板栗花抑制植物病原真菌成分提取及活性研究

靳長迎 謝巧玲 彭飛，2，4 王秀平 楊越冬，2，4，*

（1河北省天然產物活性成分與功能重點實驗室，河北 秦皇島 066004；2板栗產業技術教育部工程研究中心，河北 秦皇島 066004；3河北科技師范學院分析測試中心，河北 秦皇島 066004；4河北省板栗產業協同創新中心，河北 秦皇島 066004）

在板栗（Castaneamollissima）工業生產過程中，通常會產生大量副產品，如花、栗蓬、葉子和殼［1］。對這些廢棄物進行開發，將其轉化為有價值的生物資源，既能獲得經濟效益、生態效益和社會效益，又能促進板栗產業的良性發展［2］。其中，板栗花具有抗炎［3］、抗氧化［4］、抗腫瘤［5］、抗疲勞［6］、抗菌［7］等多種生理活性，酚類、黃酮類［8］化合物作為其主要活性成分，具有潛在的研究價值。

植物病原真菌所引起的植物病害，如小麥赤霉病［9］、油菜菌核病［10］以及黃瓜枯萎病［11］等會導致作物產量和質量降低。化學殺菌劑是控制植物病害的主要手段，但長期、大量使用單一殺菌劑會導致環境污染及病原物抗藥性的產生［12］。開發新型植物源天然抗菌劑是解決這些問題的有效手段，有研究表明，歐洲栗（Castaneasativa）水提液對哈維弧菌（Vibrioharvey）、損傷弧菌（V.damage）、輪狀弧菌（Vibriorotunda）、蘇云金芽孢桿菌（Bacillusthuringiensis）具有抑菌效果［13］。板栗花中富含黃酮類化合物，且大部分為水溶性和醇溶性［14］，作為板栗廢棄物的一種，板栗花產量巨大且具有可觀的開發利用價值。以往研究大都集中在板栗花中黃酮類物質的提取研究上，且提取過程較繁瑣，未見對板栗花中抑菌活性成分提取工藝優化的研究。

本研究采取乙醇水溶液提取板栗花中的活性成分，結合單因素-響應面法對板栗花活性成分進行提取工藝優化，并對板栗花各相萃取物進行活性成分含量測定，比較其抑菌活性，得到活性最強的組分，旨在為作物病害防治、植物源抗菌劑開發提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

新鮮板栗雄花采自河北省秦皇島市撫寧區大新寨鎮柳樹溝村板栗示范園，所有材料均于2021年6月收獲。樣品洗凈，室外曬干，打粉過40目篩備用；小麥赤霉病菌（Fusariumgraminearum，FG）由華中農業大學微生物資源發掘與利用全國重點實驗室（湖北省武漢市）提供，油菜菌核病菌（Sclerotiniasclerotiorum，SS）由中國農業科學院油料作物研究所（湖北省武漢市）提供，黃瓜枯萎病菌（Fusariumoxysporum.sp.cucumebriumOwen，FO）由海南省農業科學院農業環境與植物保護研究所提供，以上真菌于4 ℃馬鈴薯葡萄糖瓊脂培養基（potato dextrose agar，PDA）上儲存；二甲基亞砜（dimethyl sulfoxide，DMSO），購自上海埃彼化學試劑有限公司；無水乙醇（分析純），購自上海泰坦化學有限公司。

1.2 主要儀器與設備

HH-4數顯恒溫水浴鍋，江蘇金壇市榮華儀器制造有限公司；3-18KS冷凍離心機，德國SIGMA公司；EYELAN-1100旋轉蒸發儀，日本東京理化公司；Alpha 2-4 LD plus冷凍干燥機，德國CHRIST公司。

