結合科研背景對試題深入分析
——以2023年廣東卷20題為例

裴 柳

(河北省石家莊市第一中學)

結合真實、適切的科研背景,依托科學實驗和探究情境所命制的試題,有利于全面考查學生的科學思維,如2023年廣東高考卷第20題。教師講評本題從突變體研究背景的視角,結合真實的實驗對該題進行分析,有助于學生理清思路、突破疑難。

【原題呈現】種子大小是作物重要的產量性狀。研究者對野生型擬南芥(2n=10)進行誘變,篩選到一株種子增大的突變體。通過遺傳分析和測序,發現野生型DAI基因發生一個堿基G到A的替換,突變后的基因為隱性基因,據此推測突變體的表型與其有關,開展相關實驗。回答下列問題:

(1)擬采用農桿菌轉化法將野生型DAI基因轉入突變體植株,若突變體表型確由該突變造成,則轉基因植株的種子大小應與________植株的種子大小相近。

(2)用PCR反應擴增DAI基因,用限制性核酸內切酶對PCR產物和________進行切割,用DNA連接酶將兩者連接。為確保插入的DAI基因可以正常表達,其上下游序列需具備________。

(3)轉化后,T-DNA(其內部基因在減數分裂時不發生交換)可在基因組單一位點插入也可以同時插入多個位點。在插入片段均遵循基因分離及自由組合定律的前提下,選出單一位點插入的植株,并進一步獲得目的基因穩定遺傳的植株(如圖1),用于后續驗證突變基因與表型的關系。

圖1

①農桿菌轉化T0代植株并自交,將T1代種子播種在選擇培養基上,能夠萌發并生長的陽性個體即表示其基因組中插入了________。

②T1代陽性植株自交所得的T2代種子按單株收種并播種于選擇培養基,選擇陽性率約________%的培養基中幼苗繼續培養。

③將②中選出的T2代陽性植株________(填“自交” “與野生型雜交”或“與突變體雜交”)所得的T3代種子按單株收種并播種于選擇培養基,陽性率達到________%的培養基中的幼苗即為目標轉基因植株。

為便于在后續研究中檢測該突變,研究者利用PCR擴增野生型和突變型基因片段,再使用限制性核酸內切酶X切割產物,通過核酸電泳即可進行突變檢測,相關信息如圖2,在電泳圖(圖3)中將酶切結果對應位置的條帶涂黑。

圖2

圖3

參考答案：(1)野生型 (2)載體 啟動子和終止子 (3)①DAI基因和卡那霉素抗性基因 ②75 ③自交 100 見圖4

圖4

在分析該題時,往往會產生諸多疑惑,如:“目的基因穩定遺傳的植株”與野生型表型相同,為什么還要進行轉基因培育和篩選該類型植株?為什么導入目的基因的同時還要導入卡那霉素抗性基因?T2代和T3代培養基都有陽性率約100%的幼苗,為什么不是從T2代而是從T3代挑選?這些問題雖然沒有被命題人設置為考查角度,但是從突變體的科研視角對其分析和釋疑有利于開拓思路,提升學生分析和解答問題的能力,同時讓學生感受到科研工作所具有的嚴密的思維和嚴謹的態度。

疑點1.為什么自然界中有野生型還要通過基因工程將DAI基因導入隱性突變體中?

該試題相關背景是對擬南芥突變體的科學研究。其研究思路:首先對野生型擬南芥進行誘變(實驗室常用甲基磺酸乙酯作為誘變劑對擬南芥的種子進行誘變),以種子的大小為觀察指標,篩選出突變體。在科研中通常采用高通量測序法(一次并行對幾十萬至幾百萬DNA分子進行序列測定)對相關品系擬南芥的全部基因進行測序,通過數據分析,找出突變體中發生改變的基因——突變的DAI基因,然后對該基因的遺傳信息進行研究,確定了突變是由正常基因的一個堿基G替換為A所致。進而通過雜交實驗明確了該突變為隱性突變。研究至此只是初步證實了突變體的形成與DAI基因發生隱性突變有關。為進一步增加其可信度,明確該基因與突變性狀的關聯性,科學研究中通常還需進行恢復實驗。

該突變體的恢復實驗是將單一DAI基因轉入突變體基因組中,若將正常DAI基因記作M,突變的DAI基因記作m,需先篩選出基因型為Mm的植株,其自交后得到基因型為MM的品系即為恢復系。恢復實驗的設計思路類似“某種元素是植物必需元素的驗證實驗”:在植物缺素培養出現缺素癥后,再添加該元素,觀察缺素癥是否得到明顯緩解。

