰老、抗腫瘤等功效[8-9]。甘草苷作為甘草的主要活性成分之一，具有抗炎、抗胃潰瘍活性等功效[10]。目前中華人民共和國藥典和獸藥典對于參苓白術散的質量標準，僅記載薄層色譜法定性鑒別，未見收載相關成分含量測定項；已有的研究主要應用HPLC法等對參苓白術散中人參的主要成分人參皂苷Rg1、人參皂苷Re和人參皂苷Rb1、甘草的主要成分槲皮素和蘆丁、白術的主要成分白術內酯Ⅲ、砂仁的主要成分樟腦、龍腦和乙酸龍腦酯進行了含量測定[15-18]，而對其中的蒼術酮、白術內酯Ⅰ和甘草苷的含量研究鮮有報道；且市面上白術與甘草的質量差異很大[11-12]。本試驗將其為切入點，用HPLC法定量測定參苓白術散中蒼術酮、白術內酯Ⅰ和甘草苷的含量，以期為參苓白術散中蒼術酮、白術內酯Ⅰ和甘草苷含量測定法的確立及今后藥典和獸藥典制訂相關質量標準提供依據。

1 儀器與材料

1.1 儀器 Waters e2695高效液相色譜儀(美國 Waters 公司)；AP-01P真空泵(天津奧特賽恩斯儀器有限公司)；C18色譜柱(5 μm，4.6 mm×250 mm，美國Agilient公司)；多功能粉碎機(永康市紅太陽機電有限公司)。

1.2 材料 蒼術酮標準品(CAS#6989-21-5，95%)、白術內酯Ⅰ標準品(CAS#73069-13-3，98%)均購自上海源葉生物科技有限公司，甘草苷標準品(111610-201908，95%)購自中國食品藥品檢定研究院，色譜純乙腈、甲醇均購自賽默飛；分析純磷酸購自天津市科密歐化學試劑有限公司；95%乙醇購自國藥集團化學試劑有限公司。試驗所用藥材全部購自蘭州安泰堂中藥飲片有限公司，經中國農業科學院蘭州畜牧與獸藥研究所質量檢測均合格。

2 方法與結果

2.1 蒼術酮和白術內酯Ⅰ含量測定

2.1.1 溶液配制

2.1.1.1 標準品溶液配制 精密稱取一定量蒼術酮和白術內酯Ⅰ標準品粉末于5 mL容量瓶，加甲醇溶解并定容，配制成濃度為0.1 mg/mL的標準品溶液。

2.1.1.2 供試品溶液制備[8]稱取參苓白術散粉末2.0 g，加入20 mL甲醇，密塞，稱重，超聲處理(功率250 W，頻率50 Hz)30 min，放冷，再次稱定重量，用甲醇補足缺失的重量，搖勻后過濾，濾液用0.45 μm濾膜濾過即得供試品溶液。

2.1.1.3 陰性對照溶液制備 去除方劑中的白術，按2.1.1.2方法制備陰性對照溶液。

2.1.2 色譜條件[8]C18色譜柱(5 μm，4.6 mm×250 mm)；流動相A為乙腈，流動相B為水，梯度洗脫程序見表1，柱溫 25 ℃；蒼術酮檢測波長220 nm，白術內酯Ⅰ檢測波長276 nm；流速1.0 mL/min；進樣量10 μL。

表1 梯度洗脫程序

2.1.3 專屬性試驗 精密吸取蒼術酮、白術內酯Ⅰ標準品溶液、陰性對照溶液、供試品溶液，按2.1.2色譜條件進行檢測，記錄色譜圖，分析數據。結果如圖1～6所示，參苓白術散供試品溶液和蒼術酮標準品、白術內酯Ⅰ標準品在相同時間出現色譜峰，陰性對照無干擾，說明該方法專屬性良好。

