畢赤酵母中外源蛋白表達量的提升策略

茹扎·也里扎提 楊宇

（北京理工大學生命學院，北京 100081）

外源蛋白的重組表達是指將一個物種的蛋白質編碼基因引入另一個物種的細胞（宿主細胞）中，從而允許宿主細胞表達外源蛋白質［1］。畢赤酵母（Pichia pastoris）已成為工業(yè)應用中蛋白質生產(chǎn)的常見菌株，被成功應用于1 000 多種外源蛋白的表達，許多外源蛋白基因在畢赤酵母中以g/L 水平表達，最高表達量已經(jīng)突破10 g/L［2］。畢赤酵母表達系統(tǒng)具有三個方面的優(yōu)勢：（1）作為單細胞生物易于遺傳操作，培養(yǎng)成本低；（2）在強大且嚴格調控的啟動子下高效分泌外源蛋白；（3）具有進行翻譯后修飾的能力，有益于生產(chǎn)可溶性和正確折疊的重組蛋白。雖然畢赤酵母表達系統(tǒng)經(jīng)過多年研究已有較為深入的認識，但也存在一定的局限性。首先，畢赤酵母并不能重組表達所有我們感興趣的蛋白。例如一些蛋白由于克隆變異、高糖基化、RNA 穩(wěn)定性等問題導致的蛋白失活不表達的現(xiàn)象［3］。其次，有一部分外源蛋白盡管能在畢赤酵母系統(tǒng)中表達，但是表達水平仍有待提升的空間。因此，進一步探索提升畢赤酵母中外源蛋白表達量的原理和方法，將對降低赤酵母表達系統(tǒng)工業(yè)化生產(chǎn)成本，提高經(jīng)濟效益，具有重要的意義。

本文從基因水平、轉錄水平、翻譯水平、折疊分泌水平、抗逆水平、發(fā)酵工藝六個方面歸納總結畢赤酵母提高外源蛋白表達的優(yōu)化策略（圖1），旨在全面地展示如何提高外源蛋白在畢赤酵母表達系統(tǒng)中的表達水平。為畢赤酵母作為工業(yè)規(guī)模的重組蛋白表達系統(tǒng)提供有益參考。

圖1 畢赤酵母中外源蛋白表達的優(yōu)化策略Fig.1 Strategies for increasing heterologous protein expression in Pichia pastoris

1 基因水平上提高外源蛋白在畢赤酵母中的表達量

畢赤酵母是工業(yè)中外源蛋白表達的成熟宿主系統(tǒng)，在基因水平上通過密碼子優(yōu)化和提高基因拷貝數(shù)是提高外源蛋白表達水平的常用方法。密碼子優(yōu)化常見的策略是使用首選密碼子替換稀有密碼子，以匹配密碼子使用偏差。目的基因的高拷貝整合可以通過多拷貝表達載體或抗性篩選高拷貝轉化子實現(xiàn)。

1.1 蛋白基因的密碼子優(yōu)化

不同的生物密碼子使用偏好性不同，因此需要將外源基因的密碼子優(yōu)化為適合宿主的密碼子。密碼子偏好對基因表達的影響被認為是由于其介導翻譯，密碼子會通過翻譯伸長率和準確性對翻譯效率產(chǎn)生影響［4］，并且密碼子的tRNA 數(shù)量與該密碼子的使用頻率存在正相關關系。最新發(fā)現(xiàn)表明，密碼子使用在決定基因水平上也有重要作用。使用不同密碼子能微調mRNA 水平和穩(wěn)定性［5］，而mRNA 降解在調節(jié)細胞轉錄本水平中起關鍵作用，是調控基因表達的主要控制點。

在畢赤酵母中重組表達果膠酶時，序列經(jīng)密碼子優(yōu)化后，果膠酶活性提高了20%［6］。Li 等［7］通過密碼子替換，改變了20%乙酰膽堿酯酶基因總序列，使堿基GC 含量提高到46.85%，密碼子適應指數(shù)（CAI）從0.70 提高到0.81。經(jīng)密碼子優(yōu)化的乙酰膽堿酯酶酶活達到139.7 U/mL，是野生型菌株的62.2 倍。Wang 等［8］通過密碼子優(yōu)化顯著提高了來自地衣芽孢桿菌的α-淀粉酶在畢赤酵母中的表達水平，經(jīng)密碼子優(yōu)化的α-淀粉酶在5 L 和50 L 生物反應器中甲醇誘導50 h 后最高酶活為8 100 U/mL 和11 000 U/mL，分別是原來的2.31 倍和2.62 倍。

1.2 蛋白基因拷貝數(shù)的增加

基因拷貝數(shù)變化與轉錄水平的相關性較高，通過增加目的蛋白的基因拷貝數(shù)，可以提高生產(chǎn)率。迄今為止，畢赤酵母中高拷貝目的基因的構建主要通過體外法和體內法。前者是通過體外串聯(lián)表達盒構建含有多拷貝的單個載體，獲得含有多拷貝的重組質粒［9］。通過這種方法，Zheng 等［10］成功構建了含有甘露聚糖酶基因的1、2、4、6 個拷貝的載體并且在畢赤酵母中成功表達了具有功能活性的甘露聚糖酶。特別地，該研究表明4 拷貝的甘露聚糖酶表達水平大于6 拷貝的。同樣地，Erden?Karao?lan等［11］使用不同DNA 拷貝數(shù)（1，2，3，4，5 和5 +）改善L?天冬酰胺酶在畢赤酵母中的表達，發(fā)現(xiàn)3 拷貝菌株產(chǎn)量最高。可能是由于拷貝數(shù)的增加可能導致與蛋白質折疊相關的氧化應激以及碳和能量供應不足從而影響轉錄翻譯水平。此類方法操作性強，但是由于載體大小的限制很難獲得含有超過10 拷貝表達盒的載體［12］。

