云木香二氯甲烷提取物抗肝纖維化活性成分的鑒定*

黃韻秋, 張正寬, 李靖, 付瓊, 李晶, 廖尚高*

(貴州醫(yī)科大學(xué) 藥學(xué)院, 貴州 貴陽 550025)

云木香 [Saussrureacostus(Falc.) Lipech或AucklandialappaDecne]又稱木香、青木香、廣木香及興瞿草[1-2]。云木香為云南道地藥材,后引種至我國貴、川、兩廣等高寒潮濕等地,是全國重點(diǎn)中藥材生產(chǎn)品種[3]。中國藥典收錄的多種中成藥如小兒香精丸、八寶坤順丸、三九胃泰膠囊等均采取云木香為主要原料[4]。云木香根莖入藥,具有解除平滑肌痙攣、降壓、抗菌、健胃及止痛的功效[5],現(xiàn)代藥理研究對(duì)云木香及其活性成分主要集中在抗腫瘤、抗炎及抑菌方面[5]。已有的研究表明,云木香中存在單萜、倍半萜、三萜、糖苷、蒽醌及其它小分子類化合物,其中分離得到的倍半萜類單體占比最多,達(dá)200余個(gè),為云木香的主要活性成分,涉及愈創(chuàng)木烷、吉瑪烷、桉葉烷及橄欖烷等骨架類型,其中桉葉烷型骨架類型在該種屬中數(shù)量最豐富[6]。隨著對(duì)云木香的深入研究,含量較少的倍半萜二聚體和倍半萜與氨基酸雜合體也更多地被發(fā)現(xiàn)[6]。本課題組前期預(yù)實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示,云木香95%乙醇提取物的二氯甲烷部位具有較好的抗肝纖維化(hepatic fibrosis,HF)作用[半數(shù)抑制濃度(the half maximal inhibitory concentration,IC50)=62 mg/L],但其活性成分未知。因此,本研究對(duì)該部位的化學(xué)成分進(jìn)行研究,并評(píng)價(jià)各化學(xué)成分對(duì)人肝星狀細(xì)胞(hepatic stellate cells,HSC)株LX-2的增殖作用的影響,確定二氯甲烷部位抗HF的活性成分。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料

1.1.1主要藥材及細(xì)胞來源 本研究所用的藥材購自貴州土特產(chǎn)中藥材批發(fā)市場,經(jīng)貴州醫(yī)科大學(xué)龍慶德副教授鑒定為鳳毛菊屬植物云木香(S.costus)的根,該藥材標(biāo)本(20190710)保存于貴州醫(yī)科大學(xué)天然藥物化學(xué)教研室;人HSC株LX-2購自廣州吉尼歐有限公司。

1.1.2主要試劑 色譜分析、分離用的薄層層析硅膠GF254和柱層析硅膠(青島海洋化工廠),Sephadex LH-20(瑞士Pharmacia Biotech),石油醚(60～90 ℃,上海泰坦科技股份有限公司),分析純醋酸乙酯和甲醇(國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司),色譜甲醇和乙腈(上海薩恩化學(xué)技術(shù)有限公司),分析純丙酮和氯仿(上海申博化工有限公司),胎牛血清(加拿大維森特生物技術(shù)有限公司),二甲基亞砜(dimethylsulfoxide,DMSO)和噻唑藍(lán)(methyl thiazolyltetrazolium,MTT;北京索萊寶科技有限公司)。

1.1.3主要儀器 Bruker AVANCE NEO 600M核磁共振(NMR)波譜儀(德國 Bruker公司),Thermo Scientific TSQ Endura三重四級(jí)桿質(zhì)譜儀(美國賽默飛世爾科技公司),全波長多功能酶標(biāo)儀(Bio-Tek)和SW-CJ-2D 型超凈工作臺(tái)(蘇州凈化設(shè)備有限公司),2001HY-6003型CO2細(xì)胞培養(yǎng)箱以及TS-8 型轉(zhuǎn)移脫色搖床(海門市其林貝爾儀器制造有限公司)。

