巨峰葡萄半乳糖醛酸轉(zhuǎn)移酶基因GAUT克隆及在摘心處理下的表達(dá)分析

李思雨 賴恭梯 賀麗媛 許 恒 林俊璇 郭奧琳 陳桂信 賴呈純，

（1福建農(nóng)林大學(xué)園藝學(xué)院，福建 福州 350002；2福建省農(nóng)業(yè)科學(xué)院農(nóng)產(chǎn)品加工研究所/農(nóng)業(yè)農(nóng)村部亞熱帶特色果蔬菌加工重點(diǎn)實(shí)驗室，福建 福州 350003）

果膠是一類復(fù)雜的細(xì)胞壁多糖，在植物生長發(fā)育的諸多方面具有重要功能［1］。果膠生物合成和修飾酶的不同組合，在不同細(xì)胞類型和不同環(huán)境條件下細(xì)胞壁重塑的可塑性和特異性等方面起著關(guān)鍵作用［2］，可調(diào)節(jié)細(xì)胞生長［3］，從而影響組織器官生長發(fā)育。有研究表明，果膠含量和形態(tài)能影響芍藥莖的直立或彎曲［4］，亞麻莖干果膠含量降低時纖維強(qiáng)度增加［5］，果膠含量豐富的植物葉片吸收水分速度較快［6］，在植物的幼嫩葉片中果膠含量明顯高于衰老葉片［7］，這表明果膠在植物莖、葉生長過程中有重要的調(diào)控作用。半乳糖醛酸轉(zhuǎn)移酶（galacturonosyltransferase，GAUT）是果膠生物合成的關(guān)鍵酶，將半乳糖醛酸轉(zhuǎn)移到果膠多糖上，合成聚半乳糖醛酸（homogalacturonan）。聚半乳糖醛酸屬于糖基轉(zhuǎn)移酶家族8（glycosyltransferases 8，GT8），是一種α-1，4-半乳糖醛酸轉(zhuǎn)移酶（α-1，4-galacturonosyltransferase，GalAT），GAUT表達(dá)變化能夠影響植物果膠積累，從而調(diào)節(jié)植株生長發(fā)育［8］。在擬南芥中過表達(dá)GhGATL2、GhGATL9、GhGATL12和GhGATL15，發(fā)現(xiàn)其果膠含量增加；而在棉花中沉默GhGATL15發(fā)現(xiàn)果膠含量減少，并引起表型差異［9］。Fan 等［10］發(fā)現(xiàn)GAUTs可能影響棉纖維的伸長和增厚，Orfila 等［11］發(fā)現(xiàn)擬南芥qua1-1突變體花序莖中半乳糖醛酸轉(zhuǎn)移酶的活性下降。由此可見，GAUTs影響果膠生物合成，在植物莖和葉等組織器官生長發(fā)育中起著重要作用。

葡萄（Vitisvinifera）屬于木質(zhì)藤本果樹，是我國五大水果之一，在我國廣泛栽培。葡萄莖和葉片對植株生長和物質(zhì)運(yùn)輸有重要作用，在自然狀態(tài)下，葡萄主梢和副梢無差別生長，會導(dǎo)致營養(yǎng)生長與生殖生長不平衡。摘心處理是葡萄控產(chǎn)提質(zhì)的重要栽培措施，可控制葡萄新梢徒長及促進(jìn)分枝形成，并改變營養(yǎng)運(yùn)輸方向，使葡萄樹體的營養(yǎng)更多地由頂端運(yùn)輸?shù)狡渌L點(diǎn)器官［12］。福建省農(nóng)業(yè)科學(xué)院農(nóng)產(chǎn)品加工研究所營養(yǎng)科學(xué)與工程研究室前期發(fā)現(xiàn)，摘心處理能抑制莖增粗和葉片生長［12］，結(jié)合前人研究發(fā)現(xiàn)果膠作為細(xì)胞壁的重要結(jié)構(gòu)組分，參與植物組織和器官生長發(fā)育，推測摘心可能通過調(diào)控果膠合成相關(guān)基因表達(dá)，改變果膠生物合成從而影響莖和葉片的生長。為探究摘心處理下莖和葉片中果膠生物合成的分子機(jī)制，本試驗以巨峰葡萄為材料，進(jìn)行半乳糖醛酸轉(zhuǎn)移酶GAUTs基因的克隆，對基因序列特征及功能進(jìn)行預(yù)測分析，并分析摘心處理下巨峰葡萄莖和葉片中VvGAUTs基因的表達(dá)量變化，以期為深入探究摘心抑制莖增粗與葉片生長的分子機(jī)制提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

