基于甘肅河西走廊產區干紅葡萄酒中8種風味物質的頂空-氣相色譜法優化及其風味識別

丁嘉麗 雷春妮 王波 張繼元 牛育林 何曉麗 張歡 張波，*

（1甘肅農業大學食品科學與工程學院/甘肅省葡萄與葡萄酒工程學重點實驗室/甘肅省葡萄與葡萄酒產業技術研發中心，甘肅蘭州 730070；2蘭州海關技術中心，甘肅 蘭州 730010；3甘肅莫高實業發展股份有限公司葡萄酒廠，甘肅 武威 733008）

香氣是決定葡萄酒質量的主要指標之一，同時也是影響消費者購買意向的重要選擇因素［1］。葡萄酒中已鑒定出數百種香氣化合物，根據其來源可分為品種香氣、發酵香氣和陳釀香氣三類，其中品種香對體現葡萄酒的特點起決定性作用［2］。研究顯示，品種香氣主要由C6/C9化合物、萜烯類［3］、C13降異戊二烯類、揮發性硫化物和吡嗪類［4］等物質組成，反映了葡萄及葡萄酒的品質特征和產地屬性等信息［5］。

研究發現，借助C6/C9化合物（己醛、己醇等）、萜烯類（香茅醇等）和C13降異戊二烯類（β-大馬酮等）化合物可快速區分不同產地來源的葡萄原料［6-7］，類似的結果在陳巧迎等［8］的研究中也有報道。同時，因葡萄品種、地理來源等的不同，其釀制的葡萄酒中香氣物質構成和比例也呈現出較大的差異［9-12］。例如，依據C6/C9系列物質中C6醇類間的比率，可作為溯源單品種葡萄酒原產地的有效工具［11］。此外，萜烯類以及C13降異戊二烯類化合物對葡萄酒的品種香氣也有很大貢獻，可在較低濃度下增強酒體果香。同時，芳樟醇和β-大馬酮還可用來區分來自不同地區和年份的葡萄酒［12-13］。盡管已有大量葡萄酒香氣尤其是葡萄酒品種香氣的研究，但大多數研究均是圍繞造成不同酒樣品種香氣的主要差異化合物展開，有關化合物與葡萄酒風味質量間的相關性聯系還鮮有報道。

甘肅河西走廊產區位于甘肅省西北部，具有良好的釀酒葡萄種植自然資源和氣候條件［14］，特別是域內武威、張掖、嘉峪關地區已形成了一定的種植規模［15］。然而，由于各種植區氣候、土壤和栽培條件的不同，不同品種葡萄的質量表現存在一定差異，并對相應葡萄酒產品也產生了潛在影響［16］。但相關研究結果有限，需要更具體的研究分析。

為此，本研究以甘肅河西走廊出產的赤霞珠和美樂干紅葡萄酒為研究試材，以葡萄酒中常見的8種品種香氣物質（正己醛、正己醇、葉醇、順-3-壬烯-1-醇、芳樟醇、香茅醇、橙花醇和β-大馬酮）為評價指標，采用響應面法優化其靜態頂空-氣相色譜（static headspace gas chromatog raphy，SHS-GC）檢測條件，并針對上述8種重要的風味物質，分別對來自產區內不同地區以及年份的赤霞珠和美樂干紅葡萄酒進行風味判別分析，以期為葡萄酒香氣成分的定性定量分析提供一定的技術參考，同時為葡萄酒特征香氣分析提供一定的數據支撐。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

本試驗收集了來自甘肅河西走廊產區內武威（W）、張掖（Z）和嘉峪關（J）地區的赤霞珠（C）和美樂（M）干紅葡萄酒樣品，生產年份為2017—2022年，樣品共計17份，詳見表1。

表1 葡萄酒樣品信息Table 1 Wine sample information

己醛、己醇、葉醇、順-3-壬烯-1-醇、芳樟醇、香茅醇、橙花醇和β-大馬酮（純度均≥98%），上海麥克林生化科技股份有限公司；無水乙醇（色譜純），成都市科隆化學品有限公司；氯化鈉，天津匯豐化學試劑廠；酒石酸，天津致遠化學試劑有限公司；超純水由實驗室純水儀制備。