1.2 研究方法

1.2.1提取與分離 干燥的云木香藥材根莖30 kg打成粗粉,室溫浸泡24 h,95%乙醇加熱回流提取2 h,共3次,合并粗提物并減壓濃縮得到醇提浸膏5 kg;水溶浸膏,按等體積量有機(jī)試劑極性從小到大依次用石油醚、二氯甲烷、醋酸乙酯及正丁醇進(jìn)行萃取,共計(jì)3次,完成分段處理。對(duì)二氯甲烷萃取部位(1 000 g),以正相硅膠(300～400目)為吸附劑,石油醚∶醋酸乙酯(純石油醚、10∶1、5∶1、2∶1、1∶1、純醋酸乙酯)進(jìn)行梯度洗脫,薄層色譜檢識(shí)后合并相同組分,共得到7個(gè)流分(Fr.1～Fr.7)。Fr.1(2.0 g)通過硅膠柱(300～400目)層析,以石油醚∶丙酮(40∶1、20∶1、5∶1)梯度洗脫,所得組分再經(jīng)硅膠柱(300～400目)層析,以石油醚∶醋酸乙酯(40∶1、20∶1、5∶1)進(jìn)行梯度洗脫,得到化合物11(5.0 mg)。Fr.2(39.7 g)通過硅膠柱(300～400目)層析,以石油醚∶丙酮(40∶1、20∶1、5∶1)梯度洗脫,得到11個(gè)組分(Fr.2-1～Fr.2-11);Fr.2-6經(jīng)硅膠柱(300～400目)層析(石油醚∶醋酸乙酯,30∶1、10∶1、5∶1)梯度洗脫后得到6個(gè)組分(Fr.2-6-1～Fr.2-6-6);Fr.2-6-1經(jīng)反復(fù)硅膠柱(300～400目)層析(石油醚∶醋酸乙酯,50∶1、30∶1、10∶1)梯度洗脫分離得到化合物2(20.1 mg)。Fr.2-6-2經(jīng)正相制備型高效液相色譜(preparative HPLC, pHPLC;石油醚∶醋酸乙酯為70∶30)分離得到化合物3(2.3 mg)。對(duì)Fr.2-6-5先經(jīng)Sephadex LH-20層析(氯仿∶甲醇為3∶2)進(jìn)行分離除雜,再經(jīng)反相pHPLC(甲醇∶水為68∶32)分離得到化合物13(7.1 mg)。Fr.2-8經(jīng)反復(fù)硅膠柱(300～400目)層析(石油醚∶醋酸乙酯,50∶1、30∶1、10∶1)梯度洗脫分離得到化合物1(19.5 mg)。Fr.3(7.3 g)經(jīng)硅膠柱(300～400目)層析(石油醚∶丙酮,20∶1、10∶1、5∶1)進(jìn)行梯度洗脫分離得到13個(gè)組分(Fr.3-1～Fr.3-13)。Fr.3-3經(jīng)反相pHPLC(甲醇∶水為68∶32)分離得到化合物12(5.1 mg)。Fr.3-9經(jīng)硅膠柱(300～400目)層析(石油醚∶醋酸乙酯為20∶1、0∶1)分離后再利用pHPLC(甲醇∶水為65∶35)純化后得到化合物16(1.2 mg)。Fr.4(11.2 g)經(jīng)硅膠柱(300～400目)色譜,以石油醚∶丙酮(20∶1、10∶1、5∶1、7∶3、3∶2)梯度洗脫,得到5個(gè)組分Fr.4-1～Fr.4-5。Fr.4-3采用MCI(乙醇∶水,0%～100%)洗脫,分離得到9個(gè)組分Fr.4-3-1～Fr.4-3-9。Fr.4-3-8經(jīng)硅膠柱(二氯甲烷∶醋酸乙酯為1∶0、0∶1)后經(jīng)過正相pHPLC(石油醚∶醋酸乙酯為60∶40)分離得到化合物8(2.0 mg)。Fr.4-3-2經(jīng)過反相pHPLC(甲醇∶水為60∶40)分離得到化合物15(4.1 mg)。Fr.4-3-3經(jīng)硅膠柱(300～400目)層析(二氯甲烷∶甲醇為1∶0、0∶1) 洗脫得到Fr.4-3-3-1～Fr.4-3-3-5。Fr.4-3-3-1經(jīng)過硅膠柱(300～400目)層析(石油醚∶丙酮為20∶1、0∶1)分離得到化合物14(1.2 mg)。Fr.4-3-4經(jīng)羥丙基葡聚糖凝膠柱(sephadex LH-20,氯仿∶甲醇為3∶2)洗脫得到6個(gè)組分Fr.4-3-4-1～Fr.4-3-4-6,Fr.4-3-4-3經(jīng)過硅膠柱(300～400目)層析(二氯甲烷∶醋酸乙酯為1∶0、0∶1)洗脫得到5個(gè)組分(Fr.4-3-4-3-1～Fr.4-3-4-3-5),Fr.4-3-4-3-4經(jīng)反相pHPLC(甲醇∶水為56∶44)分離得到化合物6(1.5 mg),其中Fr.4-3-4-3-1經(jīng)過正相pHPLC(石油醚∶醋酸乙酯為60∶40)分離得到化合物5(1.3 mg),Fr.4-3-3-4經(jīng)過反相pHPLC(甲醇∶水為64∶36)分離得到化合物4(1.4 mg)。Fr.4-2經(jīng)過硅膠柱(300～400目)層析(二氯甲烷∶甲醇為1∶0、0∶1)洗脫后得到9個(gè)組分(Fr.4-2-1～Fr.4-2-9),Fr.4-2-3先經(jīng)羥丙基葡聚糖凝膠柱(Sephadex LH-20)分離后經(jīng)正相pHPLC(石油醚∶醋酸乙酯為40∶60)純化得到化合物9(2.2 mg)和化合物10(1.5 mg);Fr.4-2-6過硅膠柱(300～400目)層析(石油醚∶醋酸乙酯為1∶0、0∶1)和反相pHPLC(甲醇∶水為72∶28)分離純化得到化合物7(2.1 mg)。