體內構建法是選擇載體遺傳標記檢測，利用抗藥性篩選（如G418、zeocin）富集載體拷貝數(shù)增加的菌株。轉化后立即應用高濃度的藥物通常導致耐藥菌株的出現(xiàn)頻率較低，所選序列的拷貝數(shù)較低，而轉化后的多步選擇往往誘導高耐藥細胞的恢復，這些序列的拷貝數(shù)較多。所以通常采用轉化后載 體 擴 增（posttransformational vector amplification，PTVA）的方法，利用抗生素濃度的增加逐步篩選高拷貝的抗生素耐藥基因即目的基因［13］。該過程會導致抗性基因兩側同源臂片段而非整個載體的擴增，表明同源重組機制導致其產(chǎn)生多拷貝菌株［14］。如今，PTVA 法由于易操作以及成功率高等優(yōu)點被廣泛用于畢赤酵母，同時存在成本高的問題。后來有人對該法進行改進，提出了液體PTVA 法通過前期使用液體培養(yǎng)基的方式規(guī)避了費時費成本的問題［15］。

然而無論是體內、體外構建法，單純追求高拷貝會影響轉錄翻譯水平。實際上，不同蛋白有不同的最佳拷貝數(shù)，拷貝數(shù)并不是越高越好，增加拷貝數(shù)后產(chǎn)量不變或者減少可能是蛋白質折疊和分泌的限制。多拷貝菌株開發(fā)是影響畢赤酵母系統(tǒng)外源蛋白產(chǎn)生的關鍵因素，所以必須根據(jù)每種蛋白質的性質篩選合適的多拷貝菌株進行優(yōu)化。

基因水平上提高外源蛋白在畢赤酵母中表達量的應用及效果詳見表1。

表1 外源蛋白在畢赤酵母中通過基因水平的優(yōu)化提高表達策略Table 1 Gene level-optimizing strategies for enhancing heterologous proteins expression in P.pastoris

2 轉錄水平上提高外源蛋白在畢赤酵母中的表達量

啟動子和終止子是特殊的DNA 序列，屬于非編碼區(qū)，負責調控基因的轉錄。選擇合適的啟動子和終止子可以提高畢赤酵母外源蛋白的表達。畢赤酵母轉錄時除了需要啟動子、終止子等轉錄元件還需要轉錄因子協(xié)助，調節(jié)相關轉錄因子可克服外源蛋白的表達瓶頸（圖2），因此識別和開發(fā)新的轉錄因子非常重要。

圖2 轉錄水平上提高畢赤酵母中外源蛋白表達的示意圖Fig.2 A workflow diagram of enhancing heterologous proteins expression in P.pastoris at transcription levels

2.1 啟動子的合理選擇

轉錄是外源蛋白生產(chǎn)的關鍵步驟，啟動子作為轉錄過程的開關影響轉錄的起始及持續(xù)，最終控制目的基因表達的場所和地點［20］。因此，強大可控的啟動子是高效異源蛋白的關鍵工具。畢赤酵母啟動子主要分為誘導型啟動子和組成型啟動子，其中，最常用具有代表性的啟動子為甲醇誘導醇氧化酶1（promoter alcohol oxidase 1, PAOX1）啟動子和組成型甘油醛三磷酸脫氫酶（glyceraldehyde?3?phosp?hate dehydrogenase, PGAP）啟動子。

（1）PAOX1是一種在畢赤酵母中常用于生產(chǎn)重組蛋白的強效誘導啟動子，外源基因在PAOX1的作用下表達量可高達 22 g/L（胞內蛋白）和14.8 g/L（胞外蛋白）［19］，并且在生產(chǎn)過氧化氫酶［21］及腈水解酶［22］等重組蛋白時比另一大啟動子PGAP更有效。由于畢赤酵母產(chǎn)生乙醇氧化酶（AOX），但AOX 對氧的親和力很差，可以通過AOX1 和AOX2 兩個基因的表達進行補償，甲醇誘導的AOX1 啟動子已被廣泛用于構建載體。該載體有以下特征：①AOX1 啟動子片段；②AOX1 終止區(qū)；③3'AOX1 區(qū)；④HIS4 標記基因；⑤ColE1 序列和用于亞克隆到大腸桿菌中的抗生素抗性基因；⑥通過同源重組將載體整合到宿主基因組［23］。上節(jié)中提到高拷貝菌株不一定高表達，其限制因素主要發(fā)生在轉錄水平上，原因是拷貝數(shù)增加伴有甲醇代謝和過氧化物酶生物合成的轉錄衰減，導致異源蛋白分泌水平下降［24］。甲醇代謝受Mit1 和Trm1p 轉錄因子影響，因此Mit1［25］或Trm1p［26］的上調可以提高PAOX1效率，通過過表達Mit1 可以提高外源蛋白表達。除此之外，poly（dA:dT）啟動子元件的改變會影響PAOX1核小體形成及轉錄因子的結合，調整PAOX1的poly（dA:dT）元件可以調控啟動子強度從而提升表達水平［27］。許多蛋白都能通過PAOX1成功表達，但是該啟動子的缺陷在于需要甲醇誘導，而甲醇是一種有毒且易燃的化合物作為碳源存在危險。

（2）PGAP是一種表達水平與PAOX1相當?shù)慕M成型啟動子，因為消除了在大規(guī)模發(fā)酵中使用甲醇相關的安全問題，基于PGAP的畢赤酵母表達系統(tǒng)更適合大規(guī)模生產(chǎn)［28］，許多基因已在該啟動子驅動下在畢赤酵母中以g/L 水平表達［29］。幾丁質酶通過PGAP調控在1.5 L 發(fā)酵罐中蛋白量可達300 mg/L［30］。為了重組蛋白的高效表達，PGAP常與目的基因多拷貝策略結合使用，最近研究顯示葡聚糖酶首次通過PGAP高水平表達并在補料分批培養(yǎng)階段體積生產(chǎn)率達到1 706 U/（L·h）［31］。PGAP已經(jīng)通過上游調控序列的隨機突變進行了工程化，Ata? 等［32］通過靶向刪除或復制推測的轉錄因子結合位點（TFBS）構建了PGAP文庫，并且使用PGAP突變體制備了滴度高于野生型PGAP啟動子2.4 倍的人類生長激素重組蛋白。