1.3 試驗方法

1.3.1 板栗花活性成分的提取 精確稱取板栗花粉末10.00 g，以15∶1 mL·g-1的液料比加入50%（V/V）體積分數乙醇水溶液，在60 ℃水浴下提取60 min，重復提取兩次，提取液在8 000 r·min-1下離心5 min，抽濾，減壓濃縮，真空冷凍干燥12 h，得到板栗花粗提物。

1.3.2 板栗花提取物對3種真菌的抑菌活性 將真菌菌餅接種到含有不同濃度板栗花提取物的PDA上，使得每個培養皿中板栗花樣品最終濃度為0.50、1.00、2.00、4.00、8.00 mg·mL-1。每個處理設4個培養皿作為重復，試驗重復3次。以含有200 μg·mL-1農藥吡唑醚菌酯的PDA作為陽性對照；含有1% （V/V）DMSO的PDA作為溶劑對照。在（28±1）℃培養3～5 d后，觀察到真菌菌絲在PDA表面擴散生長，此時測量菌絲生長平均直徑的減少，根據公式（1）計算板栗花活性成分對FG、SS、FO的菌絲生長抑制率：

式中，dc為空白組菌絲生長平均直徑（cm）；dt為處理組菌絲生長平均直徑（cm）。

1.3.3 單因素試驗 稱取10.00 g板栗花樣品，利用單因素試驗考察不同乙醇體積分數［0%、10%、30%、50%、70%、90%（V/V）］、提取時間（20、40、60、80、100 min）、提取溫度（40、50、60、70、80 ℃）、液料比（10∶1、15∶1、20∶1、25∶1、30∶1 mL·g-1）對板栗花活性成分抑菌活性的影響。菌絲生長抑制率按公式（1）計算。

1.3.4 Box-Behnken響應面設計 根據單因素試驗結果，以乙醇體積分數（A）、提取時間（B）、提取溫度（C）、液料比（D）為考察因素，以菌絲生長抑制率為響應值，采用Box-Behnken設計法進行響應面試驗設計，用Design Expert 8.0.6進行數據分析，進一步優化板栗花活性成分提取工藝條件。

1.3.5 板栗花提取物萃取分離 在最佳提取工藝下進行提取，得到板栗花提取物總膏200 g，用蒸餾水溶解，依次用石油醚、乙酸乙酯、正丁醇萃取2 d，得到水相、石油醚相、乙酸乙酯相和正丁醇相萃取物。

1.3.6 板栗花各相萃取物總酚和總黃酮含量測定總酚含量根據福林酚法［15］測定。精確稱取1.00 mg沒食子酸（gallic acid，GA）加入無水乙醇中，配成100 μg·mL-1的沒食子酸儲備液。分別取5、10、15、20、25、30 μL沒食子酸儲備液于96孔板中，用去離子水定容至120 μL，加入0.5 mol·L-1的福林酚試劑 20 μL，放置10 min，加入60 μL的Na2CO3水溶液（100 g·L-1），20 ℃避光放置2 h。使用酶標儀在765 nm處測定溶液的吸光度值。繪制沒食子酸的標準曲線，樣品的多酚含量按公式（2）計算，結果以沒食子酸質量的平均值（mg GA·g-1）表示：

式中，W為每克干重提取物的沒食子酸質量（mg GA·g-1）；c為沒食子酸質量濃度（μg·mL-1）；V為原料液的體積（mL）；M為取樣量（g）；N為稀釋倍數。

總黃酮含量用NaNO2-Al（NO3）3法［16］測定。首先，精確稱取1.00 mg蘆丁（rutin），配制質量濃度為0.20 mg·mL-1的蘆丁標準溶液，向容量瓶中分別加入0.00、1.00、2.00、3.00、4.00、5.00 mL蘆丁標準溶液，加入蒸餾水定容至5.00 mL，再加入0.30 mL質量分數為5%的NaNO2水溶液，靜置6 min。加入0.30 mL質量分數為5%的Al（NO3）3水溶液，混勻，室溫靜置6 min。加入4.40 mL質量分數為5%的NaOH溶液，混勻放置12 min。取200 μL混合液至96孔板中，使用酶標儀在510 nm處測定溶液的吸光度值。繪制蘆丁的標準曲線，樣品的黃酮含量按公式（3）計算，結果以每克干重提取物的蘆丁質量的平均值（mg rutin·g-1）表示：