1.2.2化合物單體成分及陽性藥的配制 二甲基亞砜溶解單體化合物以及陽性藥索拉非尼,配制成100 mmol/L母液,-20 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.3細(xì)胞培養(yǎng) LX-2細(xì)胞使用含有10%胎牛血清和1%雙抗(青霉素和鏈霉素)的DMEM高糖培養(yǎng)基(完全培養(yǎng)基)于37 ℃、5%CO2及90%濕度環(huán)境中孵育,顯微鏡下觀察細(xì)胞長滿培養(yǎng)瓶至80%～90%后進(jìn)行一傳二培養(yǎng),每隔2 d換液,取處于對(duì)數(shù)期細(xì)胞用于抗HF活性測試。

1.2.4抗HF活性測試 取處于對(duì)數(shù)生長期的LX-2細(xì)胞,胰蛋白酶消化,用培養(yǎng)基混懸以50個(gè)/L的密度以100 μL/孔體積接種于96孔培養(yǎng)板中,邊緣加無菌PBS 200 μL,鋪板24 h,棄上清;1、10、50、100及200 μmol/L不同濃度單體化合物組以100 μL/孔加入板中,另設(shè)正常對(duì)照組、DMSO對(duì)照組、陽性藥對(duì)照組,以上各組均設(shè)6個(gè)復(fù)孔;給藥48 h,棄上清,避光加5 g/L MTT溶液100 μL,孵育4 h,除盡上清液,加二甲亞砜100 μL,搖床搖勻10 min;選定測定波長為492 nm,于酶標(biāo)儀上測定溶液的吸光度(absorbance,A),計(jì)算細(xì)胞存活率。

2 結(jié)果

2.1 結(jié)構(gòu)鑒定

經(jīng)質(zhì)譜和NMR數(shù)據(jù)分析,所分離到的16個(gè)化合物結(jié)構(gòu)分別得以鑒定(如圖1)。

圖1 從云木香中分離得到的16個(gè)化合物Fig.1 16 compounds isolated from Saussurea costus

2.1.1化合物1無色針晶(丙酮)。ESI-MS為 255.1 [M+Na]+。1H-NMR (DMSO-d6,600 MHz)δ: 6.05 (1H,d,J=3.6 Hz,H-13a),5.66 (1H,d,J=3.6 Hz,H-13b),4.79 (1H,dd,J=11.2,3.6 Hz,H-1),4.74 (2H,m,H-5,6),2.61 (1H,m,H-7),2.31～2.20 (3H,m,H2-9,H-3a),2.09～2.05 (3H,m,H-3b,H2-2),1.95～1.91 (1H,m,H-8a),1.69～1.65 (1H,m,H-8b),1.63 (3H,s,CH3-15),1.34 (3H,s,CH3-14);13C-NMR (150 MHz,DMSO-d6)δ: 170.0 (C-12),140.6 (C-11),140.5 (C-4),137.0 (C-10),127.5 (C-1),126.2 (C-5),119.4 (C-13),81.2 (C-6),49.5 (C-7),40.4 (C-9),38.8 (C-3),27.1 (C-8),25.8 (C-2),17.0 (C-15),15.9 (C-14)?；衔?鑒定為木香烯內(nèi)酯。