以種植于福建省福安市溪柄鎮(zhèn)葡萄示范基地的10 年生巨峰葡萄為試驗材料，樹形為自然傘形，株行距1.5 m×2.6 m，每公頃種植約2 550 株。分別進(jìn)行花序上留2 葉摘心和留6 葉摘心的處理，以不摘心為對照，選取摘心處理后的0、10、20、60 和120 d 的莖和葉片儲存于干冰保溫盒，轉(zhuǎn)運(yùn)至實(shí)驗室立即浸沒于液氮中速凍后于-80 ℃冰箱中保存?zhèn)溆?。葉片及莖段的選取參照文獻(xiàn)［12］，葉片取基部向上第3 葉的葉片，莖段取基部向上第2 至第3 葉節(jié)間莖段，每次隨機(jī)取10 個葉片和10條莖段，設(shè)3次重復(fù)。

1.2 試驗方法

1.2.1 總RNA的提取與cDNA的合成 按照RNAprep Pure 多糖多酚植物總RNA 提取試劑盒（北京天根生化科技有限公司）的操作步驟對巨峰葡萄新芽進(jìn)行總RNA提取?；蚩寺〉腸DNA模板制備采用EasyScript?One-Step gDNA Removal and cDNA Synthesis SuperMixs試劑盒（北京全式金生物技術(shù)股份有限公司）。實(shí)時熒光定量PCR（quantitative real-time PCR，qRT-PCR）的cDNA 模板制備采用Prime ScriptTMRT reagent Kit with gDNA Eraser （Perfect Real Time）試劑盒（大連寶生物工程有限公司）。

1.2.2VvGAUTs基因克隆與序列分析 在NCBI（https：//www.ncbi.nlm.nih.gov/）數(shù)據(jù)庫中檢索獲得1個釀酒葡萄GAUT基因和3 個河岸葡萄GAUT基因，其登錄號分別為XM_002269146.3、XM_034818285.1、XM_002281622.4 和XM_002271260.3，以上述4 個GAUT基因序列為模板設(shè)計克隆引物，引物信息見表1。以巨峰葡萄的cDNA 為模板進(jìn)行PCR 擴(kuò)增。PCR 反應(yīng)體系共50 μL：HS 2× Master Mix 25 μL，上下游引物各1 μL，cDNA 1 μL，ddH2O 補(bǔ)充至50 μL。PCR 擴(kuò)增程序：95 ℃預(yù)變性5 min，95 ℃變性30 s，60 ℃退火30 s，72 ℃延伸1 min，共35 個循環(huán)；72 ℃終延伸5 min，4 ℃保存。PCR 產(chǎn)物經(jīng)過1%瓊脂糖凝膠電泳得到目的條帶，回收目的條帶，連接pLB Vector 載體，轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5α 感受態(tài)細(xì)胞。經(jīng)抗性篩選、PCR 鑒定得到陽性克隆菌液，送至北京擎科生物科技股份有限公司測序，獲得目的條帶序列。利用DNAMAN 6.0軟件對基因序列進(jìn)行分析，使用Ensembl網(wǎng)站（http：//plants.ensembl.org/index.html）下載VvGAUTs基因注釋文件，用TBtools v1.116軟件進(jìn)行基因結(jié)構(gòu)繪制。

