組蛋白乙酰轉移酶P300和去乙酰化酶SIRT2在乳腺浸潤性導管癌中的表達*

段彥林, 金柔, 梅思思, 田世維, 黃玉鑫, 徐澍**

(1.貴州醫科大學附屬醫院 病理科, 貴州 貴陽 550004; 2.黔南州中醫醫院 病理科, 貴州 黔南 558000)

乳腺癌是全球女性最常見的癌癥,目前我國乳腺癌的發病率有逐年上升趨勢[1]。表觀遺傳學發現,乙酰化失調可導致癌癥的發生,組蛋白乙酰轉移酶和組蛋白去乙酰化酶分別催化乙酰化和去乙酰化過程,兩者的高度動態平衡維持著正常的生理機能[2-3],組蛋白乙酰轉移酶P300是一種具有乙酰化活性的轉錄共激活子,可乙酰化多種組蛋白和非組蛋白,P300對非組蛋白的乙酰化作用可以增強與相應啟動子的結合,從而激活轉錄活性[4],組蛋白去乙酰化酶SIRT2是一種依賴煙酰胺腺嘌呤二核苷酸去乙酰化酶,在生物的代謝、凋亡和基因轉錄等生命活動中起著重要作用[5]。目前關于P300和SIRT2蛋白在乳腺癌中的研究鮮有文獻報道,本研究通過免疫組化的方法檢測乳腺浸潤性導管癌組織中P300和SIRT2蛋白的表達情況,探討P300和SIRT2蛋白與乳腺癌臨床病理特征的關系,以發現其在乳腺癌中可能存在的發病機制,為研究乳腺癌治療新靶點提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1臨床資料 隨訪病理科2012年1月1日—2017年12月31日診斷的乳腺癌患者,完善患者年齡、月經情況、腫瘤最大徑等相關臨床資料,最終選取確診前未經放化療且有足夠組織蠟塊的385例患者做為病例組,收集同期癌旁2 cm以上乳腺組織蠟塊36例作為對照組。385例乳腺癌患者齡27～84歲、平均50歲,患者隨訪時間最長者為113個月、平均隨訪時間62個月,隨訪期間無復發患者339例(88.1%)、有復發患者46例(11.9%),無轉移患者379例(98.4%)、有轉移患者6例(1.6%),生存患者358例(93%)、死亡患者27例(7%)。提取病例組病理診斷存檔切片,由兩位乳腺病理專業主任醫師根據《中國抗癌協會乳腺癌診治指南與規范(2021年版)》[6],采用雙盲法對乳腺癌病理診斷和病理組織學分級進行復診,重新判讀乳腺癌分子分型。

1.1.2主要試劑 兔抗人多克隆抗體KAT3B/P300(型號ab275379)、兔抗人單克隆抗體SIRT2(型號ab19388)、HRP多聚體二抗,均購自英國Abcam公司;一抗稀釋液,PBS磷酸鹽緩沖液均購自北京中杉金橋公司;酒精、蘇木素、二甲苯、3%過氧化氫均購自貴州永博鑫公司。

1.2 研究方法

1.2.1組織芯片及免疫組化 組織蠟塊對照存檔切片中選定位置進行定位,用打孔器套出蠟塊中組織柱,選取高度相近的組織柱按編號順序,經修整、包埋制成組織芯片[7]。組織芯片經切片、烤片、脫蠟、水化后采用En Vision二步法進行免疫組化染色[8]。EDTA(pH 8.0)120 ℃高壓修復3 min,冷卻后PBS沖洗3次,每次5 min,滴加3%過氧化氫孵育30 min,PBS沖洗3次,每次3 min,滴加一抗(KAT3B/P300檢測滴度為1∶300,SIRT2檢測滴度為1∶6 000),37 ℃溫箱孵育1 h后PBS沖洗3次,每次5 min;加二抗溫箱孵育1 h,PBS沖洗后DAB顯色3 min,經蘇木素復染,梯度酒精脫水,二甲苯透明后封固。

1.2.2結果判讀 P300和SIRT2在胞核和(或)胞漿中出現粗顆粒狀、片狀黃色或棕黃色著色為陽性。由兩位病理醫師按雙盲法隨機選取10個高倍視野,計數1 000個上皮細胞,以染色強度(無表達為0分,點狀淡黃色為1分,粗顆粒狀和片狀黃色為2分,棕黃色為3分)和陽性細胞百分比(<1%為0分,1%～25%為1分,26%～50%為2分,51%～75%為3分,>75%為4分)的乘積為免疫組化結果評分(IRS)[8]。P300:IRS≤8分為低表達,>8分為高表達[9];SIRT2:IRS≤3分為低表達,>3分為高表達[10]。

