病原菌血流感染對(duì)阿爾茨海默病小鼠記憶力和海馬錐體細(xì)胞的影響*

姚昌昊, 周曉明, 康穎倩*

(1.貴州醫(yī)科大學(xué) 基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院 微生物學(xué)教研室, 貴州 貴陽 550025; 2.貴州省普通高校病原生物學(xué)特色重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室, 貴州 貴陽 550025; 3.貴州醫(yī)科大學(xué) 環(huán)境污染與疾病監(jiān)控教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室, 貴州 貴陽 550025; 4.貴陽市婦幼保健院 質(zhì)控科, 貴州 貴陽 550003)

阿爾茨海默病(Alzheimer's disease,AD)作為一種老年癡呆疾病,發(fā)病往往較為隱匿,呈緩慢進(jìn)行性發(fā)展,早期以近記憶功能下降為主,隨病程的進(jìn)展逐漸造成遠(yuǎn)記憶功能受損,主要表現(xiàn)為記憶障礙、語言功能減退及視空間障礙為主[1];進(jìn)而引起患者日常生活能力下降,中晚期出現(xiàn)幻覺、妄想、行為失常、睡眠障礙等神經(jīng)精神癥狀,容易合并深部感染[2]。近年來,我國(guó)人群年齡結(jié)構(gòu)出現(xiàn)老年人群占比越來越高的情況,因此AD患者人數(shù)也明顯增多,對(duì)患者家庭以及社會(huì)層面都帶來了巨大壓力[3-5]。有數(shù)據(jù)顯示,目前,全球有近5 000萬AD患者,并預(yù)判30年后將新增15 200萬AD患者,AD 已成為全球第5大死因[6-7]。AD模型小鼠的造模方法眾多,其中化學(xué)方法造模較為常見[8]。D-半乳糖(D-galactose)是一種還原性單糖物質(zhì),可致大腦出現(xiàn)認(rèn)知功能和膽堿能功能障礙,原因是其可迅速升高大腦組織滲透壓,介導(dǎo)氧化應(yīng)激及炎癥反應(yīng),因此通過腹壁皮下連續(xù)注射D-半乳糖可建立AD模型小鼠[9]。目前關(guān)于AD小鼠尾靜脈感染自AD患者來源的病原菌研究國(guó)內(nèi)報(bào)道較少,因此,本研究擬探討AD患者合并感染的病原菌經(jīng)尾靜脈注射AD模型小鼠形成血流感染后對(duì)其記憶和海馬結(jié)構(gòu)的影響,為AD患者的治療提供實(shí)驗(yàn)室參考。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料

1.1.1實(shí)驗(yàn)動(dòng)物和菌株來源 2月齡、體質(zhì)量18～22 g的C57BL/6J雄性小鼠50只,購(gòu)于成都達(dá)碩實(shí)驗(yàn)動(dòng)物有限公司[SCXK-(川)2020-030],采用SPF級(jí)輻照維持飼料(北京科澳協(xié)力飼料有限公司)飼養(yǎng)于SPF級(jí)標(biāo)準(zhǔn)動(dòng)物房中,確保食物和飲水供應(yīng)充足,飼養(yǎng)于溫度20～26 ℃、濕度40%～50%的環(huán)境中,12 h晝夜交替照明,小鼠每日自由進(jìn)食和飲水,飼養(yǎng)及使用程序均嚴(yán)格遵循國(guó)家科學(xué)技術(shù)委員會(huì)頒布的《實(shí)驗(yàn)動(dòng)物管理?xiàng)l例》要求規(guī)范,并獲學(xué)校實(shí)驗(yàn)動(dòng)物倫理委員會(huì)的批準(zhǔn)(N2200384);成都某醫(yī)院綜合內(nèi)科住院、確診為AD合并深部感染患者的痰液、血液及尿液中提取的5種數(shù)量較多并具有一定代表意義的病原菌,分別為大腸埃希菌(SYY001)、銅綠假單孢菌(SYY002)、肺炎克雷伯桿菌(SYY003)、金黃色葡萄球菌(SYY004)及白念珠菌(SYY005),5種菌株均保存于15%甘油管中并儲(chǔ)存于-20 ℃冰箱。