表1 引物信息Table 1 Primer information

1.2.3 VvGAUTs 蛋白理化特性分析 使用Expasy（http：//web.expasy.org/）預(yù)測蛋白序列的分子質(zhì)量、親疏水性和等電點(diǎn)等理化性質(zhì)。利用Plant-mPLoc 網(wǎng)站（http：//www.csbio.sjtu.edu.cn/bioinf/plant-multi/）進(jìn)行蛋白質(zhì)亞細(xì)胞定位預(yù)測。利用HMMER 網(wǎng)站（https：//plants.ensembl.org/hmmer/index.html）進(jìn)行蛋白序列的信號肽預(yù)測。使用MEME 在線軟件（http：//memesuite.org/tools/meme）分析基因編碼蛋白的保守基序。

1.2.4 啟動子順式作用元件預(yù)測 通過NCBI在線網(wǎng)址提取VvGAUTs基因的啟動子區(qū)域序列，利用PlanCARE在線網(wǎng)址（http：//bioinformatics.psb.ugent.be/webtools/plantcare/html/）檢索VvGAUTs基因的順式作用元件，并對其進(jìn)行比較分析。

1.2.5 染色體定位和多物種共線性分析 從Ensembl網(wǎng)站下載葡萄（Vitisvinifera）、擬南芥（Arabidopsis thaliana）、毛果楊（Populustrichocarpa）和水稻（Oryza sativa）的相關(guān)基因組數(shù)據(jù)文件，通過TBtools v1.116 軟件繪制VvGAUTs基因的染色體定位圖以及構(gòu)建其與多物種間的共線性關(guān)系圖譜。

1.2.6 物種間系統(tǒng)發(fā)育分析 用巨峰葡萄VvGAUTs蛋白序列于NCBI在線網(wǎng)站上進(jìn)行比對，獲得VvGAUTs與其他物種同源性大于70%的蛋白序列，使用MEGA 11.0軟件鄰接法（Neighbor-Joining，NJ）構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育進(jìn)化樹，bootstrap值設(shè)為1 000，其他參數(shù)為默認(rèn)值。

1.2.7 蛋白互作網(wǎng)絡(luò)預(yù)測 利用String 在線軟件（https：//cn.string-db.org/）構(gòu)建VvGAUTs 的蛋白互作網(wǎng)絡(luò)模型，設(shè)置置信度為0.4，預(yù)測蛋白個數(shù)少于10個，探究VvGAUTs 與植物細(xì)胞中其他基因的編碼蛋白的互作關(guān)系。

1.2.8 qRT-PCR 分析 以經(jīng)過篩選優(yōu)化的clathrinadaptor complex subunit mu（AP-2）作為巨峰葡萄莖的內(nèi)參基因，SAND family protein（SAND）作為巨峰葡萄葉片的內(nèi)參基因，PCR 擴(kuò)增采用前期研究優(yōu)化后的運(yùn)行參數(shù)［13］，在LightCycler?480Ⅱ 實(shí)時熒光定量PCR 儀（Roche，瑞士）上進(jìn)行，設(shè)3 次重復(fù)試驗。擴(kuò)增結(jié)束后，利用LightCycler?480 Software Version 1.5 進(jìn)行Cp 值（crossing point）和熔解曲線分析，采用2-ΔΔCt法進(jìn)行目的基因表達(dá)水平的計算。測定相關(guān)基因在不同摘心處理下巨峰葡萄莖和葉片中的相對表達(dá)量，目的基因和內(nèi)參基因引物信息見表1。

1.3 數(shù)據(jù)分析

使用Microsoft?Excel 2019 和SPSS 26.0 軟件對數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計分析，用GraphPad Prism 9軟件作圖。