（3）其他啟動子。由于啟動子在表達系統(tǒng)和生物過程效率中起著至關重要的作用，除了常用的PAOX1和PGAP，畢赤酵母啟動子也在被不斷開發(fā)和更新。甲醇誘導型啟動子還有AOX2、DAS、FLD1，組成型啟動子還有ENO1、YPT1 等［33］。其中，雖然AOX2 啟動子表達外源基因水平是PAOX1的10%左右，但AOX2 在促進細胞成長中有所應用，可以用于生產(chǎn)高分子量透明質酸［34］。而DHAS 和FLD1啟動子表達水平較強［35］，類似于PAOX1。組成型啟動子ENO1 表達水平是同類型PGAP的20%-70%［36］。YPTI 屬于弱表達啟動子，比用于表達目標蛋白的誘導型AOX1 啟動子弱約1 000 倍［37］，通過YPT1 啟動子可以避免轉錄機制過載的問題，導致目標蛋白的表達水平降低。除了上述討論的啟動子，近年來新發(fā)現(xiàn)的畢赤酵母啟動子也很有前景，如ADH3 啟動子［38］、GCW14 啟動子［39］、PDH 啟動子［40］。不同類型的啟動子對于外源蛋白的影響各有不同，為了使其在畢赤酵母中更好地發(fā)揮功能，應根據(jù)外源蛋白的結構、功能和特性選擇適合的啟動子或進行啟動子工程改造達到研究目的。

2.2 終止子的合理選擇

影響目的基因的轉錄水平的另一個因素是終止子，終止子在外源基因表達中的影響還沒有得到太多的關注。終止子作為外源基因表達單元中的重要組成部分，它定義了3'?非翻譯區(qū)（3'? untranslated region，3'?UTR），用于轉錄前RNA 分子的適當末端處理、切割和多腺苷酸化，以產(chǎn)生成熟的mRNA。已有證據(jù)表明，終止子通過影響mRNA 3'端加工、mRNA 穩(wěn)定性和翻譯效率等環(huán)節(jié)調節(jié)蛋白的表達水平［41］。Ramakrishnan 等［42］研究了終止子對Calb 基因表達的影響發(fā)現(xiàn)，終止子與低表達啟動子PGAP偶聯(lián)時，其影響被放大，展示出更高的酶活，以及顯示出終止子相關的mRNA 穩(wěn)定性增強。Ito 等［43］利用72 個終止子序列創(chuàng)建了“終止子庫”，通過交換來自釀酒酵母或畢赤酵母的終止子可以在較寬范圍（17 倍）內調節(jié)蛋白表達水平。

2.3 轉錄因子的過表達

轉錄因子是一種通過確定DNA 是否轉錄成RNA 來控制基因活性的分子，具有調節(jié)外源蛋白生產(chǎn)的巨大潛力，可用于增強蛋白表達。

Aft1 是一種亞鐵運輸?shù)募せ顒诋叧嘟湍钢蠥ft1 并不直接參與鐵的調節(jié)，而是參與碳響應調節(jié)。通過過表達Aft1，在補料分批生物反應器培養(yǎng)中能使羧基酯酶的分泌增加2.5 倍［44］。Aft1 的共表達顯著提高了水蛭透明質酸酶的表達，在3 L 發(fā)酵罐中，水蛭透明質酸酶酶活達到2.12×106U/mL，產(chǎn)酶能力達到1.96×104U/（mL·h）［45］。

Fhl1p 是一種新的畢赤酵母轉錄因子，在畢赤酵母中調控rRNA 加工、高爾基體囊泡轉運等過程，并有助于外源蛋白表達［46］。Fhl1p 的過表達對果膠酶和植酸酶的分泌具有顯著的益處，活性分別提高了20%和35%，并導致細胞內mRFP 水平升高［46］。

鋅簇蛋白SUT2 的表達可以被甲醇誘導但被甘油抑制，說明SUT2 可能參與甲醇代謝。SUT2 的過表達促進了AOX1 的表達，Yang 等［47］通過在不同位點截斷假定的SUT2 啟動子發(fā)現(xiàn)，ATG 起始的547-973 bp 區(qū)域被證明是誘導啟動子PSUT2 的核心元件，該啟動子對甲醇信號有強烈響應并驅動綠色熒光蛋白的表達提高了18%。

2.4 轉錄因子的去表達

畢赤酵母中轉錄因子的使用較廣泛和靈活。一些情況下，可以通過敲除轉錄因子來改善酵母細胞對環(huán)境的適應能力以及提高外源蛋白的表達。

ATT1 是關于半乳糖代謝的轉錄因子，與糖代謝相關。糖代謝會改變糖基化途徑對宿主細胞產(chǎn)生影響。沉默ATT1 基因使得人表皮生長因子受體?2單抗產(chǎn)量提高了1.5 倍，達到1.98 g/L。不僅如此，ATT1 的去表達提高了宿主的耐熱性，使其在35℃下能在15 L 發(fā)酵罐中生長150 h［48］。

Mig1 和Mig2 是抑制分解代謝的轉錄因子，能夠抑制甲醇利用途徑基因和PEX 基因［49］。畢赤酵母由于其強大的啟動子PAOX1驅動的蛋白質表達能力而被廣泛用于外源蛋白表達。但是關于該啟動子甲醇誘導和分解代謝抑制的轉錄調控網(wǎng)絡未完全闡明。Shi 等［50］發(fā)現(xiàn)畢赤酵母中PAOX1分解代謝的Mig 介導的轉錄抑制相關，敲除Mig 的酵母菌株在甘油作為碳源的條件下AOX 基因水平上調了30 倍，這表明Mig1 和Mig2 對PAOX1具有去抑制作用。

