微藻鹽脅迫響應分子機制研究進展

沈天虹 齊孝博 趙瑞豐 馬欣榮

（1.天津科技大學省部共建食品營養與安全國家重點實驗室，天津300457； 2.天津科技大學生物工程學院，天津300457）

微藻是一類在顯微鏡下才能被識別的單細胞類群體，由真核微藻和原核藍藻組成。真核微藻起源多系，并且具有漫長的進化歷史。原核藍藻，又稱藍細菌，是地球上出現的最早可以進行光合作用的原核宿主。微藻作為初級生產者之一，廣泛存在于各種自然環境中，甚至在鹽堿地和鹽湖等極端環境中也能發現其蹤跡［1］。作為光合生物，微藻能捕獲環境中的CO2來合成主要代謝物，即碳水化合物、脂類、蛋白質以及一系列重要的商業化產品，如藻膽素、類胡蘿卜素、甾醇、維生素等［2］。其中，中性脂類和碳水化合物被認為是適合生物燃料（生物柴油和乙醇）生產的初級生物分子［3］。因此，微藻被認為是一種極具應用前景的第三代生物柴油原料［4］。特別是富油新綠藻（Neochloris oleoabundan）、斜生柵藻（Scenedesmus obliquus）和三角褐指藻（Phaeodactylum tricornutum）等被認為是最具產油潛力的能源微藻［5-7］。此外，微藻能夠從工業、農業和生活廢水中固定氮和磷，吸附重金屬，從而減少水質污染［8］。據研究報道，利用小球藻屬例如普通小球藻（Chlorella vulgaris）、微小小球藻（Chlorella minutissima）、蛋白核小球藻（Chlorella pyrenoidosa）進行廢水處理的應用實例較多，吸收效果顯著，效率高達90%以上［9-11］。因此，微藻有著廣闊的商業應用前景。圖1 簡要介紹了微藻在不同領域的應用。

圖1 微藻在不同領域的應用Fig.1 Applications of microalgae in different fields

然而，育種工作者在對微藻的擴大培養過程中，發現鹽度是限制其生物質生產力的最重要的環境因素之一。過量的鹽分濃度會對微藻的生理、生化和代謝產生不利影響［12］。圖2 顯示了微藻中作為模式生物的淡水綠藻，萊茵衣藻（C.reinhardtii）在鹽脅迫下的細胞形態、生理、生化和分子水平的變化。

圖2 萊茵衣藻（C.reinhardtii）在受到鹽分脅迫時形態、生理、生化和分子水平上的變化Fig.2 Changes in morphology, physiology, biochemistry and molecular level of C.reinhardtii under salt stress

微藻廣泛地分布于陸地、海洋、淡水湖泊等領域，但絕大多數微藻屬淡水藻，淡水除了需要支持人類活動、糧食作物生產等之外，在微藻的大規模培養中也至關重要［13］。據估計，每產生1 kg 微藻生物量大約需要1 t 淡水。目前，地球上淡水資源占總水量的2.8%，而海洋約占地球總量的96.53%［14］。因此，利用海水養殖將減少大規模養殖微藻的淡水需求。如何讓微藻適應海水中的高鹽脅迫并大量繁殖也成為一個懸而未決的問題。為了對微藻的耐鹽機制進行系統的研究，有必要采用多組學技術，包括轉錄組學、分泌組學、蛋白質組學和代謝組學等，以深入了解并建立一個完整的微藻耐鹽、抗鹽機制圖譜［12,15-18］。附表1 簡要總結了近10 年來研究者針對微藻在鹽脅迫下的“組學”分析結果。近些年，研究者們在鹽湖、鹽堿地或者池塘已經分離純化到一些新型耐鹽藻，相關耐鹽藻的基因組測序和挖掘其耐鹽基因也在有條不紊地進行。本文闡述了目前已被研究發現的兩種不同類型的微藻響應鹽脅迫機制，同時著重總結了杜氏鹽藻、鹽生隱桿藻、皮克綠球藻等相關耐鹽藻的應用實例。本文旨在為微藻以及高等植物的耐鹽性能的提高提供重要的理論和分子依據，并提供可行性策略。最后，討論了一些典型的鹽響應基因在優良藻種選育中的價值與應用前景，并以萊茵衣藻（C.reinhardtii）為出發藻，對構建高耐鹽性藻株所面臨的挑戰進行了討論。

