TMT 定量蛋白質組學解析Rummeliibacillus suwonensis 3B-1 生長及己酸代謝機制

陳曉松 劉超杰 鄭佳 喬宗偉 羅惠波 鄒偉，2

（1.四川輕化工大學生物工程學院，宜賓 644005；2.中國輕工業濃香型白酒固態發酵重點實驗室，宜賓644007；3.宜賓五糧液股份有限公司，宜賓 644007）

白酒是一種傳統的蒸餾酒［1］，根據風格的不同，可分為三大香型（濃香型、醬香型、清香型）和九種小香型（兼香型、鳳香型、米香型、藥香型、芝麻香型、豉香型、特香型、老白干香型、馥郁香型［2-3］）。濃香型白酒中的風味物質高達1 200 余種［4］，己酸乙酯為濃香型白酒的主體香味物質，其含量高低決定了白酒的品質和風格的典型性。己酸菌作為濃香型白酒發酵過程中最為重要的功能微生物之一，其主要代謝產物為己酸，而己酸是合成己酸乙酯的前體物質，因此己酸菌對白酒風味的形成和白酒品質的提高有著重要影響［5］。

己酸的合成依賴于乙醇的逆β-氧化（reverse β-oxidation, RBO）循環羧酸鏈延長。在該過程中，乙醇或乳酸作為電子供體被氧化為乙酰輔酶A［6-8］，然后與乙酸縮合生成丁酸，丁酸再與另一個乙酰輔酶A 縮合生成己酸［9-11］。水源拉梅爾芽孢桿菌首次發現于2013 年［12］，是拉梅爾桿菌屬物種，前期研究發現，水源拉梅爾芽孢桿菌在厭氧和好氧條件下均能正常生長，且主要代謝產物為己酸，然而該菌在厭氧和好氧條件下的生長與代謝差異及其機制尚未明確。

近年來，蛋白質組學研究方法發展迅速，基于TMT 的定量蛋白質組學技術是目前差異蛋白質定量分析方法中通量最高、系統誤差最小、功能最強大的分析方法之一［13］，具有高靈敏度、高分離能力、高通量等特點。本研究以R.suwonensis 3B?1 為研究對象，利用TMT 定量蛋白質組學技術分析該菌株在厭氧和好氧條件下的蛋白質差異，篩選與菌株生長及己酸代謝相關的關鍵蛋白，在蛋白水平闡明氧氣對該菌生長的影響及其己酸代謝的分子機制，以期為水源拉梅爾芽孢桿菌的基因工程改造提供一定技術基礎，對提高水源拉梅爾芽孢桿菌的發酵能力具有重要意義。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 菌株 R.suwonensis 3B?1 分離自四川某濃香型酒廠窖泥。

1.1.2 培養基 菌株R.suwonensis 3B?1 的培養和發酵分別采用乙醇乙酸鈉培養基（ES 培養基）和乙醇乙酸鈉發酵培養基［14］。

1.2 方法

1.2.1 菌株R.suwonensis 3B?1 生長曲線的測定 將R.suwonensis 3B?1 活化好的種子液以5%的接種量接種至ES 培養基中，分別置于35℃厭氧工作站和35℃搖床中（200 r/min）培養，初期每隔12 h 測一次OD600nm值；在生長對數期，每隔6 h 測一次；平穩期每隔2 h 測一次，直至繪制出完整的生長曲線。

1.2.2 菌株R.suwonensis 3B?1 發酵液的測定 使用氣相質譜（GC?MS）分別測定好氧與厭氧條件下發酵液中丁酸和己酸的含量。將R.suwonensis 3B?1 種子液接種至ES 液體培養基中，分別置于35℃厭氧工作站和35℃搖床中（200 r/min）培養10 d，完成發酵。取發酵液通過0.22 μm 有機相濾膜收集至EP管內，以5 000 r/min 離心10 min，吸取1 mL 離心后的發酵液于進樣瓶進行樣品含量的測定。

1.2.3 菌株R.suwonensis 3B?1 樣品的制備 具體的制備步驟如下：（1）吸取厭氧條件下培養且處于對數生長期的9 mL 菌液至10 mL 已滅菌離心管中，轉速5 000 r/m，離心5 min 后收集菌體。（2）菌體沉淀后，加入1 mL xPBS 緩沖液（購自Thermo 公司），混合均勻，于7 000 r/min 下離心5 min，收集菌體，重復2-3 次，直至離心后的上清液呈現澄清透明的狀態。（3）舍棄上清液，保留沉淀，記錄每個樣品的名稱與編號，將樣品放于裝滿干冰的泡沫箱內，密封后送至上海派森諾公司進行后續實驗。