Nrg1 是一種轉錄抑制因子，作為DNA 結合抑制因子能消除葡萄糖對STA1 基因的抑制。與Mig 類似，可用于畢赤酵母中降低葡萄糖和甘油碳源環(huán)境對PAOX1的抑制［51］。而Mig1、Mig2 和Nrg1 三重基因敲除的突變體酵母菌株不僅能誘導AOX1 基因，還可以逆轉過氧化物酶體增殖、生物發(fā)生和分裂缺陷［52］。

轉錄水平上提高外源蛋白在畢赤酵母中表達量的應用及效果詳見表2。

表2 外源蛋白在畢赤酵母中通過轉錄水平的優(yōu)化提高表達策略Table 2 Transcription level-optimizing strategies for enhancing heterologous proteins expression in P.pastoris

3 翻譯水平上提高外源蛋白在畢赤酵母中的表達量

翻譯是基因表達過程中的重要步驟之一，但是目前利用畢赤酵母提高外源蛋白表達策略中翻譯水平相關的報道較少。然而從mRNA 到蛋白的翻譯過程還有大量變數(shù)，因此需要翻譯調控快速應答。而翻譯調控受翻譯相關因子影響，通過上調相關因子的表達可以從翻譯水平改善蛋白表達量。

3.1 翻譯起始因子的過表達

酵母表達系統(tǒng)外源蛋白產(chǎn)率與酵母細胞生長密切相關，而酵母生長過程中不能持續(xù)保持高生長速率，使得蛋白產(chǎn)率的優(yōu)化受到限制。翻譯元件的過表達為提高翻譯水平提供了思路，Rebnegger 等［54］分析了畢赤酵母的轉錄組數(shù)據(jù)并發(fā)現(xiàn)隨著生長速度的降低，蛋白翻譯相關基因明顯下調。該團隊觀察到，翻譯起始時Pab1 和eIF4F 分別與mRNA 3'poly（A）和5'cap 結合形成閉環(huán)結構。通過過表達與閉環(huán)結構相關的翻譯起始因子eIF2、eIF3、Rli1、eIF4F 和Pab1 作為靶基因，證明翻譯起始被確定為主要的限速步驟。過表達翻譯起始因子可積極影響翻譯活性和轉錄穩(wěn)定性，且不依賴于使用的菌株、啟動子以及模式蛋白，使不同重組蛋白產(chǎn)量提高3 倍［55］。該研究表明翻譯起始的閉環(huán)結構相關的因子限制了酵母中蛋白質的合成。過表達此類翻譯元件可以增強整體翻譯活性，提高重組蛋白的產(chǎn)量。

3.2 核糖體生物合成因子的過表達

核糖體是mRNA 翻譯的核心，是基因表達的關鍵過程。核糖體亞基組裝過程涉及數(shù)百種非核糖體因子，稱為核糖體生物合成因子（ribosome biogenesis factor, RBF），其功能是作為伴侶、修飾、加工、組裝和重塑因子［56］。林影團隊篩選出有利于外源蛋白表達的核糖體生物合成因子Bcy1，其過表達可以促進畢赤酵母細胞生長并提高報告蛋白熒光蛋白的產(chǎn)量［57］。對其進行進一步研究發(fā)現(xiàn)，Bcy1的過表達通過下調核糖體合成途徑，提升了增強型綠色熒光蛋白和植酸酶的分泌積累并提高了植酸酶的產(chǎn)量［58］。

3.3 其他翻譯相關元件的過表達

內部核糖體進入位點（internal ribosome entry site, IRES）具有募集核糖體的能力，無需依賴5'帽結構就可起始翻譯啟動蛋白質合成。林堯等發(fā)現(xiàn)，不同的 IRES 序列驅動的翻譯效率會引起β-半乳糖苷酶活性的差異，并利用β-半乳糖苷酶α 肽為報告基因篩選出畢赤酵母中功能性的IRES［59］。

翻譯水平上提高外源蛋白在畢赤酵母中表達量的應用及效果詳見表3。

表3 外源蛋白在畢赤酵母中通過優(yōu)化翻譯水平提高表達策略Table 3 Translation level-optimizing strategies for enhancing heterologous proteins expression in P.pastoris

4 折疊分泌水平上提高外源蛋白在畢赤酵母中的表達量

為了表達感興趣的蛋白，外源蛋白的正確折疊和分泌十分必要，該過程主要涉及信號肽的選擇和分子伴侶的共表達。信號肽是引導新合成的蛋白質向分泌通路轉移的位于蛋白N 端的短肽鏈，攜帶蛋白分泌信息，優(yōu)化信號肽能將重組蛋白產(chǎn)量提高到具有商業(yè)意義的水平［60］。在分泌途徑中，內質網(wǎng)在時空上維持著分子伴侶相互作用。分子伴侶形成的伴侶網(wǎng)絡會影響蛋白質折疊、構象和穩(wěn)定性。

4.1 信號肽的選擇和優(yōu)化

重組蛋白在酵母中的分泌表達需要信號肽引導進入內質網(wǎng)系統(tǒng)，這是新合成的蛋白質分泌表達的第一步［61］。常見的酵母信號肽有α-factor 信號肽、Killer 毒素信號肽、酸性磷酸酶信號肽（PHO1）、蔗糖酶信號肽（SUC）和菊粉酶信號肽（INU）等，其中α-factor 信號肽是畢赤酵母中最常用的信號肽，該分泌信號起作用的是19 個氨基酸α 因子的前體N 端部分，可以幫助外源蛋白翻譯后易位到內質網(wǎng)［62］，自身再被高爾基體中的Kex2 加工蛋白酶切割。α-factor 信號肽較其他信號肽更有效但也有進一步優(yōu)化的空間，其翻譯后易位機制容易導致一些蛋白在翻譯后提前折疊，轉移效率下降從而減少分泌。信號肽的效率決定了外源蛋白分泌表達，對α-factor 信號肽進行優(yōu)化改造可以提高蛋白表達量。最近，張娜等［63］發(fā)現(xiàn)通過使用畢赤酵母高頻密碼子對α-factor 信號肽進行優(yōu)化可以將葡萄糖氧化酶在畢赤酵母中的酶活力提高至野生型菌株的2.01 倍。Donelan 等［64］通過融合α-factor 信號肽與其他有益序列，利用嵌合前導序列OST1 與pro-αpp8 融合形成新型信號肽促進蛋白分泌，進一步提高了草酸氧化酶的產(chǎn)量和活性。而Püllmann 等［65］則是通過高通量篩選的辦法開發(fā)了一種聯(lián)合信號肽和啟動子的洗牌系統(tǒng)，通過對11 個內源性和同源啟動子與17種信號肽進行組合篩選，這種系統(tǒng)類似于定向進化可以用于在酵母中篩選真菌非特異性過氧化酶、脂肪酶CalB 和漆酶Mrl2 等。

