根結線蟲誘導的巨型細胞及其形成機制

劉銳 趙建龍 謝丙炎 李惠霞 茆振川

（1.甘肅農業大學植物保護學院 甘肅省農作物病蟲害生物防治工程實驗室，蘭州 730070; 2.中國農業科學院蔬菜花卉研究所 蔬菜生物育種全國重點實驗室，北京 100081）

近年來，隨著農業種植業結構的優化和調整，設施蔬菜栽培面積得以迅速發展，但長期連茬栽培為根結線蟲病等土傳病害的發生和危害提供了適宜的環境，導致根結線蟲病成為制約我國設施蔬菜發展的主要限制因素［1-2］。根結線蟲（Meloidogyne spp.）在全世界范圍分布廣泛、寄主種類多、危害嚴重，每年造成巨大的損失，是危害農作物最嚴重的線蟲之一，被列為全球十大植物寄生線蟲之首位［3-5］。

根結線蟲病是作物生產中極難防治的病害。根結線蟲侵染寄主植物后，造成植物矮小、葉片發育不良、畸形，嚴重時整株萎蔫枯死［6］。據報道，根結線蟲超過100 種，危害數千種植物［4,7］，嚴重影響農作物生產的有南方根結線蟲（M.incognica）、爪哇根結線蟲（M.javanica）、花生根結線蟲（M.arenaria）和象耳豆根結線蟲（M.enterolobii），其中以南方根結線蟲危害最為嚴重［8］。雖然每種根結線蟲有獨特的寄主范圍和偏好的環境條件，危害寄主的癥狀略有不同，但在寄主根部形成癭瘤或腫脹是它們的共同特征。在寄生的過程中，該類線蟲誘導植物根部微管細胞重新分化形成取食位點，即巨型細胞（細胞核分裂，細胞質不分裂而形成多核的巨細胞），這些細胞是線蟲發育過程中唯一的取食來源［9］。因此，取食位點的形成和維持在根結線蟲侵染及發育過程中發揮著至關重要的作用。本文擬綜述根結線蟲誘導寄主植物形成巨型細胞的形態學和生理學研究進展，及寄主植物的防御策略、線蟲-植物協同進化等，以解析巨型細胞形成過程，進一步揭示根結線蟲寄生的分子機制，為根結線蟲抗性育種及其有效防治開拓思路。

1 巨型細胞的形成和調控機制

1.1 巨型細胞的形成

根結線蟲以二齡幼蟲侵入植物后，在寄主中完成其整個生活史，一般在20-40 d 內完成一個生命周期［10］。二齡幼蟲從寄主根部伸長區穿透寄主植物，沿細胞間向下遷移至根尖，向分生組織移動，最終進入維管束圓柱體木質部發育區［11］。二齡幼蟲通過口針穿刺一些寄主細胞，誘導這些細胞成為永久性取食位點。通常，根結線蟲的取食位點由5-8個細胞經歷形態和生理的變化，成為根結線蟲的營養庫。Treub 根據其形態特征，于1886 年首次將其命名為巨型細胞（giant cells）。在20 世紀60 年代，通過光學和電子顯微鏡技術對植物寄主中誘導的取食位點的形態特征進行了詳細的描述［12-13］。觀察發現，在寄主根部維管束內巨型細胞形成的第一個證據是線蟲頭部附近出現雙核細胞［14］。隨后，巨型細胞前體細胞經歷反復的核分裂但不進行細胞質分裂，使其大小為正常細胞的100 多倍［15］，新的有絲分裂周期與胞質分裂解偶聯導致巨型細胞呈多核狀態［16］。通常巨型細胞核仁增大，質膜面積增加，細胞質變得致密，包括線粒體、質體、核糖體、高爾基體和內質網等細胞器大量富集，且呈漩渦狀排列［17］。隨著巨型細胞的形成，細胞中央液泡由開始時的大液泡變成許多小液泡，細胞壁也隨之增厚［18］。

1.1.1 巨型細胞的細胞壁 在侵染寄主的過程中，由于植物細胞壁結構和化學組成的限制和保護，根結線蟲首先要克服寄主細胞壁的物理和化學屏障，才能成功地侵入寄主細胞，并在組織中遷移。根結線蟲在建立取食位點時，巨型細胞的細胞壁會發生修飾，增厚、向內生長，并改變其成分，以滿足巨型細胞形成所需的物理和化學基礎。