1.2.4 蛋白樣品的提取和肽段酶解 （1）采用SDT 裂解法提取樣品；（2）采用二喹啉甲酸（bicin?choninic acid，BCA）法定量蛋白；（3）采用FASP（filter?aided sample preparation）法進行胰蛋白酶酶解；（4）用C18Cartridge 對肽段進行脫鹽；（5）肽段定量（OD280nm）［15］。

1.2.5 TMT 標記 各樣品分別取100 μg 肽段，按照Thermo 公司TMT 標記試劑盒說明書進行標記。

1.2.6 基于LC?MS/MS 的數據采集 采用納升流速的 HPLC 液相系統 Easy nLC 對每份樣品進行分離。緩沖液 A 液為 0.1%甲酸水溶液， B 液為 0.1%甲酸乙腈水溶液（乙腈為 84%）。色譜柱以 95%的 A 液平衡，樣品由自動進樣器上樣到上樣柱（Thermo Sci?entific Acclaim PepMap100, 100 μm×2 cm, nanoVi?per C18），經 過 分 析 柱（Thermo scientific EASY col?umn, 10 cm, ID7 5 μm, 3 μm, C18?A2）分 離，流 速 為300 nL/min。

樣品經色譜分離后用 Q?Exactive 質譜儀進行質譜分析。檢測方式為正離子，母離子掃描范圍 300-1 800 m/z，一級質譜分辨率為 70 000（200 m/z），AGC（automatic gain control）target 為 1×106，Maxi?mum IT 為 50 ms，動態排除時間為 60.0 s。多肽和多肽碎片的質量電荷比按照下列方法采集：每次全掃描后采集 20 個碎片圖譜（MS2 scan），MS2 activation type 為HCD，isolation window 為2 m/z，二級質譜分辨率17 500（200 m/z），normalized collision energy 為30 eV，underfill 為 0.1%［16］。

1.2.7 蛋白質鑒定與定量分析 采用Proteome Discoverer 1.4 和Mascot 2.2 軟件對原始數據文件進行質譜分析，便于查庫鑒定及定量分析［17］。

1.2.8 生物信息學分析 將鑒定到的蛋白質序列分別與亞細胞定位、基因本體論（gene ontology，GO）、京都基因與基因組百科全書（Kyoto encyclopedia of genes and genomes，KEGG）、STRING 或 IntAct 等數據庫進行比對，獲得蛋白在各數據庫的注釋信息，分析DEPs 互相作用關系。

2 結果

2.1 菌株生長及代謝情況

如圖1?A 所示，就菌體生長而言，好氧條件下，菌株R.suwonensis 3B?1 的生長速度明顯快于厭氧條件，最大生物量約為厭氧條件下的2 倍，但二者達到最大生長量的時間基本相同；菌株R.suwonensis 3B?1 的代謝產物產量如圖1?B 所示，在厭氧條件下，該菌株的丁酸、己酸產量都高于好氧條件下的產量，其中，丁酸產量提高了1.14 倍，己酸產量提高了1.97 倍。

圖1 3B-1 好氧和厭氧條件生長及代謝情況Fig.1 Growth and metabolism of 3B-1 under aerobic and anaerobic conditions

2.2 蛋白樣本質控

經BCA 法測定比較組蛋白濃度，結果如表1 所示，蛋白定量結果顯示，好氧條件下（RH1?RH3）的菌株蛋白總量普遍高于厭氧條件（RY1?RY3）。取一定量蛋白樣本進行十二烷基硫酸鈉聚丙烯酰胺凝膠電泳（sodium dodecyl sulfate polyacrylamide gel electrophoresis, SDS?PAGE），經考馬斯亮藍染色，結果如圖2?A 所示，所有樣品蛋白完整性較好，條帶組間不平行，組內相對平行，條帶清晰，蛋白量滿足后續實驗要求。肽段離子質量偏差分布、肽段離子得分分布分別如圖2?B、2?C 所示，所有鑒定肽段的質量偏差主要分布在10 ppm 以內，結合嚴格的分析工具MASCOT 對MS 圖譜數據進行分析，圖2?C顯示，超過69.37%的肽段得分大于20 分，肽段得分中位數為30 分。