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4.2 分子伴侶的共表達

外源基因的高轉錄水平可能使畢赤酵母的蛋白折疊能力飽和，導致未折疊蛋白通過內質網(wǎng)相關蛋白 降 解（ER?associated protein degradation，ERAD）。而分子伴侶蛋白可以通過幫助正確折疊（圖3）新合成的蛋白質來減輕內質網(wǎng)的負擔［61］。分子伴侶是一種輔助蛋白折疊，幫助其獲得功能活性或者穩(wěn)定構象，但不成為最后功能結構中的組分。常見的分子伴侶有二硫鍵異構酶（protein disulfide isomerase, PDI）、內質網(wǎng)蛋白折疊氧化還原輔助因子（endoplasmic reticulum oxidation 1, ERO1）、熱休克蛋白（Saccharomyces cerevisiae heat shock protein SSA4,Ssa4）、免疫球蛋白結合蛋白（immunoglobulin heavy chain binding protein, BiP）等。

圖3 分泌折疊水平上提高畢赤酵母中外源蛋白表達的示意圖Fig.3 A schematic diagram of improving secretion and folding level of heterologous proteins in P.pastoris

PDI 在新折疊蛋白質中二硫鍵的形成和重排中起關鍵作用，通過參與內質網(wǎng)中二硫鍵的形成，PDI提高了畢赤酵母中內質網(wǎng)蛋白加工的能力。PDI 是一種常見的分子伴侶，在食品、藥物和工業(yè)酶中被廣泛研究。當巴西甜蛋白在畢赤酵母中與PDI 共表達后，其胞外蛋白量達到1 g/L［66］，比先前報道的提高了2.5 倍。在另一則報道中，共表達PDI 提高了畢赤酵母表達人溶菌酶的酶活，雖然其胞外蛋白量沒有明顯上升但酶活提高了30.7%［67］。同樣地，在畢赤酵母中共表達PDI 與杜邦嗜熱菌脂肪酶（Thermomyces dupontii lipase，TDL）中酶活與蛋白濃度均提高了約1.4 倍［68］，共表達PDI 在另一種杜邦嗜熱菌脂肪酶（Talaromyces thermophilus, LIP1）中酶活也有提升［69］。共表達PDI 還能提高抗菌酶的活性，殼聚糖酶AqCoA 是一種抗菌抗炎類酶，它與PDI 共表達將酶活提高了31%［70］。為了提高分子伴侶PDI的效率，董聰?shù)龋?1］構建了3 拷貝的PDI 與FAD 依賴的葡萄糖脫氫酶共表達的畢赤酵母重組菌株發(fā)現(xiàn)，其酶活比原來提高了83%。

ERO1 是一種內質網(wǎng)分子伴侶，ERO1 對于畢赤酵母中二硫鍵的形成至關重要。內質網(wǎng)應激誘導的ERO1 轉錄上調有助于改善蛋白質折疊，以提高細胞應對應激的能力［72］。研究發(fā)現(xiàn)，ERO1 也能增強畢赤酵母中AqCoA 的表達，特別地，當ERO1 與PDI 協(xié)同共表達使蛋白表達水平提高了42%［70］。分子伴侶共表達常常與多拷貝策略一起出現(xiàn)，例如，在畢赤酵母中表達腈水解酶時，分子伴侶ERO1 的共表達進一步提高了多拷貝菌株中腈水解酶的活性及腈水解酶基因的轉錄水平［22］。

Ssa4 是一種對外源蛋白具有積極影響的分泌輔助因子，屬于hsp70（heat shock protein，熱休克蛋白）基因家族。當細胞經(jīng)歷壓力時會改變其基因表達模式，專注于制造恢復所需的蛋白質，于是大多數(shù)mRNA 被保存在細胞核內，而編碼細胞恢復蛋白的轉錄本如Ssa4 被表達。Ssa4 蛋白通過重新折疊變性蛋白來幫助細胞從壓力中恢復，負責轉運初生蛋白到內膜，參與蛋白質折疊、轉位及組裝［73］。Jiao 等［74］發(fā)現(xiàn)，Ssa4 的共表達使米根霉脂肪酶的分泌水平增強45%，并且與其他協(xié)助因子Bmh2、Sso2 共表達活性會高于僅共表達Ssa4。Zahrl 等［75］對Hsp70 相關的分子伴侶蛋白做了細致研究發(fā)現(xiàn)，通過調節(jié)細胞質和內質網(wǎng)上的Hsp70因子循環(huán)會影響重組蛋白從細胞質到內質網(wǎng)的易位。當過度表達由Ssa1、Ydj1 和Snl1 組成的細胞質Hsp70 循環(huán)以及由Kar2、Erj5 和Sil1 組成的 內質網(wǎng) Hsp70 循環(huán)時發(fā)現(xiàn)了最佳的協(xié)同效應，使得抗體片段Fabs 和scFvs 分泌量提高5 倍，滴度均達到1.3 g/L。