在發育早期，巨型細胞出現細胞壁的增厚。最初，細胞壁上出現許多小斑塊，隨著這些斑塊擴大、合并，導致更大范圍的細胞壁增厚。但在成熟的巨型細胞中，細胞壁厚度是不均勻的，這表明在其發育過程中細胞壁是不對稱分布［19］。通過高倍電子顯微鏡觀察，發現增厚的細胞壁與初生細胞壁相似，未顯示出任何的特殊結構，染色后也未表現出明顯變化［12,20-21］。在韌皮部細胞、維管柱薄壁細胞及其鄰近的不同組織內的巨型細胞中，細胞壁均向內分散生長［19,22］。有研究發現，巨型細胞間存在胞間連絲，至少在兩個相鄰的巨型細胞之間的細胞壁中存在胞間連絲［18,22］。不過，也有研究發現擬南芥受南方根結線蟲侵染形成的巨型細胞，其細胞壁缺乏胞間連絲，而營養物質是通過發育良好的細胞壁向內生長系統，以胞外增殖方式進入巨型細胞［19］。擬南芥轉錄因子PUCH1 基因在線蟲侵染早期上調表達，PUCH1 突變體中的細胞壁增厚，可能通過長鏈脂肪酸合成調節巨型細胞的發育［23］。總之，巨型細胞形成過程中細胞壁的修飾過程非常復雜，這些變化可能是由寄主細胞基因差異表達導致的。

與正常細胞相比，巨型細胞細胞壁的成分會發生變化。巨型細胞細胞壁的組成在細胞增大過程中也隨之變化。植物細胞壁的主要成分是纖維素，這是一種由1,4-β-葡聚糖組成的線性聚合物。在巨型細胞形成的過程中，兩種纖維素合成酶基因CesA2和At4g15290（AtCSLB5）下調表達［24］。此外，對根結中的10 個纖維素合成酶基因的全面分析發現，次生壁相關CesA 基因主要在巨型細胞內表達，表明CesA 基因參與巨型細胞的形成［25］；控制細胞壁強度和延展性的關鍵是木聚糖的代謝，木葡聚糖代謝酶可分為兩大類：木葡聚糖轉糖基化酶（xyloglucan transglycosylases, XET）［26］和木葡聚糖內轉糖基化酶（xyloglucan endotransglycosylases, EXGT）［27］。同樣在南方根結線蟲侵染楊樹后形成的食位點中發現纖維素、木聚糖、木質素的改變［28］。通過對根結線蟲感染擬南芥全基因組表達譜分析發現，兩個XET基因的表達在線蟲侵染后發生改變［29］；巨型細胞形成過程中還伴隨著擴張蛋白基因的表達變化。擴張蛋白是細胞外植物蛋白，有助于細胞壁修飾。擴張蛋白家族包括4 個家族：α-擴張蛋白α-expansins（EXPA）、β- 擴 張 蛋 白β-expansins（EXPB）、擴 張蛋白樣A expansin?like A（EXLA）和擴張蛋白樣B expansin?like B（EXLB）［30］。7 個EXPA 和2 個EXPB 基因在受南方根結線蟲誘導的擬南芥根中表達上調，且其表達受到暫時調控，其中6 個基因表達量在14 d 時高于7 d［29］。

1.1.2 巨型細胞的細胞骨架 通過基因組和轉錄組數據研究發現，許多參與細胞骨架的基因在巨型細胞形成過程中存在差異表達［24］。植物細胞骨架主要由微管（MTs）和肌動蛋白絲（F?actin 或微絲，MFs）以及中間絲組成。線蟲取食過程中，微管和肌動蛋白同時受到影響，細胞骨架發生了重組。巨型細胞不能完成胞質分裂，導致膜質體發育不完全。細胞分裂完成依賴于分泌囊泡、動態細胞骨架和一組輔助蛋白的協調作用和相互融合［31］。

具有細胞支架作用的微管，也參與細胞分裂和胞內運輸。在線蟲侵染后，其表達量會發生劇烈的變化。原位雜交檢測發現，線蟲侵染初期α-、β-和γ-微管蛋白基因mRNA 含量升高，在線蟲侵染25 d后微管蛋白的表達逐漸減少［16］。微管蛋白MAP65?3的表達在巨型細胞形成初期受到上調，在巨型細胞將要完成發育時其表達量迅速下降。MAP65?3 與周圍細胞的有絲分裂MT 陣列有關，并且在缺失MAP65?3 后，巨型細胞開始發育但未能完全分化，最終被破壞。MAP65?3 在巨型細胞有絲分裂細胞骨架中起著關鍵作用［32］。