1 微藻響應鹽脅迫的機制

鹽脅迫是影響植物生長發育的主要環境脅迫之一，它會增加植物滲透壓，導致細胞內鈉積累至毒性水平。因此，植物通過多種機制來適應鹽脅迫信號，例如調節離子穩態、激活滲透脅迫途徑、介導植物激素信號轉導、調節細胞骨架動態和細胞壁組成等［19］。多年來，研究者們已經發表了多篇關于各種微生物和高等植物在鹽脅迫下生理反應和其具體分子調控機制的相關綜述［19-21］。然而，關于微藻在鹽脅迫響應的相關綜述卻罕有報道。鑒于此，本文系統闡述了真核微藻和原核藍藻響應鹽脅迫的具體機制與各種策略。

1.1 真核微藻響應鹽脅迫的機制

1.1.1 跨膜轉運蛋白的重組 通過細胞膜吸收和輸出離子來維持細胞內離子平衡是微藻應對高鹽脅迫的重要策略之一。高濃度Na+會干擾其他陽離子的吸收，尤其是K+。由于K+在植物中參與許多生理功能，所以在高鹽條件下維持胞質K+/Na+比率是至關重要的［22］。

膜轉運蛋白的上調可以促使微藻主動轉運K+，從而賦予藻類對高鹽度的耐受性。Foflonker 等［23］通過對皮克綠球藻（Picochlorum SENEW3）基因組測序發現，其中一些轉運蛋白是Picochlorum SE3 具有廣泛耐鹽性所必不可少的。例如，與青綠藻（Ostreococcus tauri） 相 比，Picochlorum SE3 的contig_33.g34.t2 所編碼的6 個基因拷貝與擬南芥（Arabidopsis thaliana）鹽過度敏感基因AtNHX8 的同源性很高。AtNHX8 編碼一種質膜Na+/H+逆向轉運體，參與細胞內Na+的外排。此外，Picochlorum SE3 基因組中編碼一個已被注釋為Na+/K+?ATP 酶亞基的基因，它參與到鈉從細胞內的主動外排且此過程依賴ATP。在高pH 條件下，Na+/K+?ATP 酶亞基相比于Na+/H+逆向轉運蛋白有更好的Na+轉運效果［24］。Na+/K+ATP 酶最初被認為是動物獨有的，但近來在一些藻類中也發現了Na+/K+ATP 酶的同源基因，這些藻類包括杜氏鹽藻（D.salina）［25］，赤潮異灣藻（Heterosigma akashiwo）［26］和 條 斑 紫 菜（Porphyra yezoensis）［27］。此外，經研究發現杜氏鹽藻（D.salina）能保持細胞內Na+濃度低于外部培養基的濃度［28］，D.salina 的Na+/H+逆向轉運蛋白能催化Na+的向內流入，然后通過Na+?ATP 酶和質膜電子轉運系統向細胞外輸出Na+。因此，杜氏藻的這種Na+輸出是一種進化的、適應高鹽環境的機制。有趣的是，似乎與海洋或高耐鹽藻類不同，淡水或鹽敏感性微藻不能通過阻止Na+的攝取，而能通過積累K+或泵出Na+離子來維持細胞內離子濃度，從而將細胞恢復到其正常或接近正常的穩態。