2.1.2化合物2無色針晶(丙酮)。ESI-MS為 253.1 [M+Na]+。1H-NMR (CDCl3,600 MHz)δ: 6.26 (1 H,d,J=3.3 Hz,H-13a),5.53 (1H,d,J=3.3 Hz,H-13b),5.31 (1H,d,J=1.8 Hz,H-15a),5.11 (1 H,d,J=1.8 Hz,H-15b),4.94 (1H,br s,H-14a),4.86 (1H,br s,H-14b),4.00 (1H,t,J=9.3 Hz,H-6);13C-NMR (150 MHz,CDCl3)δ: 170.2 (C-12),151.2 (C-11),149.2 (C-4),139.7 (C-10),120.1 (C-13),112.6 (C-15),109.5 (C-14),85.2 (C-6),52.0 (C-5),47.6 (C-7),45.1 (C-1),36.2 (C-3),32.5 (C-9),30.9 (C-8),30.2 (C-2)?；衔?鑒定為脫氫木香內(nèi)酯。

2.1.3化合物3淡黃色膠狀物。ESI-MS為 271.1 [M+K]+。1H-NMR (CD3OD,600 MHz)δ: 6.01 (1H,d,J=3.1 Hz,H-13a),5.49 (1H,d,J=3.1 Hz,H-13b),4.93 (1H,s,H-15a),4.76 (1H,s,H-15b),4.06 (1H,t,J=10.9 Hz,H-6),2.63 (1H,m,H-7),0.89 (3H,s,CH3-14);13C-NMR (150 MHz,CD3OD,)δ:173.4(C-12),146.9 (C-4),141.8 (C-11),117.5 (C-13),109.5 (C-15),82.3 (C-6),56.5 (C-5),51.5 (C-7),43.2 (C-1),41.2 (C-3),40.2 (C-10),37.5 (C-9),24.5 (C-8),23.0 (C-2),18.8 (C-14)。化合物3鑒定為β-環(huán)木香烯內(nèi)酯。

2.1.4化合物4白色粉末。ESI-MS為 259.2 [M+Na]+。1H-NMR (CDCl3,600 MHz)δ: 5.16 (1H,s,H-13a),5.13 (1H,s,H-13b),4.72 (1H,d,J=1.3 Hz,H-15a),4.39 (1H,d,J=1.3 Hz,H-15b),4.33 (2H,s,H2-12),3.49 (1H,s,-OH),2.30 (1H,m,H-5),2.29～2.27 (1H,m,H-3b),2.03 (1H,m,H-3a);13C-NMR (150 MHz,CDCl3)δ: 154.3 (C-11),150.0 (C-4),110.5 (C-13),104.8 (C-14),74.1 (C-7),64.4 (C-12),43.4 (C-5),40.9 (C-1),36.4 (C-3),35.1 (C-6),35.6 (C-9),35.1 (C-10),32.1 (C-8),23.0 (C-2),14.9 (C-15)。化合物4鑒定為7α-木香醇。

2.1.5化合物5白色粉末。ESI-MS為 271.1 [M+Na]+。1H-NMR (CDCl3,600 MHz)δ: 6.09 (1H,d,J=3.1 Hz,H-13a),5.41 (1H,d,J=3.1 Hz,H-13b),4.99 (1H,s,H-15a),4.86 (1H,s,H-15b),4.03 (1H,t,J=10.9 Hz,H-6),3.53 (1H,dd,J=11.5,4.6 Hz,H-1),2.18 (1H,d,J=10.9 Hz,H-5),0.82 (3H,s,CH3-14);13C-NMR (150 MHz,CDCl3)δ: 170.8 (C-12),142.6 (C-4),139.4 (C-11),117.2 (C-13),110.8 (C-15),79.7 (C-6),78.4 (C-1),53.1 (C-5),49.7 (C-7),43.1 (C-10),35.8 (C-9),33.7 (C-3),31.5 (C-2),21.6 (C-8),11.8 (C-14)?；衔?鑒定為瑞諾木烯內(nèi)酯。