表1 BCA 蛋白定量結果Table 1 BCA protein quantification results

圖2 蛋白樣品質量控制Fig.2 Quality control of protein sample

2.3 蛋白鑒定及定量分析

由圖3?A 可知，經Mascot 2.2 鑒定和Proteome Discoverer 1.4 定量分析共獲得623 624 張總譜圖（total spectra）。其中蛋白譜圖（spectra）26 634 張；肽段（peptide）數量為7 675 個，其中特有肽段（unique peptide）數量為5 573 個；蛋白（protein）數量為1 804 個，定量到的蛋白數量為1 803 個。以表達倍數（fold change, FC）大于1.2 倍或小于0.83（上調大于1.2 倍或下調小于0.83 倍）且P value＜0.05為標準進行比較組間DEPs 篩選，結果見圖3?B，篩選獲得總差異表達蛋白810 個，其中顯著上調蛋白423 個，顯著下調蛋白387。DEPs 火山圖如圖3?C所示，其中顯著下調的蛋白質標注為藍色，顯著上調標注為紅色，無差異則為灰色；采用層次聚類算法（hierarchical cluster）對比較組DEPs 進行分層聚類分析，結果如3?D 所示，好氧組內（RH?1、RH?2和RH?3）差異蛋白表達量的上調和下調趨勢較一致，RH?1 和RH?3 先聚為一類，再與RH?2 聚為一類；厭氧組內（RY?1、RY?2 和RY?3）差異蛋白表達量的上調和下調趨勢較一致，與好氧組組間的表達趨勢相反，RY?1 和RY?2 先聚為一類，再和RY?3 聚為一類，最終形成與好氧組明顯不同的簇。

圖3 蛋白鑒定和差異表達結果Fig.3 Results of protein identification and differential expression

2.4 差異表達蛋白功能注釋

利用亞細胞結構預測軟件CELLO 對DEPs 進行亞細胞定位分析，725 個DEPs 定位到6 個條目上，分別是細胞質（cytoplasmic）蛋白567 個，細胞膜（cytoplasmic membrane）蛋白138 個，細胞壁（cellwall）蛋白9 個以及其他蛋白11 個［胞外（extracellular）蛋白6 個，孢子（spore）蛋白3 個和鞭毛（flagellar）蛋白2 個］；對DEPs 進行GO 功能注釋，結果如圖4?A 所示，生物過程（biological process）方面主要涉及細胞過程（cellular process）蛋白394 個，代謝過程蛋白（metabolic process）373 個，生物調節蛋白（biological regulation）65 個等；分子功能（molecular function）方面主要涉及催化活性（catalytic activity）蛋白478 個，結合功能（binding）蛋白413 個和結構分子活性（structural molecule activity）蛋白55 個等；細胞組分（cellular component）方面主要涉及細胞（cell）蛋白280 個，細胞部分（cell part）蛋白276 個和細胞膜（membrane）蛋白55 個等。對DEPs 進行GO 功能富集分析，GO 三大分類下的GO 條目富集情況結果如圖4?B-D 所示，在該比較組中細胞酰胺代謝過程（cellular amide metabolic process）、肽的生物合成過程（peptide biosynthetic process）、翻譯（translation）和肽代謝過程（peptide metabolic process）等生物學過程；核糖體的結構組成（structural constituent of ribosome）、結構分子活性（structural molecule activity）、rRNA、RNA 結 合（rRNA binding、RNA binding）和嘌呤核苷結合（purine nucleoside binding）等分子功能；核糖體（ribosome）、核糖核蛋白復合物（ribonucleoprotein complex）、細胞質部分（cytoplasmic part）和細胞內非膜結合細胞器（intracellular non?membrane?bounded organelle）等細胞組分發生了顯著變化。

圖4 比較組DEPs 的GO 注釋圖Fig.4 GO annotation map of DEPs in comparative group

2.5 差異表達蛋白KEGG注釋

將所有DEPs 進行KEGG 代謝通路注釋，結果如圖5 所示，其中DEPs 主要參與的通路為核糖體（56 個,且全部上調），輔因子生物合成（44 個，上調25 個，下調19 個），雙組分系統（30 個，上調8個，下調22 個）和ABC 轉運系統（24 個，上調13個，下調11 個）等途徑。在碳水化合物代謝中，厭氧條件顯著提高了磷酸戊糖代謝通路中蛋白的表達，其中有10 個DEPs 的表達量上調，6 個下調；淀粉和蔗糖代謝（HAD 家族磷酸酶），糖酵解/糖異生代謝通路［果糖二磷酸醛縮酶、磷酸甘油酸激酶、烯醇化酶、磷酸烯醇式丙酮酸羧激酶（ATP）］中的DEPs 表達量上調。在氨基酸代謝中，厭氧條件降低了氨基酸降解酶的表達，如纈氨酸、亮氨酸和異亮氨酸等。在能量代謝中，涉及氧化磷酸化（NADH：醌還原酶、無機焦磷酸酶、F 型H+轉運ATP 酶亞基a 等）和硫代謝（半胱氨酸合成酶、硫轉移酶等）途徑中的DEPs 表達量上調。

