小檗堿對三陰性乳腺癌細胞MDA-MB-231增殖、遷移及凋亡的影響*

秦田, 楊宇石, 尹明英, 楊冰清, 金柔, 石鈺, 黃瑾瑾, 徐澍*

(1.貴州醫科大學附屬醫院 病理科, 貴州 貴陽 550004; 2.貴州醫科大學 臨床醫學院 病理學教研室, 貴州 貴陽 550025)

乳腺癌患者中大約有10%～15%是雌二醇受體(estrogen receptor,ER)、孕激素受體(progesterone receptor,PR)和人表皮生長因子受體2(human epidermal growth factor receptor 2,HER-2)表達均為陰性的三陰性乳腺癌(triple negative breast cancer,TNBC)。因TNBC無特異性的靶向藥物,所以治療效果差[1-3],目前TNBC的主要治療方式仍然是手術聯合放化療方式,并具有較高的復發風險和較低的生存率[4-5]。乳腺癌在中醫辨證中屬多痰毒瘀互結,化痰活血、清熱解毒散結是其治療法則[6],而黃連可清熱燥濕、瀉火解毒,在熱毒蘊結型乳腺癌中常作為君藥使用(如黃連解毒湯)。小檗堿(berberine,BBR),又稱黃連素,是從中藥黃連中分離的一種季銨生物堿,是黃連抗菌的主要有效成分,大量研究表明其有抗炎、抑菌、保護神經、降糖、降脂及抑制腫瘤等廣泛的藥理作用[7-8]。因此在本研究中,通過不同濃度BBR對人TNBC細胞系MDA-MB-231進行干預,探究BBR對MDA-MB-231細胞的增殖、遷移、凋亡的影響以及NF-κB信號通路在其中發揮的作用。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1細胞株 人TNBC細胞系MDA-MB-231(購自于中國科學院細胞庫,保存于貴州醫科大學附屬醫院病理科實驗室)。

1.1.2主要藥物及試劑 細胞培養基DMEM(美國 Gibico),胎牛血清(澳洲VICENT),鹽酸BBR(中國 索萊寶),AnnexinV/PI試劑盒(以色列Biological Industries),抗β-actin抗體(美國 GeneTex),兔多克隆抗體NF-κB P65、兔多克隆抗體磷酸化 NF-κB P65、重組兔多克隆抗體凋亡相關蛋白Caspase-3、辣根過氧化物酶標記山羊抗兔IgG二抗(英國 Abcam)。

1.1.3實驗儀器 光學倒置顯微鏡(Olympus, BX53),曝光機( Bio-Rad, YSTEM GelD),培養箱(Biobase, QP-160),流式細胞儀( Beckman coulter,CytoFLEX)。

1.2 方法

1.2.1細胞培養及分組 MDA-MB-231細胞株用含10%胎牛血清、1%鏈霉素、青霉素(100 mg/L)的高糖DMEM培養基于37 ℃、5%的CO2培養箱中培養;細胞培養2～3 d進行傳代,取處于對數生長期、生長狀態良好的細胞進行下一步實驗。參照既往相關研究,以0、25、50 μmol/L為實驗濃度分組[9]。

1.2.2平板克隆實驗 取對數生長期的細胞,用0.25%胰蛋白酶消化、計數,使細胞懸浮在含10%胎牛血清的DMEM培養液中備用;接種細胞于2 mL培養基皿中,使每個細胞培養皿中細胞數為400個;置37 ℃、5%CO2及飽和濕度的細胞培養箱中培養,細胞貼壁后,使用BBR濃度0、25、50 μmol/L的培養基作用24 h,5 d換1次液,培養10 d,當培養皿中出現肉眼可見的克隆時,終止培養;棄去上清液,PBS清洗2次,吸取2 mL 4%多聚甲醛加入培養皿中固定細胞15 min;然后去除固定液,加結晶紫染色液(1∶20配制)染色10～30 min,流水緩慢洗去染色液,干燥后拍照,并用Image J軟件計數克隆。