肌動蛋白與微管共同構成胞質骨架，在誘導取食位點的形成過程中，其相關基因的表達量顯著增加，肌動蛋白絲的密度也增加。肌動蛋白（G?actins）的兩個基因ACT2 和ACT7 在巨型細胞的發育過程中起作用［16］。用GFP 標記的肌動蛋白（GFP:mTalin或GFP:FABD）在巨型細胞和鄰近細胞顯示出強烈的GFP?ABD 熒光，表明在巨型細胞形成中肌動蛋白表達量較高［31］。肌動蛋白絲在巨型細胞相鄰的細胞中的分布具有隨機性，但在與巨型細胞直接相連的細胞中，表現出高密度分布［16］。在巨型細胞皮層中觀察到異常粗的肌動蛋白絲，進一步證明MF 網絡對線蟲侵染做出反應。細胞觀察和免疫細胞化學研究揭示，MFs 在巨型細胞中肌動蛋白細胞骨架的組織紊亂［16］，且在細胞分裂過程中內質網中MFs 也明顯缺失［33］。Formmins，也被稱為Formin 同源蛋白（FH），是一種肌動蛋白成核蛋白，在真核生物中刺激細胞過程的MF 組裝，包括細胞分裂、黏附、建立極性和運動［34］。AtFH4 和AtFH21 在線蟲侵染后3 d 的巨型細胞中被抑制［24］。擬南芥肌動蛋白解聚因子（ADF）基因家族包括11 個表達成員，其中5個基因在根結中表達上調，根結線蟲誘導的線蟲取食細胞中ADF2 的高表達有助于線蟲成功寄生，主要原因是高濃度的ADF2 可能會導致MFs 的不穩定，從而降低肌動蛋白網絡的完整性，繼而促進線蟲的攝食及其發育［35］。因此，巨型細胞的生長和增大依賴于動態肌動蛋白絲數量的增加和體積增大，以支持巨型細胞的骨架和活躍的胞質代謝。

肌動蛋白細胞骨架的結構變化，可能是特定線蟲特定分泌物分泌到維管束細胞導致的結果，這些分泌物能夠觸發建立功能性巨型細胞形成所需的細胞骨架變化。線蟲可能將特定的效應分子直接或間接傳遞到植物細胞中靶向細胞骨架，而對這些效應分子功能的深入研究將有助于揭示巨型細胞形成的分子機制。

1.1.3 巨型細胞的液泡和細胞核 根結線蟲在誘導巨型細胞形成初期，迅速膨脹到相鄰細胞的10 倍以上。此時構成細胞的大部分為大液泡，隨著巨型細胞的發育大液泡變成許多小液泡，細胞質含量相應增加。隨著巨型細胞的成熟，細胞核的數量明顯增加，大液泡被細胞質的合成所取代，并成為隨后大量蛋白質合成的來源［36］。研究表明，大液泡的形成是巨型細胞擴張的原因［37］。在根結快速發育的過程中，液泡膜內在蛋白（TIPS）以及水通道蛋白（TobRB7）在巨型細胞中高表達［38-39］。研究人員關注巨型細胞發育后期，從大液泡到許多小液泡變化的原因。細胞分裂之前形成一個橫跨液泡的細胞質膜，將液泡一分為二，形成占據兩個子細胞的較小的液泡。早期的研究表明巨型細胞中大液泡，可能是通過質膜活動將其一分為二形成小的液泡［21］。因此大量的小液泡可能是細胞在沒有經歷胞質分裂的情況下進入有絲分裂周期而持續的液泡碎裂造成的。近些年關于巨型細胞的液泡相關研究較少，尤其是線蟲侵染后激活取食位點的細胞周期從而改變液泡的形成。

根結線蟲在寄主植物的維管束柱中誘導5-8 個細胞形成多細胞核的巨型細胞，這些巨型細胞分布于薄壁維管細胞和木質部細胞中，經歷多次有絲分裂［40］、細胞分裂中斷或阻斷［16］，最終誘導根結的形成。研究人員普遍認為，細胞核的增多是核內復制的結果，在整個巨型細胞發育和擴增過程中，會發生多次且經常同步的有絲分裂，最終形成超大的多核細胞［40］。通過光學顯微鏡和電子顯微鏡觀察巨型細胞中細胞核的變化，線蟲侵染24 h 后未觀察到雙核細胞，48 h 開始可以觀察到雙核細胞，在72 h觀察到2-8 個甚至更多的細胞核。6 d 時觀察到大量的細胞核、中央液泡進一步縮小［41］。在侵染早期，根結線蟲誘導取食位點的細胞周期蛋白和細胞周期蛋白激酶的表達，促進巨型細胞內復制，導致多核細胞的形成。