1.1.2 滲透調節物質的積累 真核藻類大多具有剛性細胞壁，其改變細胞體積的能力有限，因此很大程度上依賴有機溶劑進行滲透調節［29］。這些有機溶劑，通常是指在高濃度下具有中性電荷和低毒性的有機小分子［30］。甘油是常見的有效相容性溶質之一，由大多數鹽敏感性藻類物種在高鹽脅迫下產生。它是一種終產物代謝物，因此生產和蓄積不會干擾其他代謝途徑。同時，甘油是分子量最小的有機滲透溶質，因其滲透性太高使得其在原核生物中幾乎無法存留，只能部分存在于真核生物中［31］。有研究表明，萊茵衣藻（C.reinhardtii）在受到200 mmol/L NaCl 脅迫時，會在早期（2-4 h）快速積累甘油以應對滲透脅迫［15］。同樣的，在高鹽脅迫下，杜氏鹽藻（D.salina）也積累大量甘油，并且它細胞內積累的甘油含量能與外部鹽濃度成比例［32］。因此，杜氏鹽藻也常常被用作研究植物滲透調節模式的光合生物之一［33］。脯氨酸是另一種滲透主要調節物質，特別在高等植物和藻類中，隨著鹽度的增加，其濃度也呈線性增加。和甘油一樣，它的分子量很低，帶中性電荷，而且具有較高可溶性。鹽脅迫下，微藻中脯氨酸的生物積累可能與△1?吡咯啉?5?羧酸合成酶（P5CS）有關［12］。除脯氨酸外，其他氨基酸如賴氨酸和亮氨酸也參與促進真核綠藻如萊茵衣藻（C.reinhardtii）在高鹽條件下的生長［34］。然而，關于這些氨基酸在滲透調節中的具體作用的研究并不多。而藍藻在高鹽條件下積累的滲透調節物質與真核微藻有一定的不同，下文會做具體闡述。

1.1.3 抗氧化防御通路的誘導 高鹽會誘發微生物體內離子滲透和氧化應激［35］。微藻在鹽脅迫下會產生各種活性氧（ROS），包括單線態氧（1O2）、超氧化物（O2-）、過氧化氫（H2O2）［36］。ROS 在細胞內信號級聯中充當二級信使，激發各種非生物和生物脅迫的適應性反應。然而，高ROS 的積累同時也會破壞蛋白質、脂質和核酸等生物大分子，影響細胞代謝和正常生理功能［37］。

為了清除過量的有毒ROS，微藻尤其是真核綠藻，能自身進化形成多種ROS 防御途徑。各種抗氧化酶如超氧化物歧化酶（SOD）、過氧化氫酶（CAT）、抗壞血酸過氧化物酶（APX）和過氧化物酶（POD）等以及非酶分子起到重要作用。其中，SOD 是抵抗ROS 的第一道防線，將超氧自由基置換為分子氧和過氧化氫來保護細胞免受氧化應激［38］。同時，H2O2后續可以被CAT、POD 或APX 分解為H2O 和O2［39］。除了酶促抗氧化系統中的相關酶具有ROS的解毒作用，一些非酶分子如抗壞血酸、谷胱甘肽、類胡蘿卜素等，也可以作為抗氧化系統中的組分來緩解微藻細胞內的氧化應激損傷［37］。此外，抗壞血酸-谷胱甘肽循環（AGC）被認為是連接抗氧化劑和抗氧化酶循環來分解H2O2的基本代謝途徑［40］。單脫氫抗壞血酸還原酶（MDAR）是植物中催化氧化型抗壞血酸（AsA）轉化為還原型AsA 的關鍵酶之一。MDAR 通過維持細胞內抗壞血酸的還原狀態，在植物抗氧化脅迫反應中起重要作用［41］。值得一提的是，Lin 等［42］研究發現通過增強脫氫抗壞血酸還原酶（DHAR）活性能促進AsA 的再生，進而調節萊茵衣藻抗氧化脅迫的AGC 循環活性。近期，Choi等［43］發現在氧化脅迫條件下誘導的堿性亮氨酸拉鏈（bZIP）轉錄因子BLZ8 可以通過碳濃縮機制（CCM）來保護萊茵衣藻（C.reinhardtii）免受ROS的傷害。該研究結果為陸生植物如何通過CCM 途徑應對環境脅迫提供了理論依據。