2 結(jié)果與分析

2.1 VvGAUTs基因的克隆與序列分析

以巨峰葡萄cDNA 為模板進(jìn)行PCR 擴(kuò)增，克隆得到4 條VvGAUTs基因序列，與預(yù)估目的片段長度一致（圖1-A），測序結(jié)果與NCBI葡萄基因組數(shù)據(jù)庫相應(yīng)基因片段相似性均達(dá)到98%以上，分別命名為VvGAUT1a（登錄號OQ718918.1）、VvGAUT1b（登錄號OQ718919.1）、VvGAUT3（登錄號OQ718920.1）、VvGAUT4a（登錄號OQ718921.1），開放閱讀框（open reading frame，ORF）序列長度分別為1 056、1 167、1 038 和1 071 bp，分別編碼351、388、345 和356 個氨基酸。與葡萄基因組數(shù)據(jù)庫中相應(yīng)基因的DNA序列對比發(fā)現(xiàn)，VvGAUT1a包含5 個外顯子和4 個內(nèi)含子，VvGAUT1b只有2 個外顯子和1 個內(nèi)含子，VvGAUT3和VvGAUT4a均有3 個外顯子和2個內(nèi)含子（圖1-B）。

圖1 VvGAUTs的PCR擴(kuò)增電泳圖（A）和基因結(jié)構(gòu)（B）Fig.1 PCR amplification electrophoretic diagram（A） and gene structure（B） of VvGAUTs

2.2 VvGAUTs基因編碼蛋白理化特性分析

蛋白質(zhì)理化特性預(yù)測信息見表2，VvGAUT1a、VvGAUT1b、VvGAUT3 和VvGAUT4a 的分子量分別為39.281 9、43.272 3、39.252 3 和40.427 4 kDa，等電點(diǎn)分別為6.16、5.39、9.10和9.05。蛋白質(zhì)的穩(wěn)定性預(yù)測顯示，VvGAUT1a為穩(wěn)定蛋白，VvGAUT1b、VvGAUT3和VvGAUT4a 屬于不穩(wěn)定蛋白。信號肽預(yù)測結(jié)果顯示，VvGAUT1b 無明顯信號肽，而VvGAUT1a、VvGAUT3 和VvGAUT4a 均含信號肽。從亞細(xì)胞定位預(yù)測結(jié)果得知，VvGAUT1a 定位在葉綠體上，VvGAUT1b 定位于細(xì)胞膜、線粒體和細(xì)胞核，VvGAUT3 和VvGAUT4a 均定位于葉綠體與細(xì)胞核。保守基序預(yù)測顯示，VvGAUTs包含相同數(shù)量和類型的Motifs，4 個VvGAUTs 都有8 個保守基序（圖2）。

圖2 VvGAUTs蛋白的基序（A）和基序序列（B）Fig.2 The protein motifs（A） and motif sequences（B） of VvGAUTs

表2 VvGAUTs的蛋白質(zhì)理化特性Table 2 Protein physicochemical properties of VvGAUTs

2.3 VvGAUTs蛋白互作網(wǎng)絡(luò)分析

為了探究VvGAUTs 與其他蛋白在植物體中的聯(lián)合作用機(jī)制，對克隆到的4 個VvGAUTs的編碼蛋白的互作蛋白進(jìn)行了預(yù)測（圖3）。結(jié)果顯示，VvGAUT1a與纖維素合成酶、漆酶和糖基轉(zhuǎn)移酶等蛋白存在相互作用關(guān)系，這些互作蛋白主要參與細(xì)胞壁中纖維素合成、木質(zhì)素降解以及調(diào)節(jié)代謝的速率、方向等生命活動。與VvGAUT1b 存在相互作用的蛋白主要為β-葡萄糖苷酶、UDP-糖基轉(zhuǎn)移酶、組蛋白賴氨酸甲基轉(zhuǎn)移酶、組氨酸激酶和果膠酯酶等蛋白，這些蛋白主要參與糖代謝、植物細(xì)胞分化、葉片衰老調(diào)控和果膠代謝。VvGAUT3、VvGAUT4a 的互作蛋白大多與細(xì)胞信號傳導(dǎo)、細(xì)胞分裂和染色質(zhì)修飾等生物過程有關(guān)。