1.1.4 巨型細胞的周期變化 根結線蟲對取食位點中細胞周期的調控涉及大量的細胞周期基因的表達和激活［42］。在根結線蟲侵染寄主根部巨型細胞周期研究中，通過對周期蛋白依賴性激酶cdc2a 和有絲分裂周期蛋白cyc1At 基因的標記，發現在這些基因的轉錄激活與巨型細胞發育的早期階段相關［42-43］。同樣對根結線蟲侵染苜蓿（Medicago truncatula）根部研究發現，細胞分化和核內復制所需的細胞周期基因CCS52a 在誘導的巨型細胞中積累［44］。此外，研究表明細胞周期抑制劑KRP2，觸發有絲分裂CDK 活性的抑制和核內復制的過早發生，表明KRP2 參與巨型細胞的發育［45］。擬南芥細胞周期基因AtCDKA;1 的沉默，導致擬南芥對根結線蟲的敏感性降低。相反，擬南芥CDK 抑制物（ICK）/KIP相關蛋白（Krp）家族功能的缺失，對根結發育和線蟲繁殖的影響較小［46］。而植物細胞周期蛋白依賴性激酶（CDK）抑制劑，如擬南芥CDK 相互作用因子/抑制劑（ICK）/ kip 相關蛋白（KRP）家族中ICK2/KRP2 和ICK1/KRP1 參與控制南方根結線蟲誘導的巨型細胞有絲分裂到核內復制，巨型細胞的發育受ICK2/KRP2 蛋白水平嚴格調控［47］。并不是所有的Krp 都以相同的方式調節細胞周期，Krp6作為有絲分裂細胞周期的激活劑，參與巨型細胞多核和細胞動力狀態的保持［48］。通過對61 個核心細胞周期基因的表達深入分析發現，其中大多數基因在巨型細胞中表達［49］。紡錘體組裝檢查點（spindle assembly checkpoint）是一種精細的監測機制，確保進行有絲分裂的染色體在正確連接到紡錘體微管之前不會分離，而編碼紡錘體關鍵調節因子的基因都在巨型細胞中上調表達［50］。那么防治根結線蟲危害，是否可以通過控制細胞周期，抑制巨型細胞的形成，從而達到防治根結線蟲的目的，這一防治策略的可行性還有待深入研究。

1.2 巨型細胞的水分和營養供給

根結線蟲在建立取食位點后靜止不動，而完全依賴巨型細胞為其提供所需的養分和水分［15］。因此，取食位點內的細胞壁修飾、水分運輸，蛋白運輸等對于維持取食位點的正常功能至關重要。

巨型細胞也是線蟲所需水分的來源，而巨型細胞在形成的過程中額外增加了對水分的需求，因此，水分代謝是巨型細胞發育和維持的基礎。而線蟲誘導的巨型細胞的顯著特征之一是在木質部處形成細胞壁突起，從細胞壁伸入取食細胞的原生質中，幫助水分和營養物質從木質部運輸到取食細胞［22,41］。在巨型細胞中檢測到水通道蛋白特異性上調［38］，進一步發現該水通道蛋白屬于主要內在蛋白（MIPs）家族，該家族的成員在巨型細胞中也被發現上調和下調表達［24,29］。由于自身的物理化學性質，質膜的輸水能力有限。水通道蛋白除了擴散外，還可以通過質膜形成水孔，進一步促進水分的短距離輸送。

根結線蟲在建立取食位點的過程中，單糖作為修復損傷組織和細胞骨架的原料，大量糖類物質從地上部位向取食位點轉運。植物寄生線蟲通過口針刺穿寄主細胞的細胞壁，不同類型的線蟲從取食細胞中提取營養物質略有不同。1975 年，Jones 等［20］通過研究鳳仙花根的跨膜電位，發現了根結線蟲寄生后活性糖轉運到巨型細胞的跡象。研究還發現根結線蟲侵染后，擬南芥根中幾種轉運基因的表達存在差異［37］。而在線蟲侵染21 d 時氨鹽基轉運基因AtAMT1;2 下調表達［51］。2021 年許立鶴［52］研究發現，在水稻中擬禾本科根結線蟲取食位點巨型細胞內，蔗糖是通過胞間連絲而非水稻蔗糖轉運蛋白進行運輸。