1.1.2主要試劑和儀器 D-半乳糖(南京都萊生物技術(shù)有限公司,純度99%,100 g/瓶),LB固體培養(yǎng)基、營(yíng)養(yǎng)瓊脂、麥康凱瓊脂培養(yǎng)基、血平板及沙氏瓊脂培養(yǎng)基(北京索萊寶生物科技有限公司);SW-CJ-IF型超凈工作臺(tái)(上海一恒科學(xué)儀器有限公司),Morris水迷宮系統(tǒng)(諾達(dá)思北京信息技術(shù)有限公司),高壓蒸汽滅菌鍋(上海醫(yī)療設(shè)備廠),DHP-9902型電熱恒溫培養(yǎng)箱(上海一恒科學(xué)儀器有限公司),AUW220型電子天平(日本島津儀器有限公司),震蕩切片機(jī)(上海之信儀器有限公司),KH-TK型組織脫水機(jī)(湖北闊海醫(yī)療科技有限公司),PBM-A型病理組織包埋冷凍臺(tái)(常州普瑞斯星醫(yī)療設(shè)備公司),RM2125型輪轉(zhuǎn)式切片機(jī)(上海徠卡儀器有限公司),ECLIPSE Series型普通光學(xué)顯微鏡(日本尼康公司),數(shù)字切片掃描儀Pannoramic 2503DHISTECH(Hungary),KH-01型麥?zhǔn)媳葷醿x(北京海富達(dá)科技有限公司)。

1.2 研究方法

1.2.1小鼠造模及體質(zhì)量測(cè)定 50只C57BL/6J雄性小鼠第1周適應(yīng)性飼養(yǎng),第2周開始使用D-半乳糖按200 mg/(kg·d)腹部皮下注射造模[10]。D-半乳糖溶液配置方法為生理鹽水7 mL加D-半乳糖0.2 g于燒杯中,玻璃棒攪拌均勻,倒入試劑瓶;取無菌生理鹽水3 mL沖洗燒杯及玻璃棒,沖洗液全部倒入試劑瓶中;每天使用醫(yī)用無菌注射器腹壁皮下注射配制好的D-半乳糖液0.2 mL,注射時(shí)間為8周[11]。造模期間每周觀測(cè)小鼠的一般狀態(tài)及體質(zhì)量。

1.2.2菌株復(fù)蘇 造模結(jié)束后,將大腸埃希菌、銅綠假單孢菌、肺炎克雷伯桿菌、金黃色葡萄球菌及白念珠菌統(tǒng)一復(fù)蘇后傳至第2代備用。其中,大腸埃希菌使用LB固體培養(yǎng)基進(jìn)行復(fù)蘇培養(yǎng),銅綠假單胞菌及肺炎克雷伯桿菌使用麥康凱瓊脂培養(yǎng)基進(jìn)行復(fù)蘇培養(yǎng),金黃色葡萄球菌使用血平板進(jìn)行復(fù)蘇培養(yǎng),白念珠菌使用SDA培養(yǎng)基進(jìn)行復(fù)蘇培養(yǎng)。嚴(yán)格按照《全國(guó)臨床檢驗(yàn)操作規(guī)程》第4版要求進(jìn)行[12]。

1.2.3小鼠分組及體質(zhì)量、體溫測(cè)定 取“1.2.2”項(xiàng)下傳至第2代的5種病原菌,使用麥?zhǔn)媳葷醿x配置菌液為0.5麥?zhǔn)蠞舛?1.5×1011CFU/L)后備用,此為原始濃度。因課題組前期預(yù)實(shí)驗(yàn)5種病原菌菌液原始濃度為1.5×1011CFU/L時(shí)感染AD模型小鼠死亡,而5種病原菌菌液濃度為1.5×108CFU/L時(shí)感染AD小鼠觀察14 d后仍存活。為避免小鼠死亡,按照參考文獻(xiàn)[13-16]方法將5種病原菌的菌液濃度稀釋為1.5×109CFU/L(高濃度)、1.5×108CFU/L(中濃度)及1.5×107CFU/L(低濃度)進(jìn)行實(shí)驗(yàn),每種病原菌菌液有3個(gè)濃度,每個(gè)濃度3只小鼠重復(fù)。5組病原菌感染組的小鼠注射相應(yīng)菌液,對(duì)照鼠小鼠注射無菌生理鹽水,且每只小鼠均采用尾靜脈注射法注射相應(yīng)液體0.2 mL;5個(gè)病原菌感染組分別是大腸埃希菌組(9只)、銅綠假單孢菌組(9只)、肺炎克雷伯桿菌組(9只)、金黃色葡萄球菌組(9只)及白念珠菌組(9只),且同一菌株按前述濃度分為高濃度組、中濃度組及低濃度組;觀察14 d,分別于注射后第1、2、3天及第1、2周測(cè)定各組小鼠的體質(zhì)量及體溫[17]。