Clarus600型氣相色譜儀、全自動頂空分析儀、HPINNOWAX毛細管色譜柱（30 m×0.32 mm，0.25 μm），美國安捷倫公司。

1.2 試驗方法

1.2.1 模擬酒溶液的配制 本試驗構建模擬葡萄酒環境，具體配制方法：準確稱取5 g酒石酸于燒杯中充分攪拌溶解，加入12%乙醇，定容至1 L，用氯化鈉調節模擬溶液的離子強度為0.2 mol·L-1，用氫氧化鈉溶液將pH值調至3.6，將配好的溶液置于1 L棕色容量瓶中密封保存。

1.2.2 標準工作溶液的配置 （1）用模擬酒溶液分別配制濃度為800 mg·L-1的己醛、己醇、葉醇、順-3-壬烯-1-醇、香茅醇、橙花醇、芳樟醇、β-大馬酮單一標準工作溶液，定容至500 mL容量瓶（棕色）中混勻備用。（2）配制總濃度為800 mg·L-1的混合標準工作溶液，定容至500 mL容量瓶（棕色）中，混勻備用。（3）用模擬酒梯度稀釋混合標準工作溶液，配制成5、100、300、500、700、800 mg·L-1的系列工作液，混勻備用。

1.2.3 進樣方法的優化試驗 選擇對提取揮發性成分影響較大的樣品量（2、4、6、8、10、12 mL）、平衡溫度（40、50、60、70、80、90 ℃）、平衡時間（10、20、30、40、50、60 min）、進樣時間（20、21、22、23、24、25 s）進行優化分析，以總峰面積作為考察指標進行單因素試驗。在此基礎上，采用Design Expert 8.0.6軟件設計響應面試驗，因素與水平見表2。

表2 Box-Behnken響應面試驗設計因素與水平Table 2 Box-Behnken response surface test factors and levels

1.2.4 香氣化合物的檢測

1.2.4.1 SHS-GC條件 SHS條件：加壓-置換時間120 s，進樣時間23 s，放空時間20 s，平衡時間20 min，循環時間75 min；平衡溫度90 ℃，傳輸線溫度105 ℃；載氣壓力220 kPa。

GC條件：HP-INNOWAX毛細管色譜柱（30 m×0.32 mm，0.25 μm）；載氣為高純氮氣（純度不小于99.999%）；進樣口溫度230 ℃，檢測器溫度240 ℃；恒流流量1 mL·min-1；分流進樣，分流比為1∶1。升溫程序：初始溫度60 ℃，保持2 min；以2.5 ℃·min-1速率升溫至220 ℃，保持5 min。

1.2.4.2 定性和定量方法 分別吸取10 mL的單一標準儲備液至頂空瓶中，檢測每種香氣化合物的保留時間，依據色譜保留時間進行定性分析；采用外標法進行定量，按上述色譜條件對系列混合標液進行測定，以單一香氣的濃度為橫坐標、單一香氣的峰面積為縱坐標，繪制標準曲線。

1.2.4.3 樣品香氣的測定 取10 mL標準儲備液或樣品至頂空瓶中，將頂空瓶壓緊瓶蓋密封，放入頂空進樣器中按儀器工作條件進行測定。

1.3 數據處理

所有試驗均進行3次平行測定，使用Excel 2016進行數據整理和圖表繪制；使用SPSS 22.0進行數據單因素方差分析；使用Design Expert 8.0.6統計軟件進行響應面試驗中的回歸分析；使用SIMCA-P 11.5軟件進行主成分分析；使用Origin 2017軟件作圖。