植物寄生線蟲完全依賴寄主植物提供的水和營養，而如何獲取營養物質取決于線蟲的取食策略。寄生線蟲-植物通過復雜的相互作用，誘導植物根部形成特定的取食結構。研究表明，孢囊線蟲合胞體是同質分離，在發育早期階段，運輸蛋白負責營養供應，之后通過胞間連絲與韌皮部建立聯系，從而獲得充足的同化產物［53］。但是，目前尚不清楚根結線蟲是如何迫使植物向其取食結構提供大量的營養物質，以及如何完成從單質向共質的溶質供應的轉變，這些作用機制還需要更加深入研究。

1.3 植物激素對巨型細胞的調節作用

根結線蟲在侵染的過程中會通過調節寄主植物的激素來幫助自身成功寄生［54］。植物內生激素在協調植物對寄生生物營養物和昆蟲的反應方面發揮了關鍵作用［55］。根結線蟲首先需要抑制植物防御系統，然后利用激素通路來建立和維修取食位點。因此，在巨型細胞發育的過程中，生長素、細胞分裂素、水楊酸、乙烯和茉莉酸等植物激素發揮重要作用［56-57］。

生長素可以調節植物細胞器的發生，而巨型細胞需要富集大量的細胞器以滿足旺盛的代謝需求，因此，巨型細胞發育和成熟與生長素的局部積累密切相關。研究認為，細胞增大、細胞壁增厚和細胞周期激活都可能有生長素調節，推測生長素可能是取食細胞形成和發育的基礎［43］。根據根結線蟲的分泌物中檢測到生長素及其相關化合物，推測線蟲通過分泌物干擾生長素合成酶來調控局部的生長素水平，從而誘導巨型細胞的形成［58］。在線蟲侵染早期，取食位點周圍的生長素的積累可能是由于線蟲自身的分泌，局部誘導的植物生物合成，并調控生長素的運輸［59-60］。研究表明，南方根結線蟲的分泌物在巨型細胞的形成過程中激活了生長素調節因子LBD16，該基因促進植物側根的發育，直接證明了根結線蟲可能或至少部分劫持了植物發育相關關鍵基因［60］。

巨型細胞中細胞分裂素的含量明顯增加，表明細胞分裂素參與巨型細胞的形成［61］。細胞分裂素在巨型細胞形成中發揮作用的直接證據是細胞分裂素氧化酶在根中的瞬時表達，該氧化酶負責細胞分裂素的降解，從而導致植物對RKN 更具抗性［62］。在巨型細胞顯微結構中，觀察到細胞分裂素信號的負調節因子普遍下調［24］。研究表明，在根結線蟲巨型細胞的形成中，乙烯發揮了作用［24,63-64］，但之后研究人員還發現，乙烯可能通過減少線蟲對根部的吸引力，從而抑制根結線蟲的感染［65-68］。

水楊酸、茉莉酸的研究主要集中在作為防御激素的作用。轉錄組分析發現，在線蟲侵染后的不同時間段，觀察到水楊酸途徑被抑制［24,68-69］。水楊酸正向調節線蟲的敏感性［70］，如超表達介導水楊酸信號的類似脂肪酸蛋白AtPAD4 或水楊酸途徑的正向調節因子NPR1 超表達時，植物對根結線蟲的敏感性均出現下降［71-72］，而水楊酸降解酶NahG 基因超表達，則增加了對線蟲的敏感性［65］。人們普遍認為外施茉莉酸會降低線蟲的感染［73］。油菜素類固醇（BRs）參與植物對根結線蟲的反應［65］，BRs 可能對茉莉酸具有拮抗作用［74］。近些年除了經典的植物激素外，多肽類激素也影響植物的生長和發育；值得注意的是，線蟲已經進化出植物肽激素（PPH）效應模擬物來促進寄生［54,75］。