圖3 VvGAUTs的蛋白互作網(wǎng)絡(luò)Fig.3 Protein-protein interaction network of VvGAUTs

2.4 VvGAUTs系統(tǒng)發(fā)育分析

為探究VvGAUTs與其他物種間的親緣關(guān)系，以4個巨峰葡萄VvGAUTs 為查詢序列，利用NCBI 數(shù)據(jù)庫的Blast 工具進(jìn)行比對分析并下載同源性高于70%的其他物種GAUT 蛋白序列。使用MEGA 軟件構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育進(jìn)化樹（圖4）。結(jié)果顯示，GAUT1蛋白聚為一大類，而GAUT3和GAUT4聚為另一大類，并且GAUT3和GAUT4又分別聚成2個亞類，表明GAUT3和GAUT4蛋白有較近的進(jìn)化關(guān)系。進(jìn)一步分析發(fā)現(xiàn)，巨峰葡萄VvGAUT1a、VvGAUT1b 均與河岸葡萄（Vitisriparia）的GAUT1 親緣關(guān)系最近。VvGAUT3 也與河岸葡萄VrGAUT3 最先聚類合并，表明兩者間親緣關(guān)系最近，其次是與大麻（Cannabissativa）的GAUT3屬于同一分支，親緣關(guān)系較近。VvGAUT4a 與河岸葡萄VrGAUT4 的親緣關(guān)系最近，其次是與罌粟（Papaversomniferum）的GAUT4 表現(xiàn)出較近的親緣關(guān)系。

圖4 VvGUATs和其他物種GUATs系統(tǒng)進(jìn)化樹Fig.4 Phylogenetic tree for VvGUATs and GUATs from some other plant species

2.5 VvGAUTs染色體定位和多物種共線性分析

從Ensembl 在線軟件得到葡萄基因組序列及染色體位置信息，克隆得到的VvGAUTs基因序列均被定位到不同染色體上，分別為染色體4號、18號、1號和7 號（圖5-A）。以葡萄、水稻、擬南芥和毛果楊的基因組數(shù)據(jù)為參考，4個VvGAUTs基因與不同物種的共線分析發(fā)現(xiàn)，VvGAUT1a、VvGAUT1b和VvGAUT4a與其他物種的共線基因為13個，但VvGAUT4a顯示與水稻、擬南芥和毛果楊無共線基因，說明該基因具有物種特異性（圖5-B）。VvGAUT1a和毛果楊有4個共線基因，和擬南芥有1個共線基因。VvGAUT1b與毛果楊有4 個共線基因，與擬南芥有2 個共線基因。VvGAUT3在毛果楊染色體8 號和10號上各有1個共線基因。因此，巨峰葡萄GAUT基因與木本毛果楊的共線性高于草本的水稻和擬南芥。

圖5 VvGAUTs染色體定位（A）和多物種共線性（B）Fig.5 Chromosome localization（A） and multispecies collinearity analysis（B） of VvGAUTs