2.1.6化合物6白色粉末。ESI-MS為 273.1 [M+Na]+。1H-NMR (CD3OD,600 MHz)δ: 6.21 (1H,s,H-13a),5.50 (1H,s,H-13b),5.10 (1H,s,H-5),2.83～2.68 (2H,m,H-6,7),2.13 (1H,m,H-2a),1.99 (1H,m,H-3a),1.90 (1H,m,H-3b),1.81 (1H,dd,J=9.2,5.2 Hz,H-1),1.59～1.75 (3H,m,H-9a,H-9b,H-2b),1.54 (3H,s,CH3-15),1.17 (3H,s,CH3-14);13C-NMR (150 MHz,CD3OD)δ: 170.0 (C-12),145.8 (C-11),136.5 (C-4),124.4 (C-13),122.4 (C-5),73.8 (C-10),45.6 (C-1),42.9 (C-9),42.9 (C-7),37.6 (C-6),29.6 (C-3),25.9(C-8),25.1 (C-14),23.8 (C-15),23.1 (C-2)。化合物6鑒定為10α-羥基青蒿酸。

2.1.7化合物7無色油狀物。ESI-MS為 271.1 [M+Na]+。1H-NMR (CD3OD,600 MHz)δ: 5.13 (1H,s,H-15a),4.99 (1H,s,H-15b),4.94 (1H,s,H-14a),4.85 (1H,s,H-14b),3.94 (1H,t,J=9.7 Hz,H-6),3.61 (1H,td,J=9.3,5.4 Hz,H-8),2.96 (1H,m,H-1β),2.83 (1H,t,J=9.1 Hz,H-5),2.68 (1H,dd,J=12.6,5.3 Hz,H-9a),2.61 (1H,dq,J=10.7,7.1 Hz,H-11) 2.52～2.46 (2H,m,H-3a,3b),2.17～2.08 (1H,m,H-9b),1.95 (1H,m,H-2a),1.86 (1H,m,H-2b),1.33 (3H,d,J=7.1 Hz,CH3-13);13C-NMR (150 MHz,CD3OD)δ: 181.7 (C-12),153.5 (C-4),146.8 (C-10),114.2 (C-14),109.5 (C-15),82.3 (C-6),76.1 (C-8),56.4 (C-7),53.8 (C-5),48.4 (C-1),48.3 (C-9),42.7 (C-11),33.4 (C-2),31.0 (C-3),16.5 (C-13)?；衔?鑒定為8α-羥基-11β-11,13-二氫去氫海桑內(nèi)酯。

2.1.8化合物8白色粉末。ESI-MS為 485.3 [M+Na]+。1H-NMR (CDCl3,600 MHz)δ: 5.30 (1H,s,J=1.8 Hz,H-15a),5.07 (1H,s,J=1.8 Hz,H-15b),4.93 (1H,s,H-15′a),4.84 (1H,s,H-14a),4.77 (1H,s,H-14b),4.67 (1H,s,H-15′b),4.03 (1H,t,J=9.6 Hz,H-6),3.85 (1H,dd,J=10.7,4.3 Hz,H-12′a),3.80 (1 H,dd,J=10.7,7.2 Hz,H-12′b),3.12 (1H,t,J=9 Hz,H-5),2.95 (1H,m,H-7),2.86 (1H,m,H-1),2.75 (1H,s,H-6′a),2.53 (2H,m,H-3),2.49 (1H,m,H-11′),2.48 (1H,m,H-5′),2.46 (1H,s,H-9a),2.32 (1H,m,H-3′a),2.28 (1H,s,H-6′b),2.09～2.03 (1H,m,H-1),1.97～1.89 (5H,m,H-2a,H-3′b,H-9b,H-13a,H-13′a),1.84～1.75 (3H,m,H-2′,H-13b),1.82 (1H,m,H-8),1.78 (1H,m,H-13′b),1.44 (1H,m,H-1′b,H-2′b),1.25 (1H,m,H-2b),0.91 (1H,s,CH3-14′);13C-NMR (150 MHz,CDCl3)δ: 202.7 (C-16),180.8 (C-12′),159.6 (C-12),152.8 (C-4),152.0 (C-4′),150.6 (C-10),147.8 (C-10′),130.6 (C-14′),111.5 (C-14),109.7 (C-15′),108.3(C-15),84.1 (C-6),64.5 (C-6′),51.8 (C-5′),50.1 (C-5),47.9 (C-7),47.0 (C-1′),46.2 (C-1),44.9 (C-11),43.5 (C-13),38.0 (C-7′),35.9 (C-9),33.4 (C-11′),32.8 (C-9′),31.4 (C-3),30.2 (C-17),29.8 (C-2′),29.4 (C-3′),24.1 (C-2),22.8 (C-8′),21.0 (C-8),15.4 (C-13′)?；衔?鑒定為Vlasouliolide B。