1.1.4 中樞代謝途徑的適應 大多數真核微藻都屬淡水綠藻，在高鹽度環境中呈現出發育遲緩，超過一定的鹽度閾值，一般無法生存。這些淡水藻株通常利用各種中樞代謝途徑，包括糖酵解、肯尼迪途徑和卡爾文循環來應對鹽脅迫［29］。

蛋白質組學表明，萊茵衣藻（C.reinhardtii）和極地雪藻（C.nivalis）在應對0.2 mol/L NaCl 脅迫時，卡爾文循環中的核酮糖?1, 5?二磷酸羧化酶小亞基（RuBisCO）在萊茵衣藻（C.reinhardtii）中的表達豐度降低。同時，RuBisCO 激活酶在這兩種微藻中的表達豐度也隨著鹽濃度增加而下降。RuBisCO 活性在C.reinhardtii 受到鹽脅迫時的降低說明了其光合活性也在下降［18］。此外，在0.2 mol/L NaCl 環境中，C.nivalis 在3 d 后積累的碳水化合物總量達到細胞干重的10.4%，12 d 后積累的脂肪酸達到52.0%，這也表明了高鹽可以成為C.nivalis 脂質積累的誘發劑。C.nivalis 也因其對環境變化的魯棒性和生物加工的低溫要求等優點而被認為是一種有潛力的生產生物燃料的藻類生物資源之一［44］。轉錄組學表明，C.reinhardtii 中參與碳水化合物（葡萄糖、淀粉和可溶性糖等）的相關基因表達呈現上調［15］，例如參與葡萄糖代謝的UDP?葡萄糖焦磷酸化酶UGP1/2、UDP葡萄糖基轉移酶UGT?80 在早期鹽脅迫下的表達顯著增強。

1.1.5 信號轉導蛋白的感知 信號轉導系統在微生物中很常見，可以幫助生物體感知和響應環境脅迫［45］。該系統中，鈣離子（Ca2+）在許多生理過程中發揮重要作用，如植物的生長、發育、非生物和生物脅迫等［46］。其中，鈣依賴蛋白激酶（CDPKs）被認為是信號轉導中重要的鈣（Ca2+）傳感器。Li等［47］從C.reinhardtii 基因組中鑒定出15 個CrCD?PK 基因，發現大多數CrCDPKs 在氮缺乏和鹽脅迫下被顯著誘導。此外，絲裂原激活蛋白激酶（MAPKs）通過磷酸化反應形成信號級聯的一部分，在所有真核生物中都保守存在。MAPK 級聯主要由3 種蛋白 組 成：MAPKKKs、MAPKKs 和MAPKs［48］。 有研究發現，杜氏鹽藻（D.salina）中的MAPKK1（MEK1）有兩種剪接方式，分別是DsMEK1?X1、DsMEK1?X2，其中DsMEK1?X1 通過減少氧化損傷來響應鹽脅迫，而DsMEK1?X2 通過調節甘油合成來維持滲透壓平衡進而抵御鹽脅迫［49］。整體說來，真核微藻中關于鹽脅迫下信號轉導蛋白的研究較少，仍處于探索階段。

1.2 原核藍藻響應鹽脅迫的機制

1.2.1 活性膜轉運蛋白的調節 和真核微藻一樣，通過表達相關轉運蛋白來維持藍藻細胞內離子平衡是微藻抗鹽脅迫的重要策略之一，已在藍藻中鑒定并表征了一系列與耐鹽相關的轉運蛋白。到目前為止，在耐鹽藍藻鹽生隱桿藻（A.halophytica）中發現并證明了幾種具有耐鹽功能的轉運蛋白，例如nhap基因編碼的Na+/H+逆向轉運蛋白［50］、假定F0F1 型Na+?ATP 合酶操縱子（ApNa+?ATP）［51］和類Mrp 簇Na+/H+逆向轉運蛋白［52］，這些轉運蛋白能相應的提高轉基因植物的耐鹽性。此外，維持細胞內高鉀水平是降低Na+對細胞毒性作用的另一種策略。有研究者發現集胞藻（Synechocystis sp.PCC 6803）中與鹽相關的K+轉運蛋白主要由Ktr 和Kdp 系統驅動［53］。正是基于這些轉運蛋白的調節，一些藍藻才能夠在應對鹽脅迫時維持良好的細胞活性。