圖5 KEGG 富集代謝通路Fig.5 KEGG enriched metabolic pathways

2.6 蛋白質互作網絡

利用CytoScape 軟件構建比較組DEPs 相互作用網絡結構圖，如圖6?A 所示，關聯度排名前20位的蛋白如圖6?B、表2 所示，其中關聯度最高的是苯丙氨酸?tRNA 連接酶β 亞基（A0A3N6AUL8），關聯度為149；其次是核黃素生物合成蛋白RibD（A0A143HEW7），關聯度為147，兩者在厭氧條件下均呈下調特征。呈上調特征的DEPs 主要集中在5-13 位，關聯度為105 左右。

表2 比較組蛋白互作網絡中關聯度最高的20 個蛋白質Table 2 Top 20 proteins with the highest correlation in the interaction network of DEPs

圖6 比較組DEPs 互作網絡分析結果Fig.6 Results of the interaction network analysis of DEP in the comparative groups

3 討論

3.1 菌株R.suwonensis 3B?1的生長情況

菌株R.suwonensis 3B?1 在好氧和厭氧條件下，表現出明顯的生長和代謝差異，本研究通過對DEPs 的挖掘發現，DEPs 主要與代謝過程相關，包括能量代謝、碳水化合物代謝、氨基酸代謝和核苷酸代謝等，其中糖酵解/糖異生、三羧酸循環和丙酮酸代謝是DEPs 最集中的代謝通路。厭氧條件下，影響糖酵解/糖異生通路的主要上調蛋白為磷酸甘油酸激酶（A0A511C542）和磷酸丙酮酸水合酶（A0A3N6AA05）。作為糖酵解/糖異生通路的關鍵酶，磷酸甘油酸激酶在催化三磷酸腺苷（ATP）的形成中有著至關重要的影響［18］，為菌株的后續生長代謝提供能量，其表達量的上調使菌株的能量供應得到保障。磷酸丙酮酸水合酶是一種多功能酶，可通過催化2?磷酸?D?甘油酸脫水生成磷酸烯醇丙酮酸［19］，該酶在厭氧條件下的表達上調，使得菌株3B?1 內的磷酸烯醇丙酮酸產量高于好氧條件。主要下調蛋白為丙酮酸脫氫酶（A0A3N5ZV13）和丙酮酸激酶（A0A3N5ZTV7），丙酮酸脫氫酶可減弱丙酮酸對2?羥基-乙基?Thpp 的抑制作用［20］，由于其在厭氧條件下的表達量下調，使得菌株體內的丙酮酸含量較低。丙酮酸激酶在調節丙酮酸的合成與代謝中起著重要作用，可催化磷酸烯醇丙酮酸和ADP轉化為丙酮酸和ATP［21］，該酶表達量的下調，導致菌株體內丙酮酸和能量供應不足。此外，丙酮酸激酶還是糖酵解途徑中的限速酶，其表達量的下調導致菌株在厭氧條件下的生長發育緩慢。

雙組分系統富集到較多的DEPs，其中的轉錄調節蛋白ResD 通過接收環境信號并調節下游基因的轉錄活性，參與菌體的適應性反應和生理調節，有研究發現，ResD 在調控有氧和無氧呼吸過程中起著重要作用［22-23］，該蛋白在厭氧條件下呈下調趨勢，符合菌株3B?1 在厭氧條件下的生長特征。在氨基酸和輔因子合成途徑中，厭氧條件導致菌株在亮氨酸、精氨酸、甲硫氨酸等氨基酸代謝和硫胺素代謝結合蛋白（A0A3N5ZSI0）、生物素蛋白連接酶（A0A3N5ZTP5）的表達呈現下調特征，這可能表明菌株3B?1 更適合在好氧環境中生長。在蛋白質互作網絡中發現的兩個高關聯度的蛋白：苯丙氨酸?tRNA連接酶β 亞基和核黃素生物合成蛋白RibD，兩者在厭氧條件下均呈下調特征。苯丙氨酸?tRNA 連接酶β 亞基主要參與在核糖體中的mRNA 分子蛋白質的生物合成，其通過與ATP、鎂離子、鋅離子或tRNA結合發揮生物學功能［24］，該蛋白在厭氧條件下呈現下調趨勢，導致該菌株在厭氧條件下對于鎂離子、鋅離子的結合能力較弱，從而影響相應的生物學功能。核黃素生物合成蛋白RibD 主要參與核黃素的生物合成［25-26］，該蛋白表達量的下調導致菌株在核黃素的生物合成方面能力較弱。