2.1.9化合物9白色粉末。ESI-MS為 271.1 [M+Na]+。1H-NMR (CD3OD,600 MHz)δ: 5.94 (1H,d,J=3.2 Hz,H-13a),5.43 (1H,d,J=3.2 Hz,H-13b),5.31 (1H,m,H-3),3.97 (1H,t,J=11.0 Hz,H-6),3.55 (1H,dd,J=10.1,6.7 Hz,H-1),2.51 (1H,m,H-7),2.33 (1H,m,H-5),2.26 (1H,m,H-2α),2.06～2.00 (1H,m,H-8α),2.04 (1H,m,H-9β),1.97 (1H,m,H-2β),1.76 (3H,s,H-15),1.64～1.56 (1H,m,H-8β),1.30～1.24 (1H,m,H-9α),0.81 (3H,s,H-14);13C-NMR ( 150 MHz,CD3OD)δ: 172.9 (C-12),141.1 (C-11),134.8 (C-4),123.0 (C-3),117.2 (C-13),83.6 (C-6),76.0 (C-1),52.5 (C-5),52.3 (C-7),42.3 (C-10),35.7 (C-9),33.6 (C-2),23.8 (C-15),22.3 (C-8),11.5(C-14)?；衔?鑒定為珊塔瑪內(nèi)酯。

2.1.10化合物10淡黃色粉末。ESI-MS為 273.1 [M+Na]+。1H-NMR (CD3OD,600 MHz)δ: 3.42 (1H,dd,J=12.2,3.5 Hz,H-1),3.33 (1H,s,OH),2.39 (1H,dq,J=11.6,3.3 Hz,H-11),2.18 (1H,m,H-3),2.05 (1H,m,H-3),1.98 (1H,m,H-9b),1.92 (1H,m,H-8),1.80 (3H,s,CH3-15),1.77～1.67 (1H,m,H-2a),1.67～1.61 (2H,m,H-2b),1.57 (1H,m,H-8),1.32 (1H,m,H-9a),1.16 (3H,d,J=6.9 Hz,CH3-13),0.93 (3H,s,CH3-14);13C-NMR (150 MHz,CD3OD)δ: 181.4 (C-12),131.1 (C-5),126.3 (C-4),84.5 (C-6),78.5 (C-1),54.4 (C-7),43.2 (C-10),42.0 (C-11),39.7 (C-9),34.5 (C-3),27.8 (C-2),25.2 (C-8),19.9 (C-15),18.9 (C-14),12.6(C-13)。化合物10鑒定為草蒿素。

2.1.11化合物11亮黃色油狀。ESI-MS為 319.3 [M+K]+。1H-NMR (CDCl3,600 MHz)δ: 7.38～6.83 (6H,m,Ar-H),5.99 (2H,m,H-8,8′),5.16～5.04 (5H,m,H2-9,9′,OH),3.88 (3H,s,OCH3),3.43 (2H,d,J=6.6 Hz,H2-7),3.35 (2H,d,J=6.6 Hz,H2-7′);13C-NMR (150 MHz,CDCl3)δ: 157.4 (C-4),151.2 (C-2′),138.2 (C-8′),136.9 (C-8),132.5 (C-5′),130.9 (C-2),130.6 (C-6′),130.6 (C-5),129.4 (C-1),129.1 (C-3),128.6 (C-1′),128.3 (C-6),116.3 (C-9′),115.9 (C-9),115.8 (C-4′),111.3 (C-3′),55.9 (OCH3),39.8 (C-7′),34.6 (C-7)?；衔?1鑒定為4-O-和厚樸酚。

2.1.12化合物12無色蠟狀固體。ESI-MS為 395.3 [M+H]+。1H-NMR (CDCl3,600 MHz)δ: 7.54 (2H,d,J=8.6 Hz,H-6,6′),7.36 (2H,d,J=2.4 Hz,H-3,3′),7.13 (2H,dd,J=8.6,2.4 Hz,H-5,5′),1.34 (18H,s,H3-12～14,12′～14′),1.29 (18H,s,H-8～10,8′～10′);13C-NMR (150 MHz,CDCl3)δ: 147.8 (C-1,1′),147.2 (C-4,4′),138.7 (C-2,2′),124.6 (C-3,3′),124.1 (C-5,5′),119.3 (C-6,6′),35.0 (C-7,7′) ,34.7 (C-11,11′),31.6 (C-12,13,14,12′,13′,14′),30.3 (C-8,9,10,8′,9′,10′)?；衔?2鑒定為2,2-氧雙(1,4)-二叔丁基苯。