1.2.2 相容性溶質的積累 與真核微藻在鹽脅迫下積累甘油不同，藍藻通常通過積累蔗糖、甘油葡萄糖苷和甘氨酸甜菜堿等相容性溶質來應對高鹽脅迫［54］，而細長聚球藻（S.elongatus UTEX 2973）則在鹽脅迫下能夠產生蔗糖（0.17 g/L）作為唯一的相容性溶質［55］。此外，甘氨酸甜菜堿能夠在高鹽度和干旱等脅迫條件下通過生物合成［56］。生物體內甜菜堿的生物合成途徑主要以膽堿為底物進行的兩步氧化反應。研究者也嘗試著將膽堿兩步氧化反應所涉及的關鍵酶膽堿脫氫酶（BetA）和甜菜堿乙醛脫氫酶（BetB）外源引入到相關淡水微藻中，然而效果并不明顯［57-58］。幸運的是，有研究報道從鹽生隱桿藻（A.halophytica）細胞中分離得到兩個N?甲基轉移酶，這兩個N?甲基轉移酶能夠催化以甘氨酸為底物，通過三步甲基化最終合成甘氨酸甜菜堿［59］。近年來，也有研究者將鹽生隱桿藻（A.halophytica）的甘氨酸甜菜堿合成途徑引入到魚腥藻（Anabaena sp.PCC 7120）和煙草（tobacco）中，都取得了不錯的抗鹽效果［60］。總之，相容性溶質在高濃度鹽分下能使不同的酶有效運作，在平衡外界介質和細胞質之間的滲透壓中起著重要的作用［29］。

1.2.3 脂質和烷烴的積累 一些藍藻能在鹽脅迫下積累脂質和烷烴。例如，在鹽脅迫下聚球藻（Synechococcus sp.PCC 7942）脂質積累增加并且其脂肪酸組成發生變化；在10、50、100、250 和500 mmol/L NaCl 條 件 下，Synechococcus sp.PCC 7942 的飽和脂肪酸（SFA）相比于對照組，分別降低了82.79%、12.67%、5.77%、74.18% 和4.58%；而 不飽和脂肪酸分別增加了102.72%、16.05%、7.67%、49.14%和6.17%［61］。由于不飽和脂肪酸比飽和脂肪酸具有更低的熔點以維持細胞膜的流動性，因此不飽和脂肪酸的增加可能是藍藻抵抗鹽脅迫的一種適應性反應。在鹽脅迫下，聚球藻（Synechococcus sp.PCC 6311）體內不飽和脂肪酸和磷脂酰甘油比例增加［62］。Ritter 和Yopp［63］又觀察到，當耐鹽藍藻（A.halophytica）暴露于鹽脅迫時，單/雙半乳糖二酰基甘油的比例發生變化，這種鹽脅迫下極性脂質的變化可能會減少鈉的流入并減少鹽脅迫下藍藻光合作用的損害［64］。此外，Yamamori 等［65］構建了淡水藍藻聚球藻（Synechococcus sp.PCC 7942）中烷烴合成基因的缺失突變體。該突變體不能產生烷烴，并在低鹽度下表現出正常的生長表型。但是，突變體變得對鹽敏感。然而，來自鹽生隱桿藻（A.halophytica）的烷烴合成基因在Synechococcus sp.PCC 7942 中過量表達時，該缺失突變體恢復了生長缺陷并且其能在高鹽脅迫下產生大量的烷烴。