2 結果與分析

2.1 頂空氣相色譜法的優化

2.1.1 單因素優化結果與分析 由圖1-A可知，隨著樣品量的增加，香氣的總峰面積呈先上升后趨于平穩的趨勢。當樣品量為10 mL時，總峰面積逐漸趨于平穩，說明樣品量為10 mL時香氣的揮發量趨于飽和，頂空分析物的濃度較高。由圖1-B可知，隨著平衡溫度的升高，香氣的總峰面積逐漸增大，90 ℃時響應值最大，說明在該溫度下從樣品中釋放到頂空的氣體較多，氣化較完全，定量結果也比較準確。但將平衡溫度增加到90 ℃以上時，不僅會導致水揮發進色譜柱，影響色譜柱的使用壽命，還會引入過多雜質而干擾峰形。綜合考慮，選擇平衡溫度為90 ℃效果最佳。由圖1-C可知，隨著平衡時間的增加，香氣總峰面積先上升后逐漸趨于平穩，最后開始緩慢下降。該現象的出現，說明樣品在20～30 min時，兩相達到了平衡狀態，但30 min后平衡時間過長導致頂空瓶的氣密性變差，使目標物定量的準確性降低。由圖1-D可知，23 s后香氣總峰面積的變化趨于平穩，說明被提取的揮發性香氣的量逐漸穩定。根據試驗結果，初步選取樣品量10 mL、平衡溫度90 ℃、平衡時間20 min、進樣時間23 s為單因素最佳水平。

圖1 單因素試驗結果Fig.1 Single-factor test results

2.1.2 響應面結果與分析 響應面試驗結果見表3，方差分析結果見表4。以香氣物質的總峰面積（Y）為響應值的二次多項式回歸方程如下：

表3 響應面試驗設計及結果Table 3 Response surface test design and results

表4 方差分析結果Table 4 Results of variance analysis

Y=7.744×106+64 583.330A+7.673×105B+2.832×105C+1.466+2.832×105D+4 230.000AB+250.000AC-4 750.000AD-2.260×105BC-1.902×105BD-3.739×105CD-4.199

由表4可知，該二次多項式回歸模型差異極顯著，失擬項不顯著。模型的調整確定系數R2Adj為0.96，說明該模型的擬合度良好，可用于對模擬酒中的香氣物質進行分析與預測。B、C、D的F值較大，表明平衡溫度、平衡時間以及進樣時間對香氣的揮發有較大影響。BC、BD和CD的F值較大且P＜0.05，表明平衡溫度與平衡時間和進樣時間之間的交互作用明顯，它們的等高線圖如圖2-D、E所示。圖2中所示結果與表4一致。

圖2 交互作用對揮發效果影響的等高線及響應面圖Fig.2 Contour and response surface diagram of the interaction of various factors on volatilization effect

利用Design-Expert軟件對數據進行分析優化，得到最佳進樣條件：樣品量10.15 mL、平衡溫度90 ℃、平衡時間21.91 min，進樣時間23.06 s。為方便實際操作，對試驗條件進行簡化，選取樣品量10 mL、平衡溫度90 ℃、平衡時間22 min、進樣時間23 s。根據響應面試驗預測結果結合實際條件進行3次模型驗證試驗，香氣的總峰面積為7.71×106μV·s，與理論值基本相符。因此，該模型能較真實準確地反映各因素對香氣揮發的影響。

2.1.3 方法評價 由表5可知，各目標化合物在檢測范圍內線性關系較強（R2≥0.992），且8種香氣成分都具有較低的檢出限和定量限，保證了對微量目標化合物的靈敏度和可靠性，可以滿足對8種供試物質的定量測定分析要求。

表5 線性范圍、檢出限、定量限測定結果Table 5 Determination results of linear range detection limit and quantitative limit

以市售葡萄酒為試驗對象，驗證該方法的準確度。由表6可知，8種香氣物質的回收率為70%～120%，相對標準偏差（relative standard deviation，RSD）為1.7%～4.3%，說明方法準確度和精密度良好［17-19］，能保證分析結果的可靠性，可滿足測試需求。

表6 加標回收率和精密度測定結果Table 6 Determination of results of recovery rate and precision of standard addition

2.2 葡萄酒樣品的香氣差異

2.2.1 不同品種葡萄酒香氣差異 由圖3可知，無監督的主成分分析（principal component analysis，PCA）下兩個品種的葡萄酒分布略有差異，無法完全區分兩個釀酒葡萄品種的揮發性物質，因此還需進行有監督的正交偏最小二乘判別分析（orthogonal projections to latent structures discriminant analysis，OPLS-DA）。

圖3 基于不同品種的散點圖（A）和雙標圖（B）Fig.3 PCA-scatter plot （A） and PCA-biplot （B） based on different varieties