1.2.4水迷宮實(shí)驗(yàn) 取“1.2.3”項(xiàng)下實(shí)驗(yàn)結(jié)束時(shí)各組小鼠進(jìn)行Morris水迷宮實(shí)驗(yàn)。實(shí)驗(yàn)開始前將所有小鼠置于水迷宮系統(tǒng)實(shí)驗(yàn)室,以便小鼠適應(yīng)實(shí)驗(yàn)室環(huán)境,避免受驚。前5 d為定位航行實(shí)驗(yàn),其主要用來評(píng)價(jià)小鼠的學(xué)習(xí)記憶功能;第2～5天,將平臺(tái)置于水平面下1 cm位置,其余操作同第1天;定位航行實(shí)驗(yàn)結(jié)束 24 h 后,撤除水下平臺(tái),任選 1 個(gè)入水點(diǎn)將小鼠面向池壁放入水中,各組小鼠必須在同一入水點(diǎn),記錄小鼠在120 s 內(nèi)第1次跨越平臺(tái)時(shí)間、跨越平臺(tái)次數(shù)等指標(biāo)[18]。

1.2.5海馬組織學(xué)特征觀察 取“1.2.4”項(xiàng)下實(shí)驗(yàn)結(jié)束時(shí)各組小鼠禁食12 h,稱取空腹體質(zhì)量;脫頸處死各組小鼠,冰上解剖,取頭顱、剪開皮膚暴露顱骨、鑷子夾住兩側(cè)眼眶用眼科剪稍減除顱骨中線,清晰可見后全腦組織,使用無菌眼科鑷去除腦膜和血管,竹簽從嗅球處向下取出全腦[18];腦組織移至冰上切割,使用無菌眼科鑷及玻璃分針緩慢的將一側(cè)大腦皮層撥開,暴露出海馬組織,取出兩側(cè)海馬,4 ℃的0.9%生理鹽水清洗,定性濾紙吸干海馬表面的生理鹽水;采用10%多聚甲醛溶液固定過夜,石蠟包埋、切片后常規(guī)蘇木精-伊紅(HE)染色,普通光學(xué)顯微鏡下觀察海馬CA1及CA3區(qū)(200倍),用數(shù)字切片掃描儀掃描后采圖。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

2 結(jié)果

2.1 一般情況

造模到第8周時(shí),50只模型小鼠活動(dòng)度逐漸減慢、觸須脫落,毛色枯黃、光澤度下降,皮膚松弛,體質(zhì)量開始下降,進(jìn)食減少,且精神狀況較造模初期明顯下降。見圖1。

圖1 D-半乳糖干預(yù)小鼠8周的體質(zhì)量變化Fig.1 Changes in body mass of mice treated with D-galactose for 8 weeks

2.2 體質(zhì)量及體溫變化

隨著觀察時(shí)間的延長(zhǎng),對(duì)照組與各病原菌感染組小鼠的體質(zhì)量均有所增加,其中對(duì)照組小鼠體質(zhì)量增加速度最快;5種病原菌感染組小鼠體質(zhì)量增加速度均低于對(duì)照組;5種病原菌感染組的小鼠體溫前3 d呈輕度上升趨勢(shì);第1周,除肺炎克雷伯菌組小鼠體溫仍有輕度上升,其余各組小鼠體溫均呈下降趨勢(shì);第2周各組小鼠體溫值變化不大,差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。見表1。

表1 各組AD小鼠體質(zhì)量和體溫的變化

2.3 水迷宮實(shí)驗(yàn)