圖1 參苓白術散中蒼術酮HPLC圖

圖2 參苓白術散中白術內酯Ⅰ HPLC圖

圖3 蒼術酮標準品HPLC圖

圖4 白術內酯Ⅰ標準品HPLC圖

圖5 蒼術酮陰性對照HPLC圖

圖6 白術內酯Ⅰ陰性對照HPLC圖

2.1.4 線性關系考察 將2.1.1.1中蒼術酮標準品溶液稀釋至濃度為0.1308 mg/mL、0.0654 mg/mL、0.0327 mg/mL、0.0164 mg/mL、0.0082 mg/mL，白術內酯Ⅰ標準品溶液稀釋至濃度為0.0256 mg/mL、0.0128 mg/mL、0.0064 mg/mL、0.0032 mg/mL、0.0016 mg/mL。按2.1.2色譜條件進行檢測，記錄色譜圖，分析數據。以峰面積為縱坐標，標準品濃度為橫坐標，繪制標準曲線，計算回歸方程及相關系數。結果如圖7、圖8所示，蒼術酮的回歸方程為y=10000000X+62991，R2=0.9991；白術內酯Ⅰ的回歸方程為y=60000000X-8055.9，R2=0.9997。說明蒼術酮在0.0082～0.1308 mg/mL濃度范圍內線性關系良好，白術內酯Ⅰ在0.0016～0.0256 mg/mL濃度范圍內線性關系良好。

圖7 蒼術酮標準曲線圖 圖8 白術內酯Ⅰ標準曲線圖

2.1.5 精密度試驗 精密吸取2.1.1.1項下標準品溶液，按2.1.2色譜條件進行檢測，連續進樣6次，記錄色譜圖，分析數據。計算出蒼術酮、白術內酯Ⅰ的峰面積RSD值分別為0.3%、0.2%(n=6)，表明儀器精密度良好。

2.1.6 重復性試驗 精密稱定同一批樣品6份，每份2.0 g，按2.1.1.2方法制備供試液，按2.1.2色譜條件進行檢測，記錄色譜圖，分析數據。計算出蒼術酮、白術內酯Ⅰ含量的RSD值分別為1.5%、0.5%(n=6)，表明該方法重復性良好。

2.1.7 穩定性試驗 精密吸取2.1.1.2項下供試品溶液，按2.1.2色譜條件分別于0 h、4 h、8 h、12 h、24 h進行檢測，記錄色譜圖，分析數據。計算出蒼術酮、白術內酯Ⅰ含量的RSD值分別為0.7%、1.3%，表明蒼術酮、白術內酯Ⅰ在24 h內穩定性良好。

2.1.8 加樣回收率試驗 精密稱定1g已知含量樣品6份，精密加入濃度為0.327 mg/mL蒼術酮標準品溶液1 mL，濃度為0.064 mg/mL白術內酯Ⅰ標準品溶液1 mL，按2.1.1.2方法制備供試液，按2.1.2色譜條件進行檢測，記錄色譜圖，分析數據，計算回收率。結果見表2，蒼術酮和白術內酯Ⅰ平均加樣回收率分別為97.8%、103.4%，RSD值分別為0.7%、1.8%(n=6)。

表2 加樣回收率測定

2.2 甘草苷含量測定

2.2.1 溶液配制

2.2.1.1 標準品溶液配制 精密稱取一定量的甘草苷標準品粉末于5 mL容量瓶，加70%乙醇溶解并定容，配制成含甘草苷濃度為0.2 mg/mL的標準品溶液。

2.2.1.2 供試品溶液制備[13]精密稱取參苓白術散粉末2.0 g，加入70%乙醇20 mL，密塞，稱重，超聲處理(功率250 W，頻率40 kHz)30 min，放冷，再次稱定重量，用70%乙醇補足缺失的重量，搖勻后過濾，濾液用0.45 μm濾膜濾過即得供試品溶液。

2.2.1.3 陰性對照溶液制備 去除方劑中甘草，按2.2.1.2方法制備陰性對照溶液。

2.2.2色譜條件[13]C18色譜柱(5 μm，4.6 mm×250 mm)；流動相A為乙腈，流動相B為0.05%磷酸溶液，梯度洗脫程序見表3；柱溫30 ℃；檢測波長237 nm；流速1.0 mL/min；進樣量10 μL。

表3 梯度洗脫程序

2.2.3 專屬性試驗 精密吸取甘草苷標準品溶液、陰性對照溶液、供試品溶液，按2.2.2色譜條件進行檢測，記錄色譜圖，分析數據。結果如圖9～11所示，參苓白術散供試品溶液和甘草苷標準品在相同時間出現色譜峰，陰性對照無干擾，說明該方法專屬性良好。