厭氧條件下，糖酵解階段丙酮酸脫氫酶和丙酮酸激酶表達量的下調，導致菌株R.suwonensis 3B?1的能量供應量及丙酮酸合成量較低，加之相關氨基酸代謝和輔因子生物合成相關蛋白表達量的下調，進而影響菌株R.suwonensis 3B?1 的生長發育，圖1?A也表明菌株R.suwonensis 3B?1 的最大生物量和生長速度低于好氧條件。綜上所述，菌株R.suwonensis 3B?1 更適合在好氧條件下生長。

3.2 菌株R.suwonensis 3B?1的代謝差異

菌株R.suwonensis 3B?1 在好氧和厭氧條件下的生長與其代謝產物產量有著明顯差異：相較于好氧條件，厭氧條件下的菌體生物量和生長速度有著明顯下降，但是己酸、丁酸的產量卻表現為上升。為從蛋白水平闡述此差異的分子機制，本研究著重關注菌株3B?1 己酸代謝相關蛋白的表達情況，并構建了己酸代謝通路圖（圖7）。乙酰輔酶A 是連接糖酵解/糖異生、三羧酸循環和己酸代謝途徑的關鍵代謝物，其積累量在一定程度上影響菌體的生長發育和己酸代謝。在糖酵解/糖異生途徑中，由于丙酮酸激酶表達量的下調，導致由磷酸烯醇丙酮酸生成丙酮酸的速率較低，因此乙酰輔酶A 的積累量較少，但磷酸丙酮酸水合酶的上調，可催化2?磷酸?D?甘油酸脫水生成磷酸烯醇丙酮酸，使得磷酸烯醇丙酮酸在菌株體內大量積累。同時，三羧酸循環途徑中各催化酶的表達量均呈現上調，可由此積累大量的草酰乙酸，由三羧酸循環生成的草酰乙酸可由磷酸烯醇丙酮酸羧化激酶催化生成磷酸烯醇丙酮酸［27］，磷酸烯醇丙酮酸羧化激酶在厭氧條件下呈上調特征，使得磷酸烯醇丙酮酸在菌株體內進一步積累，并將三羧酸循環和糖酵解/糖異生途徑偶聯，為后續乙酰輔酶A 的生成提供豐富的前體物。此外，厭氧條件顯著提升了磷酸戊糖途徑相關蛋白的表達，由磷酸戊糖途徑會生成大量的NADPH 和磷酸核糖［28］，而己酸的合成依賴于乙醇的逆β-氧化循環羧酸鏈延長，此過程需要豐富的還原當量和乙酰輔酶A［29-30］，磷酸戊糖途徑相關蛋白的表達上調為己酸合成提供大量的NADPH。可以說，糖酵解/糖異生、三羧酸循環和磷酸戊糖代謝途徑為后續己酸代謝提供了必要的物質基礎和能量供應。在己酸代謝通路中，乙酰輔酶A 乙酰轉移酶（A0A3N6AQ32）的蛋白表達量有所降低，可能由于菌株在厭氧條件生長初期，乙酰輔酶A 的產量和積累量相對較少，菌株首先用其滿足生長發育需求。與之相似的是3?羥基丁酰輔酶A 脫氫酶（A0A3N5ZT88），該酶的表達量也呈現下調，因為在厭氧條件初期，基礎的生長代謝仍然不充分，沒有足夠的物質準備，無法進行后續的己酸代謝。酰基輔酶A 硫酯酶（A0A3N6BPG2）可催化己酰輔酶A 生成己酸［31］，該酶在厭氧條件下呈現上調，在菌株完成相應的物質準備后，由此催化己酰輔酶A 生成己酸，從而提高己酸的產量。

圖7 DEPs 在中心代謝和己酸代謝途徑中的分布Fig.7 Distribution of DEPs in the central metabolic and caproic acid metabolic pathways

4 結論

在厭氧與好氧條件下，在R.suwonensis 3B?1 中共鑒定到810 個DEPs，其中上調蛋白423 個，下調蛋白387 個。在厭氧條件下，亮氨酸、精氨酸、甲硫氨酸等氨基酸代謝呈現下調特征，硫胺素結合蛋白、生物素蛋白連接酶等輔因子表達下調，同時，苯丙氨酸?tRNA 連接酶和核黃素生物合成蛋白的下調進一步表明該菌更適合在好氧環境中生長。在己酸合成方面，酰基輔酶A 硫酯酶的表達量顯著上調，此外，糖酵解/糖異生途徑、三羧酸循環和磷酸戊糖途徑為己酸合成提供了充足的前體物質和還原當量，共同促進了己酸合成。