在根結線蟲取食位點形成早期，生長素和細胞分裂素的積累有助于巨型細胞的形成。細胞分裂素能促進分生組織的細胞分化，可以調節有絲分裂G1/S 期，水稻根結線蟲通過調節生長素和細胞分裂素的平衡從而促進巨型細胞形成［76］。水楊酸、茉莉酸和油菜素內酯等參與植物防御反應，根結線蟲通過調控相關激素來抑制寄主的防衛，從而幫助線蟲的寄生。取食位點形成的過程中，線蟲通過調節寄主不同激素間的平衡來促進取食位點的形成。線蟲與寄主植物激素相關的報道較多，但是關于線蟲取食位點形成過程中，如何調控不同激素介導的信號通路，及其相互作用尚缺乏研究。未來可以通過借助高通量測序等技術，加強根結線蟲效應子與植物激素互作中的功能研究。

2 根結線蟲誘導巨型細胞形成的分子機制

根結線蟲從寄主的根部進入，首先需要突破寄主免疫防御反應建立取食位點。目前植物寄生線蟲關于調控寄主免疫方面的效應蛋白已經有大量的報道［77］。同時根結線蟲可以分泌多種效應物調控寄主植物根部細胞發育，誘導取食位點的形成［78］。并且巨型細胞的發育和維持需要線蟲的持續刺激。目前關于根結線蟲效應蛋白調控巨型細胞形成相關的細胞壁、核內復制、細胞骨架和物質運輸等方面均有報道。

2.1 寄主植物的識別和防御

在植物與線蟲的互作中，許多的差異基因已經被證實與線蟲的定殖相關，表明線蟲可操縱植物寄主細胞對植物基因表達進行大量的重新編程。在線蟲侵染過程中，對寄主影響的早期研究是在模式植物擬南芥中開展的，通過比較接種與未接種線蟲的擬南芥寄主根（根結區）的差異基因進行分析。之后大規模的轉錄數據提供了不同宿主基因表達模式差異［24,29,37,51,79］，如番茄（Solanum lycopersi?cum）［80-81］、 豇 豆（Vigna unguigulata）［82］、 水 稻（Oryza sativa）［83］、 龍 葵（Solanum torvum Sw.）［84］西瓜（Citrullus lanatus）［85］等。雖然數千個差異表達的植物基因與線蟲感染有關，這些響應線蟲的植物基因被歸類為與植物發育途徑和巨型細胞發育相關的類別，突出了防御和激素反應、細胞周期和細胞骨架組織、細胞壁和代謝重編程等，它們在植物防御反應、激素途徑，以及代謝重新編程中發揮著重要作用。植物觸發的免疫反應包括首先感知病原體相關的分子模式（pathogen?associated molecular pattern, PAMPs）由被破壞的植物組織通過分子模式識別受體（pattern recognition receptors, PRRs）釋放的損傷相關分子模式（damage associated molecular patterns, DAMPs）。然后，植物會通過激活防御反應來識別根結線蟲并對其做出反應。巨型細胞的發育與免疫反應直接相關，在辣椒中的抗根結線蟲基因Me1 通過抑制巨大細胞的發育從而表現出抗根結線蟲作用［86］，而Me3 基因以及番茄中Mi?1 等基因則是誘發HR（hypersensitive response, HR）反應，使巨型細胞的形成受阻，從而表現抗性［87-88］。對基因表達的全基因組分析表明，在根結線蟲與寄主的親和互作中，巨型細胞中參與防御途徑的大多數線蟲調控基因的表達受到抑制。例如，檢測到WRKY 轉錄因子家族的普遍抑制，這些轉錄因子家族已知作用于幾種植物激素的下游，以激活植物防御或編碼病程相關（PR）蛋白的基因［24,29,89］。

2.2 取食位點中基因的表達模式

取食位點需經歷一系列不同的階段，包括初期誘導、根結的形成、刺激細胞核分裂但細胞質不分裂、細胞伸長和擴張、細胞壁增厚、細胞質含量增加、DNA 內復制和代謝活性增加等，這些過程都伴隨基因表達的調控。研究人員利用多種方法對線蟲取食位點內的基因進行了上調表達和下調表達的分類，為確定哪些基因在取食位點的形成中起重要作用奠定基礎。例如，通過對南方根結線蟲侵染后的擬南芥全基因組的表達譜分析，鑒定出3 373 個基因存在顯著的差異表達，其中植物發育調控、非生物和生物脅迫信號轉導等相關基因的參與取食位點的形成［29］。2009 年研究人員對線蟲侵染植物后基因的變化進行了全面的綜述［39］。之后研究人員利用激光捕獲顯微切割技術對番茄感染線蟲早期的取食細胞進行分離和分析，與擬南芥相同發育階段的根結轉錄組測序結果比對分析，發現植物根結中117 個同源基因被共調控［81］。利用轉錄組分析爪哇根結線蟲侵染擬南芥以及擬禾谷根結線蟲侵染水稻早期根組織，發現在巨型細胞發育過程中維管束細胞間存在分子聯系，并假定為巨型細胞為干細胞［24,69］。測序技術的進步為深入解析根結線蟲取食細胞的形成提供了數據支持。