2.1.13化合物13白色無定型粉末狀。ESI-MS為 501.2 [M+HCOO]-。1H-NMR (DMSO-d6,600 MHz)δ: 12.05 (1H,s,OH-28),4.65 (1H,d,J=2.1 Hz,H-29b),4.56 (1H,d,J=1.3 Hz,H-29a),1.63 (3H,s,CH3-30),0.94 (3H,s,CH3-27),0.88 (3H,s,CH3-26),0.87 (3H,s,CH3-23),0.77 (3H,s,CH3-25),0.66 (3H,s,CH3-24);13C-NMR (150 MHz,DMSO-d6)δ: 177.2 (C-28),150.3 (C-20),109.6 (C-30),76.8 (C-3),55.4 (C-17),54.9 (C-5),49.9 (C-10),48.5(C-19),46.6 (C-18),42.0 (C-14),40.2 (C-8),38.5 (C-1),37.6 (C-4),37.6 (C-13),36.7 (C-9),36.1 (C-22),33.3 (C-7),31.7 (C-16),29.5 (C-21),28.1 (C-15),27.5 (C-23),27.2 (C-2),26.5 (C-12),19.8 (C-11),18.9 (C-29),17.3 (C-6),15.9 (C-25),15.8 (C-24),15.7 (C-26),14.4 (C-27)。化合物13鑒定為樺木酸。

2.1.14化合物14白色粉末。ESI-MS為 205.1 [M+Na]+。1H-NMR (CDCl3,600 MHz)δ: 9.83 (1H,s,CHO),7.16 (2H,s,H-2,H-6),6.08 (1H,s,OH),3.98 (6H,s,OCH3);13C-NMR (150 MHz,CDCl3)δ: 190.9 (-CHO),147.5 (C-3,C-5),140.9 (C-4),128.2 (C-1),106.8 (C-2,C-6),56.6 (OCH3)。化合物14鑒定為4-羥基-3,5-二甲氧基苯甲醛。

2.1.15化合物15淺黃色固體。 ESI-MS為127.2 [M+H]+。1H-NMR (CD3OD,600 MHz)δ: 9.54 (1H,s,-CHO),7.38 (1H,d,J=3.6 Hz,H-3),6.58 (1H,d,J=3.6 Hz,H-4),4.61 (2H,s,H2-6);13C-NMR (150 MHz,CD3OD)δ: 179.6(-CHO),163.4 (C-5),154.1 (C-2),125.1 (C-3),110.9 (C-4),57.8 (C-6)?；衔?5鑒定為5-羥甲基糠醛。

2.1.16化合物16淡黃色針狀結(jié)晶。ESI-MS為269.0 [M+Na]+。1H-NMR (CDCl3,600 MHz)δ: 8.09 (1H,d,J=9.7 Hz,H-4),7.66 (1H,d,J=2.1 Hz,H-2),7.08 (1H,d,J=2.1 Hz,H-3),6.37 (1H,d,J=9.7 Hz,H-3),4.15 (3H,s,C5-OCH3),4.03 (3H,s,C6-OCH3);13C-NMR (150 MHz,CDCl3)δ: 161.0 (C-2),150.0 (C-9),145.6 (C-2′),144.6 (C-5),143.4 (C-7),140.1 (C-4),135.3 (C-6),114.3 (C-3),113.9 (C-8),109.6 (C-10),104.5 (C-3′),62.6 (C6-OCH3),61.4 (C5-OCH3)?；衔?6鑒定為茴芹內(nèi)酯。

2.2 活性測試

化合物的抗HF活性測試結(jié)果(表1)表明,與空白對(duì)照比較,多數(shù)化合物對(duì)LX-2細(xì)胞的增殖有不同程度的抑制作用。其中,化合物2、8、9及11在考察的濃度范圍內(nèi)可以更加有效抑制LX-2細(xì)胞的增殖,其IC50依次為14.86、51.09、47.23及40.84 μmol/L;從活性數(shù)據(jù)來看,愈創(chuàng)木烷型化合物的活性相對(duì)突出,其中的化合物2具有最為顯著的LX-2細(xì)胞增殖抑制作用;桉烷類倍半萜9雖然也表現(xiàn)出了一定的LX-2細(xì)胞增殖抑制作用,但該類結(jié)構(gòu)中的其它化合物活性則相對(duì)較弱。