式中，W為每克干重提取物的蘆丁質量（mg rutin·g-1）；c為蘆丁質量濃度（g·L-1）；V為原料液的體積（mL）；M為取樣量（g）；N為稀釋倍數。

1.3.7 板栗花各相萃取物的抑菌活性比較 采用菌絲生長速率法，將真菌菌餅接種到含有不同濃度板栗花萃取物的PDA上，使得各相萃取物的最終濃度都為1.00、2.00、3.00、4.00、5.00 mg·mL-1。后續操作同1.3.2。計算板栗花各相萃取物的菌絲生長抑制率。

1.4 數據分析

使用Data Processing System 7.05軟件進行數據分析，得到抑制中濃度值（50% effective concentration，EC50）。采用方差分析檢驗組間差異。

2 結果與分析

2.1 板栗花提取物對3種真菌的抑菌活性

板栗花提取物對FG、SS、FO菌絲生長抑制率的結果見表1。在高濃度下，FG、SS、FO菌絲生長均受到抑制，板栗花提取物濃度為0.50～8.00 mg·mL-1，對FO的菌絲生長抑制率為0.77%～22.56%，在0.50～4.00 mg·mL-1各相鄰兩個濃度之間不顯著；對SS的菌絲生長抑制率為1.83%～48.83%，0.50與1.00 mg·mL-1之間不顯著；對FG的菌絲生長抑制率為18.54%～62.68%，各濃度處理間均差異顯著。上述結果表明，相對于FO、SS，板栗花提取物對FG具有更好的抑菌活性。

表1 板栗花提取物對FG、SS、FO的菌絲生長抑制率Table 1 Inhibition rate of mycelium growth of FG，SS and FO from chestnut flower extract/%

板栗花提取物對FG、SS、FO菌絲生長的毒力回歸方程見表2。提取物對FG、SS、FO的抑制中濃度（EC50）分別為4.88、7.65、27.48 mg·mL-1。導致這些差異的原因，可能是浸提的有機溶劑不同導致提取的有效抑菌成分不同，或是不同菌種對藥物的敏感基線不同。

表2 板栗花提取物對FG、SS、FO菌絲生長的毒力回歸方程Table 2 Toxicity regression equation of chestnut flower extract on mycelium growth of FG，SS and FO

綜上可知，在以上3種真菌中，板栗花活性成分對FG的菌絲生長抑制效果最優，抑制中濃度值最小，因此選取FG作為后續試驗菌株。

2.2 單因素試驗結果

2.2.1 乙醇體積分數對板栗花提取物抑菌活性的影響 由圖1-A可知，板栗花活性成分對FG的菌絲生長抑制率隨乙醇體積分數的增加呈先增加后降低趨勢。當乙醇體積分數為50%時，抑制率達到最大值（39.76%）。根據試驗結果，選取乙醇體積分數為30%、50%、70%三個條件進行響應面試驗設計。

圖1 不同條件對菌絲生長抑制率的影響Fig.1 Effects of different conditions on the growth inhibition rate of mycelium

2.2.2 提取時間對板栗花提取物抑菌活性的影響 由圖1-B可知，板栗花活性成分對FG的菌絲生長抑制率隨提取時間的增加呈先增加后降低趨勢。當提取時間為60 min時，抑制率達到最大值（42.75%）。根據試驗結果，選取提取時間為40、60、80 min三個條件進行響應面試驗設計。