2.3 線蟲效應蛋白在巨型細胞形成中的作用機制

效應蛋白是由病原物產生的能進入寄主細胞，調控寄主細胞的信號轉導、免疫響應等功能的生物分子，植物寄生線蟲分泌蛋白，在線蟲侵入時抵御寄主防衛反應、建立取食位點的一些蛋白質或小分子物質也屬于效應蛋白［90-91］。根結線蟲食道腺分泌效應蛋白，通過口針注射到寄主植物細胞中，可調控寄主內不同的分子途徑、細胞周期、招募或劫持植物的功能效應分子，誘導維管細胞再分化形成巨型細胞［92-94］。在寄主植物和根結線蟲的互作中，已經報道了一些關于效應子在巨型細胞的形成中發揮作用，從而影響植物防御系統的研究［95］。

近年來隨著組學技術的快速發展，越來越多的關于根結線蟲巨型細胞相關的效應蛋白相繼報道（表1）。效應蛋白通過與寄主蛋白的互作，在植物的物質代謝、細胞結構、物質運輸以及基因轉錄中發揮作用，參與調控根結線蟲巨型細胞的形成。效應蛋白參與降解細胞壁。在植物寄生線蟲中第一個鑒定出的相關效應蛋白為β -1,4?Endoglucanase，它可以降解植物細胞壁，打破線蟲寄生的第一道屏障［114］；之后研究人員從根結線蟲中克隆到具有纖維素酶和果膠酶降解活性的一些基因，這些基因與降解細胞壁相關；在線蟲侵入時，線蟲也會產生一些功能性的延伸蛋白，有助于線蟲的寄生［115］；爪哇根結線蟲中克隆的Mj?pel?1，對果膠有高活性，在根結線蟲侵染早期起重要作用［96］。（1）效應蛋白參與調節細胞骨架的形成和物質運輸。第一個報道這類功能的效應蛋白是通過口針分泌到寄主體內的鈣網蛋白（Mi?CRT），線蟲在遷移期和靜止期分泌Mi?CRT，并在巨型細胞中聚集，為線蟲食道腺蛋白分泌到取食位點提供證據［97］；可以促進線蟲寄生的效應蛋白MiPFN3，影響寄主中的肌動蛋白的多聚過程，從而影響細胞骨架［98］；北方根結線蟲和南方根結線蟲食道腺產生的8D05/Msp9 與寄主植物中的水通道蛋白TIP2 特異性結合，在線蟲寄生過程中參與調節巨型細胞內溶質和水分子的運輸［99］。（2）線蟲效應蛋白與植物靶標蛋白在細胞核中互作的功能研究。一些效應蛋白定位在細胞核中，如爪哇根結線蟲的背腹食道腺中分泌的效應蛋白MJ?NULG1a 定位在巨型細胞的細胞核中，在線蟲寄生的過程中起關鍵作用［100］；南方根結線蟲可以將效應蛋白MiEFF1 和MiEFF18分泌到寄主體內，其中MiEFF1 定位在巨型細胞核內，與脅迫蛋白、胞質甘油醛?3 磷酸脫氫酶相互作用，影響線蟲的寄生［101-102］；而MiEFF18 是根結線蟲保守的效應蛋白，誘導植物根細胞再分化為巨型細胞，并與茄科植物中保守的剪切體SmD1 蛋白互作，通過選擇性剪切影響巨型細胞的形成和線蟲的發育［103-104］；最近的研究表明南方根結線蟲效應蛋白Mi2G02 與寄主植物的trihelix 轉錄因子GT?3 互作，通過調控下游基因的表達，從而誘導寄主的生長發育和線蟲取食細胞的形成［105］。（3）效應蛋白參與調節植物激素。南方根結線蟲和爪哇根結線蟲中發現的分支酸變位酶CM?1/CM?2 參與巨型細胞的分化和取食位點的形成［106］，Mj?CM?1 通過引起對分支酸的競爭來減少吲哚乙酸合成，導致分支酸衍生的代謝物的改變，并最終影響植物細胞的發育［107］。（4）效應蛋白參與細胞代謝。爪哇根結線蟲和南方根結線蟲中均可產生的一類脂肪酸與視黃醇結合蛋白FAR?1，在植物中表達時被證明影響植物細胞質代謝，促進巨型細胞和線蟲的發育［108-109］；南方根結線蟲效應蛋白Mi?SBP?1（含有DNA 結合轉錄因子的螺旋-環-螺旋結構域）可調控寄主的幾種脂肪酸的合成，當Mi?sbp?1 基因沉默后巨型細胞中脂肪儲備能力喪失，線蟲發育減慢，寄生能力降低［110］；最新研究發現象耳豆根結線蟲分泌效應蛋白MeMSP1 到巨型細胞中，與擬南芥中的谷胱甘肽轉移酶（AtGSTFs）互作，導致寄主谷胱甘肽積累，有利于線蟲的寄生［111］。效應子可以對寄主細胞內的轉錄過程重新編程［116］。在多種線蟲的亞腹食道腺發現效應蛋白16D10/Msp16 可以刺激根系生長，并與寄主擬南芥中SCARECROW 類轉錄因子（SCARECROW?like transcription factors）AtSCL6 和AtSCL21 互作，誘導巨型細胞形成和維持［112-113］。