BiP 也屬于Hsp70 熱休克蛋白家族，是最重要的內質網(wǎng)伴侶蛋白。它在內質網(wǎng)中有兩個作用：作為錯誤折疊蛋白的感應蛋白以及參與ERAD 途徑減少蛋白錯誤折疊相關應激。據(jù)報道，共表達BiP 可以增強畢赤酵母中一些重組蛋白的分泌表達，但是效果參差不齊。在一項研究中，當BiP 與ERO1 共表達使紅色念珠菌脂肪酶Lip1 酶產(chǎn)量提高46.5%［76］。同樣地，過表達Bip 也可增強羧酸酯酶的表達，與原酶相比共表達BiP 蛋白的菌株活性提高了44%［77］。但應該注意的是，BiP 分子伴侶的作用具有蛋白質特異性。Yang 等［78］發(fā)現(xiàn)BiP 的共表達被證明對哺乳動物肽聚糖識別蛋白在畢赤酵母中的表達的分泌有害。

HAC1 是一種內質網(wǎng)響應蛋白，重組蛋白進入內質網(wǎng)后需要經(jīng)歷翻譯后修飾并只有正確折疊才能離開內質網(wǎng)，最后進行胞外分泌。未折疊蛋白或錯誤折疊蛋白在內質網(wǎng)中的積累會觸發(fā)未折疊蛋白響應（unfolded protein response, UPR）的激活［79］。而UPR 調節(jié)因子HAC1 的組成型表達可以減輕上游蛋白質合成并提高內質網(wǎng)中的下游蛋白質折疊效率，從而進一步改善了蛋白質生產(chǎn)。Bao 等［80］的研究證明，HAC1 的過表達能夠將木聚糖酶在畢赤酵母中的產(chǎn)率從325 U/mL 提高到381 U/mL。Duan 等［81］通過3 種報告蛋白研究了HAC1 的作用，結果發(fā)現(xiàn)HAC1 的共表達使酵母增強型綠色熒光蛋白的細胞外產(chǎn)量提高了99%。

折疊分泌水平上提高外源蛋白在畢赤酵母中表達量的應用及效果詳見表4。

表4 外源蛋白在畢赤酵母中通過優(yōu)化分泌折疊水平提高表達策略Table 4 Protein secretion and folding levels-optimizing strategies for enhancing heterologous proteins expression in P.pastoris

5 細胞抗逆水平上提高外源蛋白在畢赤酵母中的表達量

在發(fā)酵過程中，畢赤酵母細胞會遇到來自溶解氧、溫度等多種環(huán)境壓力。這些環(huán)境壓力可能會限制酵母細胞的生長，也會影響外源蛋白的表達。通過改善細胞抗逆水平可以提高酵母的環(huán)境耐受性以及提高外源蛋白的表達（圖4）。

圖4 畢赤酵母中提高細胞抗逆水平的示意圖Fig.4 A Schematic diagram of improving cell resistance level in P.pastoris

5.1 溶氧量抗逆策略

溶解氧（dissolved oxygen, DO）是畢赤酵母發(fā)酵的關鍵參數(shù)，當酵母細胞在發(fā)酵過程中處于低溶解氧狀態(tài)時，畢赤酵母的代謝途徑會改變從而抑制外源蛋白合成。然而，透明顫菌血紅蛋白（htreoscilla hemoglobin, VHb）可以通過促進酵母細胞的氧攝取效率增強呼吸和能量代謝［86］。因此，VHb 的共表達可以有效提高重組菌株在不同溶解氧濃度下利用氧氣的能力，從而導致外源蛋白的產(chǎn)量更高。研究表明，通過胞內表達VHb 可以改善畢赤酵母中外源蛋白的表達。唐輝桂等［87］發(fā)現(xiàn)，在低氧條件下VHb 與植酸酶共表達，可將植酸酶的酶活提高3 倍，且對畢赤酵母細胞生長代謝無明顯消極影響。汪小峰等［88］發(fā)現(xiàn)，在低氧條件下10 L 發(fā)酵罐中解脂耶氏酵母脂肪酶YlLip2 表達量提高了83%，總蛋白達6.79 g/L。最近該團隊發(fā)現(xiàn)，在高DO 水平下（50%），當胞內VHb 和YlLip2 共表達時，YlLip2 活性達到7 650 U/mL，總蛋白達5.1 g/L，比對照組高出約21%。而在較低DO 水平下（10%），YlLip2 與VHb 共表達時，其活性為6 950 U/mL，是對照組的1.88 倍［89］。并且發(fā)現(xiàn)胞內表達VHb 的菌株與陰性對照菌株生長狀態(tài)無明顯差異，說明表達VHb 不影響畢赤酵母生長。同樣地，限氧條件下VHb 與β-甘露聚糖酶共表達可將其表達量提高90%同時還提高了畢赤酵母對甲醇的耐受，縮短了發(fā)酵周期［90］。

5.2 熱抗逆策略

溫度是影響畢赤酵母發(fā)酵的重要因素，過高的溫度會導致細胞存活率降低，影響外源蛋白的產(chǎn)量和活力。小熱休克蛋白（sHSPs）在酵母熱應激反應中起重要作用，可以作為分子伴侶在環(huán)境壓力下幫助維持蛋白結構。研究發(fā)現(xiàn)，來自小熱休克蛋白的熱誘導基因CsHSP17.2 可以影響畢赤酵母耐熱性。Wang 等［91］使用熱激處理酵母菌株30-60 min 后，分析發(fā)現(xiàn)過表達CsHSP17.2 的菌株的生長速度高于對照，表明CsHSP17.2 的表達提高了畢赤酵母的耐熱性。Lin 等［92］通過誘變和適應性進化獲得了耐熱的畢赤酵母突變體G14，并證明了G14 中的氧化應激反應（oxidative stress response,OSR）誘導了較強的過氧化物酶體，過氧化物酶體可以保護酵母免受耐熱和氧化應激，起到OSR 緩沖作用。