1.2.3劃痕實驗 取對數生長期的MDA-MB-231細胞,胰酶消化后種于6孔板內,在板底畫線定位,培養箱繼續培養24 h待細胞生長至100%融合,使用10 μL無菌槍頭在每個培養孔中垂直于畫線對細胞進行劃痕,PBS清洗后在光學倒置顯微鏡下對劃痕面積進行拍照;加入0、25、50 μmol/L BBR放入培養箱內培養24 h,取出在倒置顯微鏡下觀察細胞遷移并拍照;使用Image J軟件測量原面積和培養后面積,計算遷移率,遷移率(100%)=(原面積-培養后面積)/原面積×100%。

1.2.4Transwell遷移實驗 取進入對數生長期的MDA-MB-231細胞,然后將細胞消化、計數;打開Transwell 24 孔板,在小孔上室加入100 μL含有5×104個細胞的基礎培養基,然后加入BBR濃度0、50、100 μmol/L配制培養基100 μL;下室加入10% FBS完全培養基500 μL,將小室緩慢傾斜放入,避免氣泡產生,置于37 ℃ 恒溫CO2培養箱培養24 h后,PBS清洗小室、棉棒輕柔擦拭上室,4%多聚甲醛預固定小室20 min,PBS清洗2次,結晶紫染液染色15 min,PBS清洗3次,在倒置顯微鏡下觀察,并隨機選取5個視野,100×進行細胞計數。

1.2.5Annexin V/PI 檢測細胞凋亡率 取對數生長期的MDA-MB-231細胞,胰酶消化后種于6孔板內,不同濃度BBR處理24 h后收集細胞上清及貼壁細胞,PBS洗滌2次,用100 μL 1×Binding buffer重懸細胞, 再加入FITC 5 μL、 PI 10 μL避光染色20 min,加入 Binding buffer 400 uL后吹打混勻,流式細胞儀下分析細胞凋亡率。

1.2.6Western blot檢測蛋白表達 用0、25、50 μmol/L的BBR處理48 h對數生長期的MDA-MB-231細胞后,取待測蛋白在10%的分離膠進行SDS-PAGE電泳,隨后冰上放置轉印器具設置恒流250 mA進行轉膜70 min,將蛋白轉至PVDF膜,快速封閉30 min后放入β-actin一抗(1∶1 000)、P65一抗(1∶1 000)、磷酸化P65一抗(1∶1 000)、Caspase-3孵育4 ℃過夜,室溫二抗孵育1 h,化學發光法(ECL)檢測蛋白表達。

1.3 統計學分析

2 結果

2.1 不同濃度BBR對MDA-MB-231細胞生長形態的影響

正常TNBC的MDA-MB-231細胞生長呈現為梭形,胞質伸展,細胞貼壁緊密,而BBR給藥組細胞呈現出不規則形態,細胞出現明顯皺縮、細胞質高度濃縮、細胞外出現碎片,隨著BBR給藥濃度的增加,細胞的貼壁能力下降。見圖1。

注：A～C分別為不同濃度BBR作用后光鏡下MDA-MB-231的細胞形態。

2.2 不同濃度BBR對MDA-MB-231細胞增殖能力的影響

使用0、25、50 μmol/L濃度BBR作用MDA-MB-231細胞,在克隆形成實驗中,可觀察到BBR能抑制MDA-MB-231細胞的增殖活性(P<0.05)。見圖2。

注：A 為不同濃度BBR作用后MDA-MB-231 細胞平板克隆形成情況,B為平板克隆形成實驗的定量結果;(1)與0 μmol/L BBR組相比,P<0.05。

2.3 不同濃度BBR對MDA-MB-231細胞遷移能力的影響

使用0、25、50 μmol/L濃度BBR作用MDA-MB-231細胞,在劃痕實驗中,與0 μmol/L組相比,實驗組隨著BBR濃度增加,細胞劃痕傷口愈合距離百分比逐漸降低;在Transwell遷移實驗中,相較于0 μmol/L BBR組而言,BBR能明顯抑制TNBC的遷移能力。見圖3。

注：A、B為不同濃度BBR作用后MDA-MB-231細胞劃痕實驗結果(圖A為光鏡);C、D為不同濃度BBR作用后MDA-MB-231細胞Transwell實驗結果(圖C為結晶紫染色);(1) 與0 μmol/L BBR組相比,P<0.05。