隨著訓(xùn)練天數(shù)的增加,對(duì)照組小鼠的逃避潛伏期于第2 天輕度上升,第3～5天均表現(xiàn)為逐漸下降的趨勢(shì);與第4 天相比,第5天5種病原菌低、中及高濃度感染組小鼠的逃避潛伏期時(shí)間均縮短(P<0.05,圖2);第1～5天肺炎克雷伯菌高濃度組小鼠隨著訓(xùn)練天數(shù)的增加,游泳速度逐漸減慢。與對(duì)照組相比,第5天該菌高濃度組小鼠游泳速度顯著下降(P<0.01,圖3);5組病原菌中濃度感染組小鼠游泳速度整體比較,差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05,圖3)。與第4天相比,第5天金黃色葡萄球菌中濃度感染組小鼠游泳速度明顯提高(P<0.01,圖3);5組病原菌低濃度感染組小鼠游泳速度比較,差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05,圖3);各組小鼠120 s穿越平臺(tái)次數(shù)整體比較,差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05,圖4)。

圖2 各組小鼠水迷宮實(shí)驗(yàn)的平臺(tái)逃避潛伏期變化Fig.2 Water Maze experimental platform escapes incubation period

圖3 各組小鼠水迷宮實(shí)驗(yàn)的游泳速度變化Fig.3 Changes in swimming speed in water maze test of mice in each group

圖4 各組小鼠水迷宮實(shí)驗(yàn)120 s的穿越平臺(tái)次數(shù)Fig.4 Times of crossing the platform of each group in water maze experiment for 120 s

2.4 海馬組織學(xué)特征

HE染色結(jié)果顯示(圖5),對(duì)照組小鼠海馬CA1和CA3區(qū)海馬錐體細(xì)胞形態(tài)規(guī)則、排列整齊、細(xì)胞間隙未見明顯異常,金黃色葡萄球菌組和大腸埃希菌組小鼠海馬CA1和CA3區(qū)部分海馬錐體細(xì)胞排列紊亂、細(xì)胞間隙增寬、胞體深染,銅綠假單胞菌組和肺炎克雷伯菌組小鼠海馬CA1和CA3區(qū)海馬錐體細(xì)胞有少許顆粒空泡變性,白念珠菌組小鼠海馬CA1和CA3區(qū)見海馬錐體細(xì)胞凋亡。

圖5 各組小鼠海馬CA1和CA3區(qū)組織學(xué)特征(HE,×200)Fig.5 Histological characteristics of hippocampal CA1 and CA3 regions in each group of mice(HE,×200)

3 討論

D-半乳糖腹壁皮下注射小鼠造模是一種成熟的化學(xué)造模方法,因操作較為方便且成本較低而被廣泛應(yīng)用,其原理是D-半乳糖能夠使大腦正常神經(jīng)細(xì)胞的代謝功能受到抑制,從而導(dǎo)致小鼠癡呆[19-20]。研究顯示,D-半乳糖引起細(xì)胞代謝紊亂,是由于其所產(chǎn)生的代謝產(chǎn)物半乳糖醇能夠引起細(xì)胞代謝紊亂,產(chǎn)生大量的活性氧,造成多器官、多系統(tǒng)功能衰退[21]。此外,D-半乳糖還可以引起大腦組織炎癥因子釋放增加。本研究采用D-半乳糖[200 mg/(kg·d)]腹壁皮下注射小鼠,結(jié)果顯示注射8周后小鼠毛發(fā)脫落光澤度下降、皮膚松弛、體質(zhì)量開始下降,小鼠活動(dòng)情況較造模之初明顯遲緩。

本研究將臨床AD患者來源的病原菌經(jīng)尾靜脈注射AD小鼠并觀察14 d后,對(duì)各組小鼠進(jìn)行了水迷宮實(shí)驗(yàn),結(jié)果顯示,銅綠假單胞菌組、肺炎克雷伯菌組、金黃色葡萄球菌組及白念珠菌組小鼠逃避潛伏期較對(duì)照組有所延長(zhǎng),同一種病原菌感染組小鼠中有的表現(xiàn)為高濃度組小鼠游泳速度較對(duì)照組更慢,有的表現(xiàn)為低濃度組小鼠逃避潛伏期較對(duì)照組更長(zhǎng)。潛伏期時(shí)間的長(zhǎng)短與小鼠尾靜脈注射感染的病原菌種類有關(guān),與病原菌的濃度無明確的相關(guān)性,提示不同類型的病原菌均能夠產(chǎn)生相應(yīng)的毒力,從而對(duì)AD小鼠的學(xué)習(xí)記憶能力產(chǎn)生一定的影響。水迷宮實(shí)驗(yàn)120 s時(shí),各組AD小鼠穿越平臺(tái)次數(shù)無差異,提示病原菌感染種類的不同對(duì)AD小鼠穿越平臺(tái)的次數(shù)無影響。相關(guān)研究認(rèn)為,血腦屏障中控制大分子物質(zhì)進(jìn)出大腦的通道由微血管內(nèi)皮細(xì)胞、星形膠質(zhì)細(xì)胞和周細(xì)胞組成,對(duì)中樞神經(jīng)系統(tǒng)起到一定的保護(hù)[22]。本研究結(jié)果提示,臨床AD患者來源的病原菌通過尾靜脈注射AD小鼠后,可經(jīng)血腦屏障進(jìn)入中樞神經(jīng)系統(tǒng),對(duì)小鼠的學(xué)習(xí)記憶功能產(chǎn)生損害。