1.2.4 胞內第二信使的調節 第二信使是由特定外部刺激調節而產生的細胞內物質，細胞能通過依靠第二信使對環境變化做出快速反應。已經在藍藻中確定了一系列第二信使，它們在介導細胞對氧化應激、營養失衡和環境溫度變化的反應途徑中發揮作 用［66］， 如cyclic?di?AMP（c?di?AMP） 和cyclic?di?GMP（c?di?GMP）［67-68］。有研究表明，在鹽脅迫下，c?di?AMP 水平在集胞藻（Synechocystis sp）和聚球藻（Synechococcus sp.PCC 7942）中沒有變化，而在Fremyella diplosiphon 中較低，在魚腥藻（Anabae?na sp）中較高。同時，在山梨糖醇誘導的滲透脅迫下，c?di?AMP 水 平 在Synechocystis sp.PCC 6803 和F.diplosiphon 中都有一定增長，在Anabaena sp.和Synechococcus sp.PCC 7942 中 卻 不 受 影 響［69］。與c?di?AMP 相比，c?di?GMP 于近年來才漸漸出現在一些微生物的報道中：在藍藻中，c?di?GMP 在趨光性和細胞聚集方面發揮作用［70］；而關于第二信使在藍藻中的研究仍處于初級階段，需要進一步探索。

通過對這兩類微藻鹽響應機制的總結發現，真核藻和藍藻都能通過調節轉運蛋白活性和積累滲透調節物質來響應鹽脅迫。其中值得注意的是，真核微藻通常積累甘油、脯氨酸等物質來應對高鹽損傷，而藍藻往往通過甘氨酸甜菜堿和蔗糖等滲透調節劑來維持細胞內離子平衡。在面對高鹽脅迫時，都能觸發這兩種微藻的氧化應激，而一些真核微藻特別是淡水綠藻中的一些抗氧化酶能有效清除氧化應激過程中所產生的活性氧（ROS）。此外，一些真核微藻能夠利用糖酵解、肯尼迪途徑和卡爾文循環等中樞代謝途徑來應對高鹽脅迫, 而一些藍藻如聚球藻等則通過積累脂質和烷烴等生物大分子來抵抗鹽脅迫。一些信號蛋白在植物的生長發育、生物和非生物脅迫中起著至關重要的作用，真核微藻中的Ca2+傳感器和信號級聯蛋白激酶能在鹽脅迫下被顯著誘導，而對于藍藻而言，胞內第二信使例如c?di?AMP和c?di?GMP 等水平會在鹽脅迫下有顯著變化。由此可見，不同微藻可以通過多種機制來適應高鹽的極端環境，了解這些機制有助于微藻應答鹽脅迫的系統化網絡的建立。除了上述提到的多種機制外，還有其他與鹽脅迫相關的基因或蛋白在這里未做具體闡述。因此，繼續探索微藻適應鹽脅迫的策略意義重大。未來應該繼續挖掘耐鹽基因/機制，進而更高效地提高微藻的耐鹽性能。

2 天然耐鹽藻的開發利用研究進展

高鹽離子滲透和氧化脅迫會使微藻生長遲緩［29］。因此，研究者們通過各種手段來增加微藻的耐鹽性。已有研究表明，適應性實驗室進化（adaptive laboratory evolution，ALE）是一種提高微生物極端環境耐受性的有效方法之一［71］。在一項研究中，萊茵衣藻（C.reinhardtii CC?503）通過在含有200 mmol/L NaCl 的液體TAP 培養基中連續傳代馴化培養。經過1 255 代后，進化鹽（evolved salt，ES）細胞在高鹽培養基中的生長速度與起始細胞（progenitor cells）相當［72］。Kato 等［73］采用實驗室適應性進化和誘變相結合的方法來試圖提高衣藻（Chlamydomonas sp.JSC4）在高鹽條件下的生物量。經過在5%和7%海鹽下的長期連續培養，獲得了在7%海鹽下也生長良好的耐鹽藻株（KNA?001 和 KHI10?50/40?100）。雖然ALE 被證明是可行的，但是在實驗室條件下對微藻進行長期高鹽馴化不僅耗時長，而且還存在效率低和ALE 機制分析不清晰等問題。