2.4 不同濃度BBR對MDA-MB-231細胞凋亡的影響

BBR給藥后MDA-MB-231細胞總凋亡率分別為7.72%±1.36%(0 μmol/L)、13.29%±6.55%(25 μmol/L)、13.70%±6.26%(50 μmol/L),與0 μmol/L BBR組相比,25 μmol/L、50 μmol/L引起的細胞凋亡率高(P<0.05),提示BBR能夠誘導MDA-MB-231細胞凋亡。見圖4。

注：A為 0、25 及 50 μmol/L BBR組對人MDA-MB-231 細胞凋亡的影響,B為細胞凋亡率的定量結果;(1)與0 μmol/L BBR組相比, P<0.05。

2.5 P65蛋白、磷酸化P65蛋白及裂解活化的凋亡級聯蛋白Caspase-3(C-Caspase3)的表達水平

BBR作用MDA-MB-231細胞48 h后,使用Western blot檢測MDA-MB-231細胞中P65蛋白及其磷酸化的狀態,發現P65蛋白水平不變,而其磷酸化水平降低(P<0.05),并且C-Caspase3在BBR作用后增加(P<0.05)。見圖5。

注：A為不同濃度BBR作用后MDA-MB-231細胞的蛋白條帶圖,B為磷酸化P65蛋白表達水平,C為 P65蛋白表達水平,D為C-Caspase3蛋白表達水平;(1)與0 μmol/L BBR組相比,P<0.05。

3 討論

TNBC作為一類惡性程度和侵襲性均高的乳腺癌亞型,具有高復發率和低生存率的特點,目前臨床尚無針對其的靶向治療藥物[10],因此,探索新的治療方式對TNBC患者來說十分重要[11]。

BBR是黃連中主要的活性異喹啉類生物堿之一,研究證實可以通過誘導腫瘤細胞周期停滯、衰老、凋亡及自噬作用來抑制癌細胞的增殖、侵襲和轉移,在不同的腫瘤中表現出明顯的抗腫瘤活性[12-14]。特別是乳腺癌中,BBR有高度的抗腫瘤活性[12]。

NF-κB轉錄因子是免疫、炎癥和急性期反應的關鍵調節因子,也參與細胞增殖和凋亡的控制[15-17]。在乳腺組織中,該通路的異常活化常導致腫瘤的發生[18],NF-κB在TNBC中經常被激活,抑制NF-κB活性會抑制TNBC細胞的生長[17]。當細胞處于靜息狀態時,NF-κB作為由亞基P65和P50以及抑制性亞基IκBα組成的異質體在細胞質中保持無活性狀態。然而,在大多數癌癥中,NF-κB處于活動狀態,P65/P50亞基被釋放并遷移到細胞核,在那里與特定的DNA序列結合并激活超過500個基因的轉錄。P65絲氨酸536 處的磷酸化的活化對 P65 的轉錄活性至關重要,P65上的絲氨酸S536位點磷酸化,可導致 P65 轉錄活性增強[19]。本實驗結果表明,隨著BBR的濃度逐漸增加,P65的磷酸化受到抑制。P65的磷酸化降低能夠影響NF-κB DNA結合活性[20],同時,抗凋亡蛋白Bcl-2作為P65的下游靶基因,Bcl-2及其同源蛋白Bcl-xl轉錄水平被顯著抑制[21],P65 S536位點磷酸化的下降可誘導凋亡的發生。在本研究中BBR可影響MDA-MB-231細胞的生長形態,可使細胞變小,胞質皺縮,出現細胞碎片,符合細胞凋亡的表現,同錢潔等[9]的研究一致。并且通過細胞凋亡檢測發現BBR可明顯促進MDA-MB-231細胞凋亡率增加,C-Caspase3活化增加,誘導了凋亡的發生。

綜上所述,本研究發現BBR可呈濃度依賴性地抑制MDA-MB-231細胞的增殖、遷移并且誘導凋亡的發生。其機制可能是BBR通過對P65磷酸化的調控,抑制了P65的活性,抑制腫瘤細胞生長,誘導了腫瘤細胞凋亡的發生。本研究為BBR應用于TNBC治療提供了一定的理論基礎,但BBR抗腫瘤機制仍需進一步研究明確。