2.2.3 提取溫度對板栗花提取物抑菌活性的影響 由圖1-C可知，板栗花活性成分對FG的菌絲生長抑制率隨提取溫度的增加呈先迅速增大后又迅速降低的趨勢。當提取溫度由40 ℃升高到50 ℃過程中，抑制率由15.61%迅速升高至36.59%；當提取溫度為60 ℃時，抑制率達到最大值（40.24%）。根據試驗結果，選取提取溫度為50、60、70 ℃三個條件進行響應面試驗設計。

2.2.4 液料比對板栗花提取物抑菌活性的影響 由圖1-D可知，板栗花活性成分對FG的菌絲生長抑制率隨液料比的增大呈先迅速增大后緩速下降的趨勢。當液料比為15∶1 mL·g-1時，抑制率達到最大值（40.00%）。根據試驗結果，選取液料比為10∶1、15∶1、20∶1 mL·g-1三個條件進行響應面試驗設計。

2.3 響應面試驗結果

2.3.1 響應面試驗設計 采用Design-Expert 8.0.6軟件對表3的數據進行試驗設計，試驗設計方案與結果見表4。

表3 響應面試驗因素及水平設計Table 3 Experimental factors and level design of response surface

表4 響應面試驗設計方案與結果Table 4 Design and results of response surface experiment

根據表4數據進行擬合，得到各個影響因素對響應值的二次多項回歸方程關系（公式4）：

回歸方程中的系數大小代表各因素對響應值的影響能力。由表5可知，二次多項式擬合模型F值為46.03（P＜0.000 1），說明模型整體具有顯著性；失擬項不顯著（P=0.277 6）（P＞0.05），即在試驗范圍內模型與數據的擬合度較好，說明方差分析具有統計學意義。決定系數R2為0.978 7，說明該模型可以解釋97.87%的響應值變化；調整決定系數（R2adj）為0.957 5，預測決定系數（R2pred）為0.891 3，說明該模型預測性良好且擬合度較好，可對板栗花提取物抑菌率進行分析和預測。其中，各因素對板栗花提取物生物活性的影響大小為A（乙醇體積分數）＞D（液料比）＞C（提取溫度）＞B（提取時間）。

表5 方差分析Table 5 Variance analysis

2.3.2 響應面交互作用分析 響應面試驗中，四因素交互作用對板栗花提取物生物活性的影響見圖2。圖中等高線形狀的橢圓化程度與兩因素交互作用的顯著程度呈正相關，橢圓化程度越大，說明交互作用越顯著。圖2-A～F的響應面圖均為開口向下的凸形曲線，說明響應值存在極高值，表現在等高線的圓心處。等高線中心均位于-1～1水平，表明因素AB（乙醇體積分數-提取時間）、AC（乙醇體積分數-提取溫度）、AD（乙醇體積分數-液料比）、BC（提取時間-提取溫度）、BD（提取時間-液料比）、CD（提取溫度-液料比）交互作用以抑菌活性為提取最優條件在所涉及因素范圍內。

圖2 3D響應面分析Fig.2 3D response surface analysis

2.3.3 最佳提取條件的確定及驗證 采用Design-Expert軟件分析預測的板栗花抑菌活性成分最佳提取條件為乙醇體積分數56.77%（V/V）、提取時間52.78 min、提取溫度64.95 ℃、液料比12.49∶1 mL·g-1，該條件下的菌絲生長抑制率達到46.05%。為方便試驗操作條件取近似整數值，即乙醇體積分數55.00%（V/V），提取時間50.00 min，提取溫度65.00 ℃，液料比15.00∶1 mL·g-1。在此條件下進行驗證，平行3次得到實際菌絲生長抑制率為45.27%，達到預測值的98.31%，說明該參數可靠，具有可信度。