植物轉基因手段也是提高淡水藻株耐鹽能力的另一條可行途徑。來源于微藻的且經實驗證明與耐鹽相關的基因已總結于附表2 中。近期，科學家們也在不斷開發天然耐鹽藻，挖掘它們潛在的耐鹽基因，為植物耐鹽工程的發展奠定基礎。例如杜氏鹽藻（D.salina）就是一種極好的天然耐鹽藻，它能夠在0.05-5.5 mol/L 左右的飽和NaCl 濃度范圍內生長良好［74］，D.salina 又能通過調節細胞內甘油濃度維持細胞內外的滲透壓［75］。Gong 等［76］為了鑒定杜氏鹽藻中具有潛在耐鹽作用的新基因，建立了D.salina cDNA 文庫，并通過電穿孔將D.salina cDNA文庫轉化進雨生紅球藻（Haematococcus pluvialis）感受態細胞中，將轉化后的雨生紅球藻在不同鹽濃度的平板中進行培養，觀察轉化子的表型變化。其中Ds?26?16 過表達雨生紅球藻藻株生長良好，且該基因被認為是潛在的鹽脅迫響應候選基因。過表達Ds?26?16 的轉基因煙草（tobacco）葉表面積、莖高、根長、總葉綠素和葡萄糖含量都顯著增加。杜氏鹽藻已被廣泛應用于各個領域，如耐鹽機理研究、廢水處理、重組蛋白表達、生物燃料生產和天然材料制備等，在生物工程領域具有廣闊的應用前景。除了杜氏鹽藻外，從美國太陽湖分離出來的耐鹽藍藻鹽生隱桿藻（A.halophytica）可以在0.25-3.0 mol/L NaCl 的鹽度范圍和外界高達pH 11.0 的極端堿性條件下生長［77］。在過去的近20 年間，科學家們也鑒定并克隆得到A.halophytica 的一些耐鹽基因［50-51,59］（附表2），例如表達ApNhap 編碼的Na+/H+逆向轉運蛋白能夠使淡水藍藻聚球藻細胞（Synechococcus sp.PCC 7942）在0.65 mol/L NaCl 鹽激下持續生長10 h，并且可以在含有0.5 mol/L NaCl 的條件下正常存活和生長。遺憾的是，已被認可的相當一部分天然耐鹽藻的遺傳轉化手段還未被建立，基因組測序也并未完成，有些微藻的耐鹽機制的解析也并不明朗，這也為后續的遺傳育種工作增加了難度。

3 總結與展望

作為最嚴重的非生物脅迫之一，高鹽極大地削弱了全球農業生產力。從長遠來看，高鹽嚴重影響了植物的正常生理/生化機制。植物生理/生化調控、轉錄/翻譯機制和表觀遺傳變化能夠隨著時間的推移顯著影響物種的表型和分布［78］。在鹽脅迫下，微藻的各種鹽應答機制的正常運作對其在脅迫條件下的健康生長顯得尤為重要。