5.3 氧化應激抗逆策略

甲醇誘導型畢赤酵母細胞由于代謝甲醇會產(chǎn)生過多的代謝副產(chǎn)物，如H2O2引起活性氧的積累，并通過損害活性氧清除系統(tǒng)誘導細胞氧化損傷，從而降低蛋白質表達能力［93］，因此需要建立抗氧化防御系統(tǒng)。Lin 等［94］通過過表達與抗氧化相關基因CAT、SOD1、GLR1、AHP1、TRR1、ZWF1、GND2和GSH2，將脂肪酶的產(chǎn)量提高了1.6 倍。硫氧還蛋白（thioredoxin，Trx）能通過半胱氨酸硫醇-二硫鍵交換促進其他蛋白還原而起抗氧化劑作用。Li等［95］發(fā)現(xiàn)Trx 在畢赤酵母中顯著增強了其對滲透壓和氧化應激的抵抗力，并且充當二硫鍵還原酶和分子伴侶的角色。

細胞抗逆水平上提高外源蛋白在畢赤酵母中表達量的應用及效果詳見表5。

6 發(fā)酵工藝上提高外源蛋白在畢赤酵母中的表達量

畢赤酵母非常適合發(fā)酵生長，在發(fā)酵過程中可以實現(xiàn)細胞的高密度生長。通過發(fā)酵可以提高蛋白產(chǎn)量，因此高密度發(fā)酵（high cell density fermentation, HCDF）成為畢赤酵母大規(guī)模生產(chǎn)外源蛋白的重要策略。將畢赤酵母HCDF 從實驗室規(guī)模擴大到工業(yè)化示范具有重要意義，強力有效的HCDF 可以使外源蛋白表達達到商業(yè)生產(chǎn)水平。傳統(tǒng)的HCDF 分為三個階段：甘油分批階段、甘油補料分批階段和甲醇誘導階段［96］，其生物工藝操作參數(shù)，包括培養(yǎng)基組成、溫度、pH、溶解氧、壓力、接種量、誘導和進料策略，都會極大地影響產(chǎn)品的產(chǎn)量和質量。

6.1 培養(yǎng)基的選擇和優(yōu)化

培養(yǎng)基為畢赤酵母的生長提供必需的營養(yǎng)物質，其中碳源對菌體的生長和誘導表達有影響。畢赤酵母大多以甲醇作為碳源，而甲醇存在易燃易爆的安全隱患，Liu 等［97］報道以甲酸鹽取代甲醇作為碳源和誘導劑，不僅安全、可持續(xù)還能使木聚糖酶產(chǎn)量增加（103.5±12.5）%。而Lee 等［98］則是通過開發(fā)了一種自誘導BYGM 培養(yǎng)基，縮短了篩選和培養(yǎng)時間并得到了與使用傳統(tǒng)培養(yǎng)基表達水平相當?shù)哪さ鞍住hu 等［99］通過優(yōu)化培養(yǎng)基將基礎鹽培養(yǎng)基鹽濃度減少一半并純化最終得到了產(chǎn)量高達17.47 g/L 的重組人血清蛋白，是迄今為止報道的最高的人血清蛋白產(chǎn)量。

6.2 溶解氧的控制

為了畢赤酵母作為好氧微生物，需要氧氣參與代謝過程，溶解氧水平對于細胞和產(chǎn)物的生成密切相關。溶解氧過高或過低都會影響其代謝，畢赤酵母能在溶解氧水平為10%-50%范圍內生長［100］。實驗證明短暫缺氧和高甲醇會觸發(fā)高水平重組蛋白的合成［101］。研究發(fā)現(xiàn)，畢赤酵母活性與活性氧積累有關，活性氧累積伴隨細胞活性下降。Hu 等［93］發(fā)現(xiàn)，通過選擇性平衡活性氧清除系統(tǒng)和減少對細胞的氧化損傷，控制0.051/h 的比生長速率能促進脂肪酶MAS1 表達。通過定期甘油和溶解氧濃度控制增強畢赤酵母的人類溶菌酶產(chǎn)量，Jia 等［102］利用該策略將活性氧控制在低水平，獲得了更高的細胞密度。Liu等［103］則是專注于研究1 000 L 大體積發(fā)酵罐的優(yōu)化策略，他們通過增加氣壓、降低溶解氧、調整甲醇進料速率替代純氧補充的發(fā)酵策略提高了發(fā)酵水平，已在1 000 L 發(fā)酵規(guī)模下獲得900 mg/L 的β 木糖苷酶。

6.3 分批補料策略的優(yōu)化

選擇合適的補料策略是至關重要的，近年來的補料流加策略主要有經(jīng)典誘導策略、共飼養(yǎng)誘導策略和限制性誘導策略［104］。需要根據(jù)外源蛋白的特性選擇合適的補料策略和工藝參數(shù)提升發(fā)酵水平，進一步提高畢赤酵母中重組蛋白的表達。通過優(yōu)化分批補料策略微調甲醇和山梨醇的含量，可以將人生長激素［105］、馬鈴薯糖蛋白［106］、漆酶［107］等蛋白表達水平提升至1 g/L 左右。除了關注補料策略，pH 值對所需外源蛋白表達水平以及酵母菌株的影響是獨特的，缺乏pH 控制會導致pH 值改變，從而抑制微生物生長和降低溶液中的蛋白濃度，溫度也是一個關鍵參數(shù)。畢赤酵母能夠在廣泛的pH 范圍（3.0-7.0）及溫度（20-30℃）條件下生長［100］。