如圖4所示，OPLS-DA模型能將赤霞珠和美樂的葡萄酒樣品區分開來，且擬合模型預測成分的累計統計量R2X=0.977、模型解釋率參數R2Y=0.84、預測能力參數Q2=0.81，均大于0.5，表示OPLS-DA模型對葡萄酒揮發性香氣分析的預測能力較好。由圖4-A可知，赤霞珠葡萄酒酒樣位于PC1的負半軸，美樂葡萄酒酒樣位于PC1的正半軸。由圖4-B可知，正己醇、香茅醇、葉醇和β-大馬酮位于PC1的負半軸，說明其與赤霞珠葡萄酒香氣相關性較高，能賦予葡萄酒青草香、檸檬、柑橘香以及蜂蜜香。正己醛、順-3-壬烯-1-醇、芳樟醇和橙花醇位于PC1的正半軸，與美樂葡萄酒香氣相關性較高，賦予葡萄酒薰衣草香、玫瑰香、柑橘香和青草香。

圖4 基于不同品種的OPLS-DA模型分析Fig.4 OPLS-DA model analysis based on different varieties

2.2.2 不同地區葡萄酒香氣差異 不同地區赤霞珠葡萄的主成分分析結果如圖5-A和B所示，前2個主成分的累積貢獻率為91.3%，可反映較多的數據變化信息，且3個地區的葡萄酒可以得到較好的區分。由圖5-B可知，橙花醇位于PC1和PC2的正半軸，與武威地區的葡萄酒樣品相關性較強，為葡萄酒提供玫瑰花香和柑橘香［20］；順-3-壬烯-1-醇和正己醇位于PC1的正半軸和PC2的負半軸，與嘉峪關的葡萄酒有較強的相關性，賦予葡萄酒新鮮的青草香；而β-大馬酮、香茅醇、葉醇和正己醛位于PC1和PC2的負半軸，與張掖的葡萄酒相關性較高，賦予葡萄酒蜂蜜味、檸檬、柑橘香以及青草香［21］。

圖5 基于不同地區的PCA模型分析Fig.5 PCA model analysis based on different producing areas

不同地區美樂葡萄的主成分分析結果如圖5-C和D所示，前2個主成分的累積貢獻率為88.9%，并且3個地區的葡萄酒也得到較好的區分。由圖5-D可知，橙花醇和芳樟醇與武威產區的葡萄酒有較高的相關性，賦予葡萄酒薰衣草香、玫瑰香、柑橘香和青草香；正己醛與張掖的葡萄酒有較高的相關性，能賦予葡萄酒清新的青草香；而葉醇、順-3-壬烯-1-醇和正己醇與嘉峪關的葡萄酒有較高的相關性，能為葡萄酒提供青草香。

綜上所述，武威產區葡萄酒的特征香氣成分為橙花醇，賦予葡萄酒柑橘、檸檬和玫瑰香，而張掖和嘉峪關的葡萄酒的特征香氣成分分別為正己醛和正己醇，它們能為葡萄酒提供草藥香和植物香。

2.2.3 不同年份葡萄酒差異 由圖6-A可知，根據不同貯藏年份所在象限不同，將赤霞珠葡萄酒香氣輪廓分為3個階段：貯藏期1～2年、貯藏期2～3年和貯藏期4～6年。由圖6-B可知，正己醛和橙花醇與貯藏期1～2年的葡萄酒有較高的相關性，能帶給葡萄酒青草香、柑橘香和玫瑰香。葉醇、β-大馬酮和香茅醇與貯藏期2～3年的葡萄酒有較高的相關性，能帶給葡萄酒青草香、蜂蜜香以及檸檬、柑橘香。順-3-壬烯-1-醇和正己醇與貯藏期4～6年的葡萄酒有較高的相關性，能給葡萄酒帶來清新的青草香。

由圖6-C可知，根據不同貯藏年份所在象限的不同，將美樂葡萄酒香氣輪廓分為2個階段：貯藏期1～3年和貯藏期4～6年。由圖6-D可知，正己醛、橙花醇和芳樟醇與貯藏期1～3年的葡萄酒有較高的相關性，它們給葡萄酒帶來薰衣草香、玫瑰香、柑橘香、檸檬香以及青草香。順-3-壬烯-1-醇、葉醇和正己醇與貯藏期4～6年的葡萄酒有較高的相關性，它們能帶給葡萄酒較為濃郁的青草香。