幾種負責 Na+/K+轉運、激素信號轉導、離子穩態、ROS 清除系統等基因/蛋白質已被報道用于提高微藻乃至高等植物的耐鹽性。值得注意的是，從耐鹽藻的開發總結中發現在淡水固氮藍藻魚腥藻（Anabaena sp.PCC 7120）通過三親轉化法表達來自鹽生隱桿藻（A.halophytica）甘氨酸甜菜堿合成途徑中的關鍵酶ApGSMT?DMT，轉化子細胞獲得了一定耐鹽性［54］。Anabaena sp.作為光合固氮藻株在熱帶稻田的碳氮循環中起著重要作用，然而，魚腥藻對鹽極度敏感。因此，通過基因改造提高魚腥藻細胞的耐鹽性具有重要意義。獲得鹽耐受性的工程魚腥藻不僅能在不添加任何外來物質的情況下從頭合成甜菜堿，且甜菜堿含量能隨著鹽濃度的增加而提高，這也為魚腥藻在固氮減排和清潔生產提供了強大助力。微藻中一些典型的鹽響應基因資源不僅在微藻育種中發揮著重要作用，也可以用于提高一些例如煙草（tobacco）、擬南芥（Arabidopsis thaliana）等高等植物的抗逆性。來自A.halophytica 的DnaK1基因在煙草中過量表達時，經0.6 mol/L NaCl 處理3 d 后，轉基因煙草的固碳能力比對照細胞高約50%；在40℃的培養溫度下，有82% 的轉基因種子發芽，而只有27% 的對照種子發芽［79］。通過這些實例不難看出微藻的鹽響應基因對植物在脅迫條件下的生長發育有著重要的應用價值。近年來隨著氣候變化如長時間的熱浪、高強度的降雨和高二氧化碳濃度等對植物的生長都產生了一定的負面影響，一些滲透調節物質、熱休克蛋白和抗氧化酶不僅在植物耐鹽性中起作用，在其他的非生物脅迫中也發揮著重要作用。因此，微藻中鹽響應基因資源的挖掘對改善植物抗逆性能、增強微藻生產力和維持生態平衡至關重要。同時，前文提到在一定鹽脅迫下，微藻能將細胞資源轉向脂質積累，如油脂、二十碳五烯酸、二十二碳六烯酸、蝦青素等，說明一些抗鹽性能良好的藻株又是豐富的脂質資源。

隨著這些鹽脅迫響應基因的陸續發掘，目前也已經選育出許多優秀的轉基因藻株，然而迄今為止，只有少數幾種耐鹽微藻能夠被生物利用，因為細胞表型通常是受多基因調控，單基因或單代謝通路的簡單操作可能不會對植物實現精確有效的實時調控，也就無法通過單一操作來大幅度提升微藻的耐鹽性。此外，上文總結發現許多天然耐鹽藻的基因組測序和轉化手段并不完整，某些在耐鹽藻中被挖掘的耐鹽基因的調控機制也并不明朗。試圖進一步深入探討這些耐鹽微藻特殊抗逆基因的功能需要構建合適的分子生物學平臺，萊茵衣藻便是一個不錯的選擇。萊茵衣藻作為基礎科學和應用生理學和生物化學的模型已經被研究了超過40 年［80］。同時，萊茵衣藻具有細胞核基因組、葉綠體基因組和線粒體基因組3 套遺傳系統，基因組測序也已完成。它的核基因組中編碼C.reinhardtii 還含有一系列與脅迫相關的基因，因此可以被廣泛用于研究脅迫誘導的反應機制。它能夠在光能自養或異養條件下快速生長，適合經典的遺傳分析。在萊茵衣藻細胞內可以通過過表達基因、RNA 干擾和CRISPR/Cas 基因編輯技術來揭示耐鹽基因的功能［81-82］。萊茵衣藻在不同脅迫下的響應使其也能成為表征高等植物復雜脅迫轉錄組的理想系統。因此，C.reinhardtii 是可以作為研究光合生物中細胞鹽脅迫反應分子機制的良好模式生物。

目前在微藻中僅鑒定并克隆得到了有限的一些耐鹽基因。因此，為了推進微藻耐鹽工程的發展，除了利用多組學方法（即基因組學、轉錄組學、蛋白質組學和代謝組學等）來探究鹽脅迫條件下與微藻表型相關的脅迫應答基因、蛋白質、代謝物和代謝途徑外；不同基因組編輯工具，如成簇的規則間隔短回文重復序列/CRISPR 相關蛋白（CRISPR/Cas）和CRISPR/Cpf1 等工具也需要同時被充分發揮作用，共同推進微藻以及高等植物的抗鹽工程的發展。隨著合成生物學和人工智能技術的不斷發展，對關鍵抗逆元件進行靶向改造和理性設計將對微藻鹽脅迫研究的可持續發展和應用具有極大的意義。

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