圖9 參苓白術散HPLC圖

圖10 甘草苷標準品HPLC圖

圖11 陰性對照溶液HPLC圖

2.2.4 線性關系考察 精密吸取2.2.1.1項下甘草苷標準品溶液稀釋至濃度為0.2444 mg/mL、0.1222 mg/mL、0.0611 mg/mL、0.0306 mg/mL、0.0153 mg/mL，按2.2.2色譜條件進行檢測，記錄色譜圖，分析數據。以峰面積為縱坐標，標準品濃度為橫坐標，繪制標準曲線，計算回歸方程及相關系數。結果如圖12所示，甘草苷的回歸方程為y=10000000X+16664，R2=0.9994，說明甘草苷在0.0153 ～0.2444 mg/mL濃度范圍內線性關系良好。

圖12 甘草苷標準曲線圖

2.2.5 精密度試驗 精密吸取2.2.1.1項下標準品溶液，按2.2.2色譜條件進行檢測，連續進樣6次，記錄色譜圖，分析數據。計算出甘草苷峰面積RSD值為0.9%(n=6)，說明儀器精密度良好。

2.2.6 重復性試驗 精密稱定同一批樣品6份，每份2.0 g，按2.2.1.2方法制備供試品溶液，按2.2.2色譜條件進行檢測，記錄色譜圖，分析數據。計算出甘草苷含量的RSD值為1.3%(n=6)，表明該方法重復性良好。

2.2.7 穩定性試驗 精密量取2.2.1.2項下供試品溶液，分別于0 h、4 h、8 h、12 h、24 h按2.2.2色譜條件進行檢測，記錄色譜圖，分析數據。計算出甘草苷含量的RSD值為1.8%，說明甘草苷在24 h內穩定性良好。

2.2.8 加樣回收率試驗 精密稱取0.5g已知含量樣品6份，精密加入濃度為0.306 mg/mL甘草苷標準品溶液1 mL，按2.2.1.2方法制備供試品溶液，按2.2.2色譜條件進行檢測，記錄色譜圖，分析數據。結果見表4，甘草苷平均加樣回收率為104.2%，RSD值為0.5%(n=6)。

表4 加樣回收率測定

2.3 樣品含量測定 分別取3批購自蘭州安泰堂中藥飲片有限公司的中藥飲片，按照藥典要求粉碎成細粉，過篩，混勻。取各批參苓白術散各約2.0 g，分別進樣測定，計算制劑中蒼術酮、白術內酯Ⅰ和甘草苷的含量。結果見表5。

表5 三批參苓白術散中蒼術酮、白術內酯I和甘草苷的含量

3 討論

HPLC法具有靈敏度高，方便快速等特點，現已被廣泛運用于中藥成分鑒別、含量測定等方面[14]。在參苓白術散的研究中，多數研究者利用HPLC法僅對人參皂苷Rg1、Re及Rb1進行定量分析[1，15]，個別學者應用HPLC、UPLC和氣相色譜法對甘草黃酮和人參皂苷等進行了定量分析[16-18]，而對蒼術酮、白術內酯Ⅰ和甘草苷的研究較少。

在對白術含量測定時，按照丁逸雪等[8]構建的色譜條件檢測時所呈現的峰形對稱、分離效果良好，因此直接選用該色譜條件分別考察了100%甲醇溶液、100%乙醇溶液兩種溶劑的提取效果，結果發現，100%甲醇溶液作為溶劑時，檢測到待測成份的含量較高，雜峰較少。此外，也考察了超聲提取時間(20 min、30 min、40 min)對待測成份的影響，結果表明樣品在100%甲醇溶液中超聲處理30 min時，待測成份已提取完全，該方法在操作上簡單易行。

在對甘草苷含量測定時，參考《中華人民共和國獸藥典》甘草項檢測方法色譜條件及樣品處理方法，對流動相比例稍作調整用以檢測樣品，結果顯示峰形對稱、分離效果良好。在樣品制備方面，本試驗所用方法相對于靳雪飛構建的供試品溶液制備方法簡單易行，大大節約了時間成本[19]。以改良后的色譜條件考察了70%乙醇溶液、100%乙醇溶液作為溶劑的提取效果，結果表明，70%乙醇溶液作為溶劑時，檢測到待測成份的含量較高，雜峰較少；另外也考察了乙腈-0.1%磷酸溶液、乙腈-0.05%磷酸溶液流動相體系洗脫效果，結果顯示乙腈-0.05%磷酸溶液作為流動相時，甘草苷分離效果較好且峰形對稱。

本研究成功建立了參苓白術散中蒼術酮、白術內酯I和甘草苷的檢測方法，且方法簡單快捷、專屬性強、精密度、重復性良好，將為確立和進一步完善參苓白術散中相關成分的定量分析及質量控制標準提供依據。