2.6 VvGAUTs基因的啟動子順式作用元件分析

順式作用元件分析結(jié)果表明，VvGAUTs具有光響應(yīng)、厭氧感應(yīng)、赤霉素響應(yīng)、脫落酸響應(yīng)和茉莉酸甲酯響應(yīng)等多種與植物生長發(fā)育相關(guān)的順式作用元件（圖6）。4個VvGAUTs基因均含有光響應(yīng)的順式作用元件，其中VvGAUT3的光響應(yīng)作用元件個數(shù)最多，而VvGAUT1a和VvGAUT4a的數(shù)量基本相等。VvGAUT1a除了響應(yīng)光的順式作用元件外，還含有較多的激素響應(yīng)、防御和脅迫響應(yīng)與分生組織表達(dá)等作用元件；VvGAUT1b響應(yīng)的順式作用元件類型與VvGAUT1a相似，但VvGAUT1b還含有種子特異性調(diào)節(jié)的順式作用元件；VvGAUT3只響應(yīng)了光、厭氧、赤霉素和脫落酸的順式作用元件；VvGAUT4a響應(yīng)光、干旱、赤霉素、防御和脅迫、分生組織表達(dá)、水楊酸和厭氧感應(yīng)的順式作用元件。

圖6 VvGAUTs的啟動子順式作用元件Fig.6 Identified cis-acting elements in promoters of VvGAUTs

2.7 不同摘心處理下巨峰葡萄GAUTs基因的表達(dá)分析

2.7.1VvGAUTs基因在巨峰葡萄莖中的表達(dá)模式分析 分析VvGAUTs在巨峰葡萄不同摘心處理下莖中的表達(dá)模式，不同生長發(fā)育階段下4 個VvGAUTs基因成員的表達(dá)模式見圖7，2 葉摘心處理下，VvGAUTs基因在莖中的相對表達(dá)量總體低于其他兩種摘心處理。VvGAUT1a在不同處理下的表達(dá)量均呈先升后降的模式，在10 d時均達(dá)到表達(dá)高峰，并且在生長后期處于較低水平，其中摘心處理的表達(dá)模式總體低于不摘心處理。VvGAUT1b和VvGAUT3在不摘心和6 葉摘心下呈先升后降的表達(dá)模式，并在生長后期處于低表達(dá)水平，2 個基因的表達(dá)水平分別于10 和20 d 達(dá)到表達(dá)峰值；而2 葉摘心處理下，VvGAUT1b和VvGAUT3均處于低表達(dá)水平，且低于不摘心和6 葉摘心。VvGAUT4a在2 葉摘心處理和不摘心處理下的表達(dá)模式基本一致，均呈現(xiàn)較低的水平；而在6 葉摘心處理下，其表達(dá)模式在生長前期呈“降-升-降”的趨勢，而在60 d 后呈現(xiàn)出急劇上升的狀態(tài)。總體上，與對照相比，2 葉摘心處理抑制了VvGAUTs基因在莖中的表達(dá)。此外，從葉片生長過程看，VvGAUT1a、VvGAUT1b和VvGAUT3在葉片生長前期表達(dá)水平較高，后期表達(dá)水平較低，而VvGAUT4a呈現(xiàn)相反的趨勢。

圖7 VvGAUTs基因在不同發(fā)育階段時不同摘心處理下莖中的表達(dá)量Fig.7 The expression of VvGAUTs in stems at different developmental stages after pinching