注射病原菌菌液后觀測(cè)各組小鼠的體溫情況,結(jié)果顯示,5種病原菌感染組小鼠及對(duì)照組小鼠的體溫值均在正常范圍內(nèi)波動(dòng),大腸埃希菌組小鼠的體溫值波動(dòng)較大;5種病原菌感染組小鼠體質(zhì)量的波動(dòng)情況較對(duì)照組低1～2 g,分析可能原因是AD患者來源的病原菌可產(chǎn)生相應(yīng)毒力及致病因子,從而引起小鼠體溫升高及飲食減少。相關(guān)研究發(fā)現(xiàn),某些特定的細(xì)菌和真菌感染可引起中樞系統(tǒng)感染,部分細(xì)菌入侵大腦是通過穿越血腦屏障實(shí)現(xiàn)的[23]。感染期間,中樞神經(jīng)系統(tǒng)的損傷引起炎癥介質(zhì)的釋放和免疫系統(tǒng)的激活,炎癥介質(zhì)可透過損傷的血腦屏障及受損的細(xì)胞膜,進(jìn)一步導(dǎo)致大腦內(nèi)氧化應(yīng)激損傷,加重神經(jīng)退化[24]。近些年來,AD患者中的真菌感染也受到越來越多學(xué)者的關(guān)注[25-26]。

本研究選用臨床來源的5種AD患者合并深部感染常見的病原菌。其中,白念珠菌的致病機(jī)理尚不明確;銅綠假單胞菌是一種常見的條件致病菌,其毒力主要與鞭毛和菌毛、Ⅲ型分泌系統(tǒng)、群體感應(yīng)系統(tǒng)等因素相關(guān)[27];肺炎克雷伯桿菌多與其自身存在的毒力因子及毒素密切關(guān)聯(lián);大腸埃希菌的毒力主要是與細(xì)胞粘附、生物被膜、鐵攝取相關(guān)以及毒素類致病因子等;金黃色葡萄球菌的毒力則包括凝集因子A、胞外分泌型蛋白、血漿凝固酶及金黃色葡萄球菌腸毒素等,這些毒素可造成人體多器官損害,危及生命[28-29]。

本研究中AD模型小鼠海馬組織學(xué)結(jié)果顯示,部分病原菌感染組小鼠海馬CA1及CA3區(qū)出現(xiàn)錐體細(xì)胞排列紊亂和顆?？张葑冃?推測(cè)錐體細(xì)胞變性程度可能與小鼠感染病原菌的種類有關(guān),提示不同的病原菌因各自的毒力不同,從而對(duì)海馬組織神經(jīng)元細(xì)胞產(chǎn)生不同的影響;白念珠菌組中部分小鼠海馬錐體細(xì)胞有凋亡的表現(xiàn),推測(cè)毒力越強(qiáng)的病原菌對(duì)小鼠海馬組織的影響更大。近年有研究提示,學(xué)習(xí)記憶功能減退與腦內(nèi)神經(jīng)元數(shù)目減少及神經(jīng)元突觸的可塑性變化有關(guān)[30]。

本研究結(jié)果表明,病原菌血流感染可以引起AD小鼠學(xué)習(xí)記憶功能下降,可能是病原菌的毒力及致病因子加重了神經(jīng)細(xì)胞損害,從而加速了AD小鼠的癡呆進(jìn)程。因此,臨床上要加強(qiáng)對(duì)AD患者病原菌感染的預(yù)防和重視,降低患者合并感染的機(jī)會(huì),延緩疾病進(jìn)展。