綜上所述，在赤霞珠和美樂酒樣中，貯藏期較短的酒樣與C6/C9化合物、降異戊二烯類化合物和萜烯類化合物的相關性較強，而陳年的酒樣僅與C6/C9化合物呈現較好的相關性。

3 討論

葡萄酒香氣成分的組成與葡萄品種、產區環境以及葡萄酒的貯藏年份等因素相關。本研究結果顯示，不同品種、不同地區和不同年份的葡萄酒呈現出不同的香氣特征。很多葡萄果實中特有的品種香在發酵過程中基本不受影響或僅發生細微變化，得以保留于葡萄酒中，可用于區分不同品種的葡萄酒。本研究基于正己醛、正己醇、葉醇、順-3-壬烯-1-醇、芳樟醇、香茅醇、橙花醇和β-大馬酮8種品種香建立的OPLSDA模型可以將赤霞珠和美樂葡萄酒樣品區分開，并且通過對不同品種酒樣的香氣差異分析，發現赤霞珠葡萄酒香與正己醇、香茅醇、葉醇和β-大馬酮有較高的相關性，這與夏鴻川等［22］的研究結果有較好的一致性，即赤霞珠葡萄酒中的品種香有正己醇、芳樟醇和β-大馬酮等，美樂葡萄酒香氣與正己醛、順-3-壬烯-1-醇、芳樟醇和橙花醇相關性較高。Zhang等［23］采用固相微萃取氣質聯用（solid phase microextractiongas chromatography-mass spectrometry，SPME-GC-MS）技術對美樂葡萄酒的揮發性香氣進行了定性定量分析，發現美樂葡萄酒中芳樟醇和葉醇的氣味活性值（odour active value，OAV）＞1，對葡萄酒整體香氣貢獻率較大，此外，前人研究還發現美樂葡萄酒中的正己醛含量高于赤霞珠葡萄酒［24］。

然而，同一品種下不同地區和不同年份的葡萄酒也表現出較大差異。與Xie等［25］的研究類似，即C6/C9化合物、降異戊二烯類化合物和萜烯類化合物可以較好地區分不同地區的赤霞珠和美樂葡萄酒。通過對葡萄酒地區與香氣的相關性分析，發現武威產區葡萄酒的特征香氣成分為橙花醇，而張掖和嘉峪關葡萄酒的特征香氣成分分別為正己醛和正己醇，造成這種差異的原因可能是這三個地區的氣候條件不同。例如，萜烯類化合物含量與降水量呈正相關，而高溫和強光照下的C6/C9化合物含量較高［26］。同時近幾年的氣象資料表明，張掖的有效積溫高于嘉峪關和武威，武威的降水量大于張掖和嘉峪關。由此推測張掖地區葡萄酒的C6/C9化合物（正己醇）含量較高，武威產區葡萄酒的萜烯類化合物（橙花醇）含量較高。同一品種下的不同年份葡萄酒香氣也存在較大差異。這可能是因為C6醇很難被酵母代謝，其含量在酒精發酵過程中處于比較穩定的狀態，而萜烯和C13-降異戊二烯類化合物含量在發酵結束和儲存期間呈現出減少的趨勢［27-28］，因此貯藏期較短的赤霞珠和美樂酒樣與萜烯類化合物、C13-降異戊二烯類化合物和C6/C9化合物相關性較高，而陳年的酒樣僅與C6/C9化合物密切相關。

4 結論

本研究結果表明，樣品量10 mL、平衡溫度90 ℃、平衡時間22 min、進樣時間23 s的組合SHS-GC進樣條件可提高葡萄酒香氣物質定性定量結果的靈敏度與準確性。赤霞珠葡萄酒香氣與正己醇、香茅醇、葉醇和β-大馬酮有較高的相關性，而美樂葡萄酒香氣與正己醛、順-3-壬烯-1-醇、芳樟醇和橙花醇相關性較高；不同地區干紅葡萄酒與香氣物質顯示，武威、張掖和嘉峪關地區葡萄酒香氣分別與橙花醇、正己醛、正己醇密切相關；不同年份干紅葡萄酒與香氣物質的分析發現，貯藏期1～3年的產品與C6/C9化合物、降異戊二烯類化合物和萜烯類化合物相關性較強，貯藏期4～6年的酒樣僅與C6/C9化合物呈現較好的相關性。