2.7.2VvGAUTs基因在巨峰葡萄葉片中的表達(dá)模式分析 對不同摘心處理后巨峰葡萄葉片中VvGAUTs的表達(dá)量進(jìn)行分析，不同生長發(fā)育階段下4個VvGAUTs基因在葉片中的表達(dá)量差異見圖8。VvGAUT1a在2 葉摘心處理下的表達(dá)呈現(xiàn)下降趨勢，6葉摘心處理和不摘心處理下生長前期的表達(dá)呈現(xiàn)相反的趨勢，6葉摘心處理下10 d時具有表達(dá)高峰，而不摘心處理下10 d時的表達(dá)量最低。VvGAUT1b在2葉摘心處理下的表達(dá)總體高于其他兩種處理，6葉摘心處理和不摘心處理下的表達(dá)均為先升后降的模式，其后趨于平緩。VvGAUT3在不摘心處理和6葉摘心處理下的表達(dá)均呈現(xiàn)下降的趨勢，而2葉摘心處理下呈現(xiàn)“降-升-降”的表達(dá)模式，且比其他兩種處理具有更高的表達(dá)水平。VvGAUT4a在2葉摘心處理下的表達(dá)量總體高于其他兩種處理，不摘心處理和6葉摘心處理下的表達(dá)總體表現(xiàn)出相似的模式，但不摘心處理下葉片生長時期為20 d時表達(dá)量最高，而此時6葉摘心處理下葉片中該基因的表達(dá)量最低，2葉摘心處理下的表達(dá)呈現(xiàn)“升-降-升”的趨勢，且表達(dá)量高于其他兩種處理?？傮w上，在巨峰葡萄葉片生長前期，2葉摘心處理促進(jìn)4個VvGAUTs基因表達(dá)，而在葉片生長后期抑制其表達(dá)，雖然不同基因間存在時間上的差異，但整體趨勢相同。此外，從葉片生長過程看，VvGAUT1a、VvGAUT1b和VvGAUT3在葉片生長前期表達(dá)水平較高，后期表達(dá)水平較低，而VvGAUT4a表達(dá)水平變化較平緩。

圖8 VvGAUTs基因在不同發(fā)育階段時不同摘心處理下葉片中的表達(dá)量Fig.8 The expression of VvGAUTs in leaves at different developmental stages after pinching

3 討論

基因結(jié)構(gòu)的多樣性是深入了解研究物種的進(jìn)化過程的重要途徑，對了解植物物種之間多樣化的結(jié)構(gòu)或功能關(guān)系具有重要意義［14-15］。通過對克隆到的4 個VvGAUTs進(jìn)行基因結(jié)構(gòu)分析發(fā)現(xiàn)，VvGAUT1a基因有5個外顯子，VvGAUT1b基因的外顯子有2 個，而VvGAUT3和VvGAUT4a基因均有3 個外顯子。系統(tǒng)進(jìn)化樹分析發(fā)現(xiàn)，VvGAUTs和VrGAUTs的親緣關(guān)系最近，其中VvGAUT1a和VvGAUT1b也具有較近的親緣關(guān)系。根據(jù)系統(tǒng)發(fā)育保守假說，親緣關(guān)系越近的物種在進(jìn)化史上的分歧時間越短［16-17］，因此推測同一組群的VvGAUTs基因具有相同或者相似的生物學(xué)特性，其對植物的生長發(fā)育調(diào)節(jié)可能具有相同或相似的作用特征。摘心處理不僅會改變葡萄植株體內(nèi)激素水平，也會形成機(jī)械損傷脅迫，4 個VvGAUTs啟動子順式作用元件分析發(fā)現(xiàn)VvGAUT1a、VvGAUT4a具有防御與脅迫響應(yīng)元件，VvGAUT1a、VvGAUT1b和VvGAUT3具有脫落酸響應(yīng)元件，4 個基因更是都含有赤霉素響應(yīng)元件，推測摘心處理通過這些響應(yīng)元件調(diào)控VvGAUTs基因的表達(dá)。

蛋白質(zhì)在動植物的營養(yǎng)運(yùn)輸和生殖生長等生命活動中具有重要的調(diào)節(jié)作用，對細(xì)胞的形態(tài)發(fā)生和功能至關(guān)重要［18-19］。植物在進(jìn)行各類生命活動時往往需要多種蛋白質(zhì)聯(lián)合進(jìn)行功能的行使及應(yīng)用。從蛋白互作預(yù)測結(jié)果可以發(fā)現(xiàn)，VvGAUTs基因的編碼蛋白和纖維素、木質(zhì)素和糖代謝等蛋白互作，這與前人研究結(jié)論相似，果膠能與其他細(xì)胞壁組成成分聯(lián)合以保證細(xì)胞壁的伸縮靈活性，從而維持植株的正常生命活動［20-22］。前人研究發(fā)現(xiàn)，楸樹中GAUTs基因和纖維素合成通路上的植物多肽信號基因（CLAVATA3/Embryo surrounding region-related，CLE）、葡糖苷酶基因（β-glucosidase，BGLU）共同調(diào)節(jié)樹木的拉伸應(yīng)力［23］；果膠合成關(guān)鍵基因的缺失會導(dǎo)致纖維素合成酶基因（cellulose synthase，CesA）的表達(dá)受到抑制［24］；半乳糖醛酸轉(zhuǎn)移酶基因通過調(diào)節(jié)細(xì)胞壁重塑，從而調(diào)控葉片的大?。?5］。因此，推測VvGAUTs基因通過對葡萄莖和葉片細(xì)胞壁的調(diào)控，進(jìn)而影響莖和葉片的生長發(fā)育。