1.3 統計學分析

采用SPSS 23.0軟件對實驗數據進行統計分析,計數資料以n(%)表示,率的比較采用χ2檢驗,相關性分析采用Spearman相關性進行檢測,運用 Kaplan-Meier和Log rank test統計學方法分析P300和SIRT2蛋白與乳腺癌預后的相關性,以P<0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 P300和SIRT2蛋白在病例組及對照組中的表達

病例組中P300蛋白的低表達率高于對照組,SIRT2蛋白的低表達率低于對照組,差異均有統計學意義(P<0.05)。見表1、圖1。

注：A為P300蛋白低表達,B為P300蛋白高表達,C為SIRT2蛋白高表達,D為SIRT2蛋白低表達。

表1 P300和SIRT2蛋白在病例組和對照組中的表達[n(%)]Tab.1 Expressions of P300 and SIRT2 proteins in case group and control group[n(%)]

2.2 病例組患者P300蛋白表達及其與臨床病理特征的關系

病例組組織中P300蛋白表達結果顯示:腫瘤最大徑>5 cm的低表達率明顯高于≤5 cm組(P<0.001),TNM分期Ⅲ～Ⅳ期的低表達率高于Ⅰ～Ⅱ期、有淋巴結轉移的低表達率高于無淋巴結轉移、Ki67高表達的低表達率高于Ki67低表達,差異有統計學意義(P<0.05);P300蛋白表達在患者年齡、月經情況、組織學分級中比較,差異均無統計學意義(P>0.05)。見表2。P300蛋白在LuminalB型中的低表達率高于三陰性乳腺癌(triple negative breast cancer,TNBC),差異有統計學意義(P<0.05)。見表3。

表2 P300和SIRT2蛋白表達與乳腺癌臨床病理特征的關系[n(%)]Tab.2 Relationship between P300 and SIRT2 proteins expression and clinicopathological

表3 P300蛋白表達與乳腺癌分子分型的關系[n(%)]Tab.3 Relationship between P300 protein expression and molecular subtypes of breast cancer[n(%)]

2.3 病例組患者SIRT2蛋白表達及其與臨床病理特征的關系

病例組組織中SIRT2蛋白表達結果顯示:在組織學分級3級中的低表達率低于1～2級、腫瘤最大徑>5 cm的低表達率低于≤5 cm、Ki67高表達的低表達率低于Ki67低表達,差異有統計學意義(P<0.05);SIRT2蛋白表達在患者年齡、月經情況、TNM分期和淋巴結轉移中的比較,差異均無統計學意義(P>0.05)。見表2。SIRT2蛋白在LuminalA型和LuminalB型中的低表達率低于HER2陽性型和TNBC,差異有統計學意義(P<0.05)。見表4。

表4 SIRT2蛋白表達與乳腺癌分子分型的關系[n(%)]Tab.4 Relationship between SIRT2 protein expression and molecular subtypes of breast cancer[n(%)]

2.4 病例組P300和SIRT2蛋白表達的相關性

病例組中P300和SIRT2蛋白的表達呈負相關,差異有統計學意義(r=-1.77,P<0.001)。

2.5 病例組患者P300和SIRT2蛋白表達及其與預后的關系

應用 Kaplan-Meier和Log-rank test統計學方法,分析P300和SIRT2蛋白表達與病例組患者無病生存期(disease-frec survival,DFS)和總生存時間(overll survival,OS)的關系,結果顯示,P300蛋白低表達比高表達DFS短,總體無病生存率低,差異有統計學意義(P<0.05);SIRT2與乳腺癌患者預后無關(P>0.05)。見圖2。

圖2 P300和SIRT2蛋白乳腺癌預后的關系Fig.2 Relationship between P300 and SIRT2 protein in prognosis of breast cancer

3 討論

根據2021年國際癌癥研究機構發布的最新全球癌癥報告顯示,2020年全球185個國家新發乳腺癌2 261 419例,約占新發癌癥總數的11.7%,首次超過肺癌成為最常見的癌癥[1]。近年來,表觀遺傳學變化已公認為是導致乳腺癌進展的主要原因,表觀遺傳學中組蛋白乙酰化是在核心組蛋白尾部結構域內的賴氨酸殘基末端添加乙酰基部分,中和了正電荷,減少DNA和組蛋白之間的靜電吸附作用形成松弛的染色質,使轉錄因子更易與DNA結合,從而促進基因轉錄[2]。相反,組蛋白去乙酰化形成了致密的染色質,使DNA啟動子上的轉錄蛋白不可接近而導致轉錄失活。組蛋白的乙酰化反應受組蛋白乙酰化轉移酶和組蛋白去乙酰化酶控制,在腫瘤發生過程中,精細調節的乙酰化狀態受損,使正常細胞的增殖、分化和凋亡發生變化,進而轉化為惡性細胞,同時通過降低細胞的粘附、促進細胞遷移、侵襲和血管生成導致癌癥的進一步發展[2]。除此之外,組蛋白去乙酰化酶還可以對負責細胞分化和周期調控的抑癌基因進行沉默,使細胞缺乏分化,增殖失控,從而導致腫瘤的發生[8]。組蛋白乙酰化轉移酶和組蛋白去乙酰化酶表觀遺傳調控的可逆性使其成為治療癌癥的誘人靶點[2]。