表1 不同濃度分離化合物對(duì)LX-2的細(xì)胞存活率及IC50 的影響Tab.1 Effect of different concentrations of isolated compounds on LX-2 cell survival rates and IC50

3 討論

HF是各種急慢性肝損傷引起的以炎癥反應(yīng)和在肝臟中由于膠原累積形成過量細(xì)胞外基質(zhì)(extracellular matrix,ECM)為主要損傷修復(fù)特點(diǎn)的病理過程[7]。目前抗HF的方法主要包含中醫(yī)療法、西醫(yī)療法、中西醫(yī)結(jié)合治療以及其它療法,中醫(yī)治療主要采用中藥復(fù)方(膈下逐瘀湯、鱉甲煎丸)、中藥單體(大黃素、五味子素)以及針灸療法,西醫(yī)治療采用抗HF治療、抗病毒治療(核苷類藥物、微生態(tài)制劑聯(lián)用及干擾素聯(lián)合抗病毒治療),雖然藥物品種繁多,但尚無有效根治HF的藥物[7]。

HF的形成機(jī)制比較復(fù)雜,涉及多種因素。其中,HSC增殖活化激活后并轉(zhuǎn)化為肌成纖維細(xì)胞是HF的中心環(huán)節(jié)[8];在正常生理?xiàng)l件下肝臟中HSC處于靜息狀態(tài),當(dāng)肝臟受到外界刺激時(shí)靜息的HSC會(huì)被激活,并表現(xiàn)出明顯的細(xì)胞增殖[8]。因此,抑制HSC的活化和增殖為抗HF藥物研發(fā)提供了思路。

人HSC株 LX-2細(xì)胞是從正常人的肝臟中分離出來并在低血清條件下進(jìn)行培養(yǎng)而得來的HSC,與人體內(nèi)激活的HSC極為相似,是抗HF藥物篩選的重要工具[8]。本課題組前期預(yù)實(shí)驗(yàn)抗HF藥物篩選中發(fā)現(xiàn),云木香的氯仿萃取物對(duì)人HSC株 LX-2細(xì)胞的增殖具有顯著的抑制作用,但是其抗HF活性物質(zhì)尚未可知。本研究以抗HSC增殖的抑制活性為導(dǎo)向,對(duì)云木香的二氯甲烷部位進(jìn)行了化學(xué)成分研究,從中分離得到了16個(gè)化合物,將分離化合物的波譜數(shù)據(jù)與國內(nèi)外研究[9-24]分別比對(duì)最終確定化合物1～16的結(jié)構(gòu)歸屬。其中化合物1～10為倍半萜類化合物(化合物8為二聚倍半萜),是其中的主要化合物;化合物13為三萜類化合物;化合物11和16為苯丙素類化合物;這些倍半萜類成分以桉烷型(化合物3、4、5、9及10)為主,并同時(shí)包括愈創(chuàng)木烷型(化合物2、7及8)、杜松烷型(化合物6)和吉瑪烷型(化合物1)倍半萜;在這些化合物中,化合物4、11、12及16為首次從云木香中分離得到;從16個(gè)化合物的LX-2細(xì)胞增殖抑制作用來看,化合物2、8、9及11活性相對(duì)突出,可能是云木香的主要抗HF活性成分;從化合物8的結(jié)構(gòu)看,二聚體的存在似乎對(duì)愈創(chuàng)木烷類倍半萜的活性有利,這與二聚倍半萜的特殊作用相一致[25]。同時(shí),不飽和環(huán)外雙鍵五元內(nèi)酯環(huán)結(jié)構(gòu)可能是該類結(jié)構(gòu)中的化合物2活性最強(qiáng)的主要原因。在5個(gè)桉烷性倍半萜中,具有該類結(jié)構(gòu)的化合物5和9均有不同程度的HSC增殖抑制活性,而無該結(jié)構(gòu)的化合物4和10則沒有活性,說明該結(jié)構(gòu)對(duì)此類化合物的HSC增殖抑制活性至關(guān)重要。另一方面,構(gòu)效關(guān)系分析表明,相較于Δ3(15)雙鍵(化合物5),Δ3雙鍵(化合物9)對(duì)活性更有利。這些構(gòu)效關(guān)系的發(fā)現(xiàn)對(duì)倍半萜抗HF的研究提供參考。有關(guān)這些化合物抗HF機(jī)制的研究對(duì)該類化合物抗HF的藥物研發(fā)也將產(chǎn)生重要影響。