6.4 高密度發(fā)酵水平的分析監(jiān)測

畢赤酵母在工業(yè)化生產(chǎn)中主要以分批補料的模式培養(yǎng)。培養(yǎng)過程中細胞環(huán)境不斷變化，因此需要監(jiān)測工藝參數(shù)和補料策略對酵母及目的蛋白的影響并進行微調。為降低試錯成本，入罐發(fā)酵前可以通過動態(tài)通量平衡分析（dynamic flux balance analysis,DFBA）與轉錄組學數(shù)據(jù)相結合來模擬外源蛋白在補料分批策略的誘導階段的生長［105］。DFBA 是經(jīng)典通量平衡分析的擴展，可以預測和優(yōu)化細胞外環(huán)境對微生物代謝的動態(tài)影響。Boojari 等［105］利用DFBA確定了發(fā)酵過程的關鍵操作參數(shù)，從而選擇了合適的補料策略并進行了驗證，最終利用該方法將重組人生長激素產(chǎn)量提高了85%。發(fā)酵過程中，可以應用過程分析技術（process analytical technology, PAT）進行實時監(jiān)測，PAT 是一個對原料、物料及工藝參數(shù)進行實時監(jiān)測的生產(chǎn)控制系統(tǒng)。PAT 系統(tǒng)可以利用多波長熒光和PLS 定量分析耦合生成定性定量的生物數(shù)據(jù)從而檢測生物質、甲醇和產(chǎn)物等關鍵質量參數(shù)［108］，從而控制發(fā)酵過程，提高發(fā)酵的效率和生產(chǎn)的穩(wěn)定性。

發(fā)酵工藝上提高外源蛋白在畢赤酵母中表達量的應用及效果詳見表6。

表6 外源蛋白在畢赤酵母中通過優(yōu)化發(fā)酵水平提高表達策略Table 6 Fermentation level-optimizing strategies for enhancing heterologous proteins expression in P.pastoris

7 總結與展望

畢赤酵母是目前生產(chǎn)外源蛋白最常用和最受歡迎的宿主之一，它在蛋白表達產(chǎn)物的加工、外分泌、翻譯后修飾等方面有明顯的優(yōu)勢，現(xiàn)已廣泛用于蛋白和酶制劑生產(chǎn)，然而其表達水平仍有待提升。本文概述了近年來研究人員在基因水平、轉錄水平、翻譯水平、分泌折疊水平、抗逆水平、發(fā)酵工藝六個方面通過各類策略改善外源蛋白表達量并評價了其貢獻。盡管通過上述策略在改善畢赤酵母中外源蛋白表達方面取得了重大進展，由于外源蛋白的復雜性和多樣性以及畢赤酵母表達系統(tǒng)運行機制未被完全理解，一部分蛋白的表達水平仍然偏低或無法表達。因此，根據(jù)畢赤酵母的特性及已有研究，可以從分子水平和發(fā)酵水平著手，前者聚焦于解析畢赤酵母表達系統(tǒng)中外源蛋白的合成、修飾和分泌的原理，通過菌株改造和表達載體研發(fā)等方面開發(fā)新分子工具提高外源蛋白在畢赤酵母中的表達。后者需要從實時監(jiān)測對發(fā)酵過程進行優(yōu)化，利用生物信息學并采用自動化控制和生化檢測技術為畢赤酵母高效表達外源蛋白提供更加有效可行的策略。主要分為以下幾個方面：

（1）菌株改造是提高畢赤酵母表達效率的重要途徑。通過更深入地了解畢赤酵母基因組和細胞代謝可以幫助指導篩選出一些關鍵基因，通過數(shù)學建模模擬細胞代謝及代謝通量分析并利用基因工程技術進行修飾改造，提高畢赤酵母的表達能力和生存能力。在細胞工廠設計中管理改善蛋白分泌所需的信息，敲除抑制外源蛋白表達的基因、增強蛋白折疊和分泌。例如，使用畢赤酵母蛋白酶缺陷性菌株可以顯著降低蛋白質降解率。

（2）畢赤酵母的糖基化修飾作用會影響蛋白的活性和穩(wěn)定性，這種影響對于不同的蛋白各有利弊。可以通過酵母糖工程，將特定蛋白改為最佳糖基化模式。例如消除酵母特有的糖基化，摻入與人類相似的糖基化途徑將原有酵母糖基化模式改造為人類糖基化模式，從而將酵母表達的糖蛋白人源化，最終應用于藥物蛋白生產(chǎn)。

（3）表達載體研發(fā)是提高畢赤酵母表達效率的可行方法。表達載體可影響表達外源蛋白生產(chǎn)的轉錄-翻譯-分泌途徑的不同步驟，通過處理編碼重組蛋白mRNA 的轉錄和翻譯，可以明顯提高產(chǎn)量。當前商業(yè)化的畢赤酵母表達系統(tǒng)中，使用的表達載體種類有限，限制了畢赤酵母表達系統(tǒng)的工具多樣性。因此，可以通過研發(fā)新型的質粒表達載體，提高目的蛋白的表達效率和穩(wěn)定性。例如，除了上文提到的優(yōu)化啟動子、調節(jié)轉錄因子等方式，可以通過將轉錄和翻譯增強元件引入用于畢赤酵母表達載體中，提高外源基因的產(chǎn)量。

（4）實時監(jiān)測畢赤酵母代謝情況及外源蛋白的含量是優(yōu)化發(fā)酵過程的必要手段。在發(fā)酵過程中，畢赤酵母通常被描述為一個黑盒，其輸出與營養(yǎng)物質、代謝產(chǎn)物及副產(chǎn)物的消耗相關。因此，準確預測重組蛋白的生產(chǎn)仍然是一個需解決的挑戰(zhàn)。選擇合適的檢測方法，并結合實時監(jiān)測技術，可以實現(xiàn)對外源蛋白含量的準確監(jiān)測和控制。例如，采用近紅外光譜等在線監(jiān)測技術實現(xiàn)實時代謝通量分析描述畢赤酵母生長過程。

總之，從分子水平著手，通過菌株改造和表達載體研發(fā)等方面來提高畢赤酵母中外源蛋白的表達效率，是畢赤酵母大規(guī)模工業(yè)化生產(chǎn)蛋白的前提基礎。從發(fā)酵水平，選擇合適的檢測方法和監(jiān)測技術為提高畢赤酵母中外源蛋白的表達提供有效手段。盡管本綜述討論的提高外源蛋白表達策略可以以組合的方式應用，對于目前工業(yè)應用的要求，大多數(shù)蛋白的表達水平仍有待提高。隨著科技的不斷進步和工業(yè)化生產(chǎn)的不斷推進，相信畢赤酵母表達系統(tǒng)仍將有更多的突破和發(fā)展。