P300蛋白是由EP300基因編碼的組蛋白乙酰化轉移酶,可以乙酰化許多組蛋白和非組蛋白,以調節與細胞生長、發育和腫瘤發生有關的許多信號通路,包括鈣信號、缺氧應激、Notch信號和NF-κB信號通路等[11]。在乳腺癌中,BRCA1是當前研究比較成熟的腫瘤抑制基因,BRCA1蛋白在細胞周期調控、DNA 損傷修復、基因轉錄激活、抑制細胞生長等方面發揮著作用[12];P53蛋白是對細胞凋亡和細胞周期調節基因起調控作用的腫瘤抑制因子,P53的激活可以促進依賴性細胞凋亡[13],P300可促進BRCA1和P53這兩個真正的腫瘤抑制因子發揮腫瘤抑制作用,使細胞周期保持正常,保證DNA受損后可以程序化凋亡[14]。在乳腺和結直腸原發性腫瘤和細胞系中,發現P300基因失活與癌癥的發生相關[15]。在口腔癌和宮頸癌細胞系中也發現P300基因突變,在引入正常的P300基因后,細胞增殖減少[16],這些研究都提示P300具有腫瘤抑制功能。在本研究中,對比癌旁組織,乳腺癌組織中P300蛋白低表達(P<0.05);P300蛋白在腫瘤直徑大、TNM分期高、有淋巴結轉移和Ki67高表達的乳腺浸潤性導管癌中低表達(P<0.05),P300蛋白低表達的乳腺癌患者DFS短(P<0.05),表明P300蛋白可能抑制乳腺乳腺浸潤性導管癌的發生、發展。

SIRT2是Sirtuins蛋白家族成員之一,Sirtuins家族參與一些重要的生理過程,如參與調節細胞代謝、增殖、凋亡、DNA損傷修復、細胞應激、基因表達調控等。SIRT2作為組蛋白去乙酰化酶,通過使不同的底物蛋白去乙酰化,發揮其生理和病理作用的重要功能。SIRT2可以使P53去乙酰化,降低其轉錄活性,并導致阻斷P53依賴性凋亡以響應DNA損傷,促進細胞增殖,SIRT2基因敲除可誘導P53的積累并促進癌細胞凋亡[13]。叉頭框蛋白O3(forkhead box protein O3,FOXO3)是一種腫瘤抑制因子,參與細胞周期控制以及抗氧化和DNA損傷修復途徑,SIRT2對FOXO3的去乙酰化導致其泛素化和隨后的降解,從而促進細胞周期進展并促進癌癥的發生[17]。SIRT2可以促進線粒體代謝,抑制E-鈣蛋白途徑,從而促進癌細胞的侵襲[18];SIRT2使微管蛋白去乙酰化,促進細胞運動[19];另有研究發現,SIRT2可以增強腫瘤細胞突破基底膜的能力,使腫瘤細胞獲得高侵襲能力[20];SIRT2在基底樣型乳腺癌(basal-like breast cancer,BLBC)樣本中被擴增并高度表達,它與Slug蛋白相互作用并使其脫乙酰化,并促進蛋白酶體降解Slug,從而促進癌細胞的侵襲[21];通過促進乳腺癌小鼠模型中的C-MYC泛素化和降解,抑制SIRT2也顯示出抗癌作用[22]。在以往的研究發現,SIRT2在胃癌、結直腸癌、干細胞樣腎細胞癌細胞中高表達[5]。在本研究中,與癌旁組織相比,SIRT2蛋白在乳腺浸潤性導管癌組織中的低表達率低(P<0.05),在組織學分級高、腫瘤直徑大和Ki67高表達組織中的低表達率低(P<0.05),表明SIRT2可能促進乳腺浸潤性導管癌的發生、發展。SIRT2在Luminal型中的低表達率,低于其在HER2陽性型和TNBC中的低表達率(P<0.05)。Luminal型乳腺癌特征是ER/PR的表達,SIRT2作為一種組蛋白去乙酰化酶可能會影響性激素受體在乳腺癌中的表達[23],進一步表明SIRT2高表達是乳腺癌發生的一個危險因素,但具體作用機制仍待更多的研究證明。P300和SIRT2作為組蛋白乙酰化轉移酶和去乙酰化酶,兩者的高速動態平衡維持著細胞的正常生理功能,本實驗中SIRT2和P300呈負相關,表明兩者在乙酰化機制中互相拮抗,與以往研究一致。

綜上所述,P300和SIRT2蛋白可能與乳腺浸潤性導管癌的發生、發展相關,P300蛋白低表達可能提示乳腺浸潤性導管癌患者預后較差。