表1 根結線蟲中已報道參與巨型細胞相關效應蛋白Table1 Reported relevant giant cell-associated effectors in root-knot nematodes

3 展望

根結線蟲誘導寄主植物維管束部分細胞形成巨型細胞，為線蟲自身的生長發育提供營養物質。根結線蟲可誘導數千種寄主植物形成類似取食位點，這種模式在線蟲和寄主植物相互進化的過程中具有保守性。早期的研究主要集中于寄主的抗性或者是線蟲的生長發育［117］。近年來，隨著基因組、蛋白質組學、轉錄組學以及比較基因組的快速發展，巨型細胞形成的分子機制也得到一定程度的揭示。線蟲-寄主植物互作的報道明顯增加，尤其是對根結線蟲效應因子在調控寄主免疫反應、降解寄主細胞壁、激素相關的調控等研究方面取得了實質性的進展［77,118］。通過免疫組化的方法，發現許多效應蛋白可以分泌到巨型細胞中，但這些效應蛋白的功能及其在巨型細胞形成和維護中的作用仍需要進一步研究，特別是線蟲效應蛋白是如何直接或間接地影響巨型細胞的細胞周期。據推測，一些蛋白可能特異性地激活巨型細胞有絲分裂M 期促進因子的活性或者誘導S 期相關基因的表達，而另外一些分泌蛋白可能改變巨型細胞中的泛素化途徑來影響細胞周期［119］。這些問題尚需進一步證實。而與細胞壁重塑相關的線蟲效應子或植物基因尚未被鑒定出來，且其在巨型細胞壁的生物合成中的作用仍知之甚少。

借助轉錄組測序分析發現，巨型細胞與正常的維管束細胞中存在著大量的差異表達基因，這些基因的差異表達可能是由于可變剪切機制誘導產生的。最近報道的具有核定位的效應子MiEFF18，可以與寄主中的可變剪切體SmD1 蛋白互作，通過RNA?seq 分析該效應子發現，其通過可變剪切的手段影響巨型細胞的發育［103-104］。然而，植物全基因組可變剪切在根結線蟲侵染過程中功能的普遍性，以及根結線蟲效應子調節可變剪切的機制尚不清楚。根結線蟲在寄生過程分泌許多核定位的效應子，這些效應子是否參與調節寄主植物細胞基因的可變剪切，進而促進“巨型細胞”形成和干擾植物免疫反應也有待進一步驗證。

在巨型細胞的形成過程中各種激素之間相互協調，發揮作用。越來越多的研究表明，線蟲已經進化出植物肽激素效應模擬物和植物激素，協調或調節巨型細胞的形成，微調根系的發育程序，以促進巨型細胞的形成。根結線蟲可能通過招募一些基因驅動多能細胞，誘導這些細胞分化形成巨型細胞，但對線蟲招募的基因了解仍然較少［120］。隨著現代組學技術的快速發展，以及基因編輯的大量應用，可以找到線蟲互作的植物靶標，通過干擾或者編輯的手段開辟根結線蟲控制新策略，并進一步開發應用。