2.4 板栗花各相萃取物中總黃酮、總多酚含量

由1.3.5方法得到板栗花各相萃取物，其中得率為石油醚相0.63%、乙酸乙酯相6.88%、正丁醇相23.26%、水相56.13%。

參考1.3.6方法，經Origin 2022軟件分析，得到沒食子酸標準曲線方程（公式5）：

蘆丁標準曲線方程（公式6）：

依據酶標儀ABS值計算得到板栗花各相萃取物總黃酮、總多酚含量。由表6可知，在各相萃取物中，乙酸乙酯相總酚和總黃酮含量最高，分別為47.71 mg GA·g-1、121.93 mg rutin·g-1；總膏與水相總酚、總黃酮含量接近，分別為30.19、23.71 mg GA·g-1和42.38、38.45 mg rutin·g-1；石油醚相的總酚、總黃酮含量最低，分別為2.43 mg GA·g-1、5.83 mg rutin·g-1。

表6 板栗花各相萃取物總黃酮、總多酚含量Table 6 Content of total flavonoids and total polyphenols of various phase extracts from chestnut flower

2.5 板栗花各相萃取物抑菌活性比較

對板栗花各相萃取物進行菌絲生長速率試驗，篩選出抑菌效果最優的組分，考慮試驗用量問題，排除提取得率以及活性物含量過低的石油醚相，對總膏、乙酸乙酯相、正丁醇相、水相進行試驗。如圖3所示，各相萃取物在濃度為1.00～5.00 mg·mL-1時對FG菌絲生長均有抑制作用，且表現出濃度依賴性。當乙酸乙酯相濃度為3.00 mg·mL-1時，對FG菌絲生長表現出較好的抑制效果，但當乙酸乙酯相濃度達到5.00 mg·mL-1時，菌絲形狀受到破壞，此時菌絲直徑相較于濃度為3.00 mg·mL-1時并未繼續減小。此外，通過Data Processing System 7.05軟件計算各相萃取物的抑制中濃度值（EC50），如表7所示。各相萃取物之間抑菌活性由高到低依次為乙酸乙酯相＞水相＞總膏＞正丁醇相，在95%置信區間下，其EC50分別為2.51、4.88、5.54、15.67 mg·mL-1。結合表6可知，板栗花各相萃取物的總黃酮含量越高，其對FG菌絲生長的抑制效果越好。

圖3 板栗花各相萃取物菌絲生長抑制試驗Fig.3 Mycelium growth inhibition experiment of various phase extracts from chestnut flower

表7 板栗花各相萃取物EC50Table 7 EC50 values of extracts of various phases from chestnut flower

3 討論

在實驗室研究或工業生產中，優化提取工藝可以提高提取物的有效成分含量及活性、減少操作成本。本研究考察了溶劑乙醇體積分數、提取時間、提取溫度及液料比對提取物抑菌活性的影響。結果發現，當乙醇體積分數小于50%時，提取物抑菌率較低，可能是板栗花提取物的抑菌活性成分還未完全溶出，之后隨乙醇體積分數增加而逐漸下降，可能由于一些醇溶性非活性物質含量增大［17］，從而影響了整體抑菌活性［18］。選擇合適的提取時間既可以解決時間成本，又能保證大部分活性成分被溶出。當提取時間為60 min時，提取物中有效抑菌成分占比最高，之后隨提取時間增加而逐漸下降，主要是由于提取時間會影響溶劑與抗真菌物質的接觸與溶解，時間過短或過長都會影響有效成分含量［19］。提取溫度直接影響提取物的有效成分及活性，當提取溫度由40 ℃升高到50 ℃過程中，抑制率迅速升高，代表板栗花活性物質被大量溶出，之后隨提取溫度增加而快速下降，溫度過高會使得部分物質發生化學反應或分解而失去活性甚至發生變性導致有效成分含量降低［20］，部分黃酮類化合物在高溫條件下會分解［21］。因此，提取溫度為60 ℃時板栗花提取物的抑菌有效成分含量最大。適合的液料比加快了活性成分物質的溶出，之后溶出量隨液料比增加而逐漸下降，可能是由于液料比增大使板栗花成分充分溶出，導致抑菌有效成分占比減小，且在工業上可避免因液料比過高而存在不易濃縮、溶劑消耗量大的問題［22］。