果膠是維持植物細(xì)胞壁結(jié)構(gòu)和功能完整的不可缺少的一類聚合物，存在于細(xì)胞壁中的果膠在保護(hù)細(xì)胞對膨脹壓力的反應(yīng)中起著至關(guān)重要的作用，從而影響著植物的形態(tài)與功能［26］。摘心處理對果樹和農(nóng)作物均具有積極的作用，平衡營養(yǎng)生長與生殖生長，促進(jìn)營養(yǎng)物質(zhì)向花果等營養(yǎng)器官輸送［27-28］。本課題組前期研究發(fā)現(xiàn)，2 葉摘心處理顯著提高單果質(zhì)量、果穗質(zhì)量和株產(chǎn)量，顯著提高果實(shí)產(chǎn)量；進(jìn)一步研究發(fā)現(xiàn)摘心處理下的巨峰葡萄莖的粗度比不摘心莖的粗度小，且摘心處理下葡萄莖的木質(zhì)化程度更深，摘心處理下的巨峰葡萄葉片比不摘心處理的葉片更?。?2］。2葉摘心處理下巨峰葡萄的莖木質(zhì)化，可能與VvGAUTs基因的相對表達(dá)量低，果膠合成受到一定抑制有關(guān)，這與Westermark等［29］通過測定云杉木質(zhì)化樣品中果膠組成成分半乳糖醛酸和鼠李糖含量，發(fā)現(xiàn)其復(fù)合胞間層中果膠殘留較少的結(jié)論相似。2 葉摘心處理下巨峰葡萄葉片相對較小，4 個VvGAUTs基因在葉片生長前期的相對表達(dá)量明顯增強(qiáng)，這與Biswal等［30］在楊樹中發(fā)現(xiàn)，GAUT12.1基因的表達(dá)水平與株系葉面積呈負(fù)相關(guān)的結(jié)果相近。以上均證明了葡萄摘心處理可以通過調(diào)控VvGAUTs的表達(dá)影響果膠合成，但不同的VvGAUT基因在巨峰葡萄生長的不同時期，表達(dá)量變化存在明顯的差異，其對巨峰葡萄果膠生物合成和含量的影響程度，還有待進(jìn)一步的深入研究。

4 結(jié)論

本研究成功從巨峰葡萄中克隆出4 個半乳糖醛酸轉(zhuǎn)移酶基因，分別為VvGAUT1a、VvGAUT1b、VvGAUT3、VvGAUT4a，編碼351、388、345和356個氨基酸。VvGAUTs與河岸葡萄VrGAUTs 的親緣關(guān)系最近。VvGAUTs 與纖維素、木質(zhì)素和糖代謝等基因的編碼蛋白密切互作?？傮w上，在巨峰葡萄2 葉摘心處理下的莖中VvGAUTs基因表達(dá)受到抑制，而VvGAUTs基因在葉片中的表達(dá)呈現(xiàn)生長前期表達(dá)量增強(qiáng)，在生長后期表達(dá)量受到抑制的趨勢，表明VvGAUTs基因可以響應(yīng)葡萄摘心處理。