突變體在自然界中很常見,在遺傳學研究中更是被廣泛應用,如擬南芥超過90%的基因都具有突變體。在突變體研究中,恢復系植株具有重要用途,如利用恢復系和野生型分別對目的基因進行PCR,獲得該基因拷貝數,若比對結果極其接近或基本一致,就可從基因數量水平證明突變體是野生型的兩個目的基因均發生隱性突變所致;在每批突變體材料的表型觀察或進行其他實驗時,需要野生型和恢復系分別做對照,故有必要篩選出能穩定遺傳的恢復系植株并對其進行擴大培養。

疑點2.為什么導入目的基因的同時還要導入卡那霉素抗性基因?如何保證兩個基因同時導入和表達?

利用農桿菌轉化法進行轉基因時,只有農桿菌Ti質粒上的T-DNA片段才能轉入到受體細胞的染色體中。用于篩選擬南芥細胞、植株或種子的標記基因也需要和目的基因一并導入受體中。該試題中的卡那霉素抗性基因作為標記基因,通過在培養基中添加卡那霉素選擇出導入目的基因的種子。

為了使兩個基因均構建在T-DNA片段中,可將兩基因進行拼接,該過程如圖5所示。獲取拼接基因需設計兩對引物,引物A、B為常規引物,且這對引物位于兩基因的非拼接端,而引物C、D位于兩基因的拼接端,且在這對引物的5′端增加一段互補序列。這樣PCR1和PCR2的產物,可以通過引物C、D的互補序列進行配對,使前兩輪復制得到的兩條DNA單鏈分別作為PCR3的“模板和引物”,擴增出拼接基因。之后將拼接基因導入農桿菌T-DNA的相應啟動子和終止子之間,借助農桿菌的侵染將拼接基因連接到擬南芥染色體上,實現DAI基因和卡那霉素養抗性基因在受體細胞中共同表達。

圖5

農桿菌轉化的擬南芥(T0代)中有多種基因型:沒有發生轉化的mm基因型、插入一個位點的Mm基因型、插入兩個位點的MM基因型、插入三個位點的MMM基因型等。這些種子播種在含有卡那霉素選擇培養基上,基因型為mm的陰性植株不能萌發,而能夠萌發并生長的陽性個體基因組中均插入了M基因,借此操作篩選出導入目的基因的植株。

疑點3.為什么從T3代種子中挑選目標轉基因植物而非從T2代種子中挑選?

這里涉及題目(3)①-③中所述每一代操作的主要目的和株系育種法。株系是由同一植株繁殖而來的后代。通常做法是選擇某植株單株收獲種子,播種在一個單獨區間,這個區間所有植株稱為一個株系。與普通雜交育種相比,分株系種植可盡快達到鑒定和分離純系的目的。

該試題中擬選出單一位點插入的植株,并獲得純合體。結合題目信息分析T0→T1代的目的是篩選出插入了拼接基因的植株;T1→T2代目的是篩選出插入單一位點的植株:T2代種子陽性率為3/4的種子即為插入單一位點的植株,其T0代插入位置有兩種可能,如圖6中圖a和圖b所示,此時將T2代種子按單株收種并播種于選擇培養基中,所得T3代株系全部為陽性表型,即為想篩選的突變體恢復系。

圖6

疑點4.為什么選單一位點插入野生型DAI基因的突變體?

該試題中用單一位點插入野生型DAI基因的突變體,到T3代可選出基因型為MM的恢復系。如果轉入兩個或兩個以上M基因(如圖7),因自交后代均為陽性,而無法區分導入M基因的個數。

圖a

同時由于基因的拷貝數可能會影響基因的表達進而影響對性狀的控制,因此篩選出和野生型一致的轉基因純合體,即通過篩選單一位點插入野生型DAI基因的突變體,進一步獲得的基因型為MM品系(恢復系)才最符合科研需求。

除了上述所呈現的問題,相關科研背景還可從以下角度切入:利用“不同濃度的卡那霉素對擬南芥萌發的影響”等與該試題中實驗密切相關的一系列實驗,學習獲得擬南芥突變株的常用方法[如通過甲基磺酸乙酯誘變(ems)法誘變、利用CRISPR/Cas9基因編輯技術誘變等],以及利用PCR、RT-PCR 等方法對突變體進行分子水平鑒定的流程等。

教學雖然不是科研,但了解科研背景和科研事實,學習實驗方法,不僅可以在分析試題時清楚了解出題背景和命題立意,透徹地解析疑點,還能通過科研視角的切入和科研意識的滲透,在學生心中埋下科研的種子。