不同植物提取物抗真菌活性的差異，可歸因于這些植物提取物中活性成分含量大小。本研究以乙醇水溶液為溶劑提取板栗花中的抑菌活性成分，但其提取物中除去活性成分外，還含有大量的糖類、蛋白質等雜質。以乙酸乙酯作萃取劑，由于乙酸乙酯本身具有的高溶解性和非極性，可有效分離出總膏中的非極性成分，如多酚以及總黃酮類物質，且這些物質的生物活性會得到保留，因此乙酸乙酯相萃取物具有含量最多的活性成分以及最高的菌絲生長抑制率。劉婷等［23］在研究廣金錢草不同極性部位時，指出乙酸乙酯中含有較多的多酚和黃酮成分，且在抗菌作用上表現出最好的抑菌活性；韋堅芬等［24］在研究草珊瑚內生真菌抗植物病原真菌時表明，抗菌活性物質存在于乙酸乙酯萃取物中，且分離鑒定出一種活性化合物。此外，活性物質是植物抑菌活性的主要來源，在抑制細胞生長的各個方面發揮著不同的作用。如Siregar等［25］發現白草根的類黃酮成分會干擾細胞壁或細菌細胞膜的通透性，使細胞活體活動受限，從而導致其生長受到抑制甚至死亡；Amin等［26］發現，在可食用包衣液添入極少量的百里酚可顯著抑制圓霉菌絲的生長和孢子的萌發；Chatrath等［27］從檸檬草中得到的檸檬醛可在較低濃度下抑制念珠菌生物膜的形成，增加活性氧簇（reactive oxygen species，ROS）的產生，導致DNA受損并破壞修復機制。本研究中乙酸乙酯相萃取物在高濃度時對菌體生長形狀具有明顯的破壞，推測乙酸乙酯相萃取物可能通過破壞菌絲細胞壁，抑制菌絲生長代謝等方式抑制菌絲生長。

乙酸乙酯相萃取物具有復雜的成分，因此對真菌生長抑制起決定作用的并非是活性成分的濃度。雖然板栗花乙酸乙酯相萃取物對小麥赤霉病菌有良好的菌絲生長抑制活性，但當濃度大于等于3.00 mg·mL-1時，其抑制率不再明顯增加，可能是FG產生了耐藥性或乙酸乙酯相萃取物本身含有的大量復雜物質間產生了拮抗作用。Badr等［28］通過研究柑橘副產物粗提物與兩種單體化合物反式阿魏酸和橙皮苷的抑菌作用，證明反式阿魏酸和橙皮苷具有一定的拮抗作用。因此，為了探究乙酸乙酯相萃取物對FG在高濃度下菌絲生長抑制率不再顯著增加的原因，在以后的研究中有必要對乙酸乙酯相萃取物的生化成分進行分析，探索更高效的抑菌活性成分，對這些化合物之間是否具有協同或拮抗作用進行探索，并在作用機理方面進行深入研究，為防治植物真菌病害，保護作物安全提供理論基礎。

4 結論

本研究比較了板栗花提取物對3種植物病原真菌FG、SS、FO的抑制活性，選擇小麥赤霉病菌（FG）為試驗菌種，板栗花提取物對其菌絲生長抑制的EC50為4.88 mg·mL-1。以菌絲生長抑制率為指標對板栗花抑菌活性成分的提取工藝進行了優化，在最佳條件下提取物中活性成分抑菌率達到了45.27%，達到理論值的98.31%，具有可信度，其中乙醇體積分數對結果影響最大。板栗花提取物經過萃取分相后，乙酸乙酯相總酚、總黃酮含量最高，因此具有較好的抑菌活性。可見，板栗花提取物具有較好的植物真菌抑菌活性，是一種具有潛在價值的天然抗菌劑。