NPS-2143對膠質瘤增殖與遷移能力的影響及機制*

聶佳麗, 殷海棠, 文志鵬, 鄭志昌, 李明, 李琴, 樊興華, 趙青青, 張彥燕*, 楊繼紅,***

(1.貴州醫科大學 藥學院, 貴州 貴陽 550004; 2.貴州醫科大學附屬醫院 藥學部, 貴州 貴陽 550004)

膠質瘤是中樞神經系統最常見的惡性腫瘤之一[1],低級別膠質瘤患者的中位生存時間在3～10年,而高級別膠質瘤患者僅為15個月[2]。手術、放療和化療是目前臨床上治療膠質瘤最重要的手段[3],其中替莫唑胺(Temozolomide,TMZ)是治療膠質瘤的一線化療藥物。由于TMZ的天然耐藥或獲得性耐藥等原因,大約50%的中樞神經系統膠質瘤患者經TMZ治療后效果不理想[4-5]。因此,探究新的膠質瘤治療藥物及其分子機制對于改善患者生存預后具有重要意義[6]。自噬是細胞中一種高度進化的、保守的、動態的、依賴溶酶體的蛋白與受損細胞器的代謝過程[7-9],在腫瘤發生發展及放化療抵抗中有復雜的調控功能;抑制自噬會增加正常細胞發生惡性轉化的可能,干擾自噬也可以抑制包括膠質瘤在內多種腫瘤的生長與增殖,并增加其放化療敏感性[10-11]。調節細胞自噬水平的細胞信號通路眾多,其中AKT-mTOR信號通路在調節腫瘤細胞自噬水平中扮演重要角色,激活AKT-mTOR信號通路可以降低腫瘤細胞自噬水平[12-13]。NPS-2143是一種鈣敏感受體(calcium sensing receptor,CaSR)拮抗劑,研究表明NPS-2143能夠抑制乳腺癌細胞、胃癌細胞、黑素瘤癌細胞及腎癌細胞等多種腫瘤細胞的發生發展過程[14-16],但其在膠質瘤細胞中的作用及機制不明。相關研究發現,CaSR可以調控細胞自噬水平[9],利用拮抗劑抑制CaSR可以降低多種細胞的自噬水平[17],提示NPS-2143可能可以通過抑制自噬進而阻礙膠質瘤的生長、增殖及遷移能力。U87、U251和Hs683是膠質瘤研究中常用細胞系,具有相對穩定的遺傳特征,還能反映臨床膠質瘤細胞增殖、侵襲性等特征。本研究以膠質瘤U87、U251和Hs683細胞為研究對象,觀察NPS-2143對膠質瘤細胞增殖與遷移能力的影響及其可能機制。

1 材料與方法

1.1 實驗材料

1.1.1細胞株 人腦膠質瘤細胞系U87、U251和Hs683購自中國科學院細胞庫(上海生物化學與細胞生物學研究所,中國科學研究院),由文志鵬課題組保存。

1.1.2主要試劑 NPS-2143(美國 Selleck公司),培養基(dulbecco's modified eagle medium,DMEM)、0.25%胰蛋白酶及胎牛血清(美國 Gibco 公司);6孔板、96孔板、Transwell 小室(美國 Corning 公司), 細胞增殖毒性試劑盒(cell counting kit-8,CCK-8)試劑(日本Dojindo研究所),RIPA裂解液(P0013c)、BCA蛋白濃度測定試劑盒 (P0010S)、ECL化學發光液(P0018S)試劑(上海碧云天生物公司);細胞周期試劑盒(KGA512)和細胞凋亡試劑盒(KGA108)試劑(江蘇凱基生物公司),Annevin V-FITC/碘化丙啶(propidium,PI)試劑盒(上海碧云天生物公司),P21、Cyclin D1、Bax、Caspase 3、N-cadherin、MMP2、MMP9、p-AKT(Ser473)、p-mTOR(Ser448)抗體(武漢 Proteintech公司),LC3和P62抗體(美國 CST公司)。

1.1.3主要儀器 BCD-271TMCM冰箱(青島 海爾),FORWA371高溫滅菌型CO2培養箱、ST16R離心機(美國 Thermo);DMIL倒置顯微鏡、DMIL LED倒置熒光顯微鏡(德國 Leica),Navios流式細胞分析儀、Allegra 64R高速臺式冷凍離心機(美國 Beckman),Chemi Scope5300化學發光成像系統(上海 Clinx勤翔),DPN9272恒溫培養箱(上海精宏),TP-114電子天平(美國 丹佛),A02-6SB-0N生物安全柜(新加坡 Esco),TS 3D脫色搖床(海門 其林貝爾)。

1.2 研究方法

1.2.1細胞培養及分組 人腦膠質瘤細胞系U87、U251和Hs683培養于含10%胎牛血清的DMEM培養基中,在37 ℃、5%CO2的培養箱中進行培養,當細胞融合率達到90%時,使用0.25%胰酶消化3 min,加入3 mL完全培養基終止消化,用巴氏吸管進行反復輕柔的吹打細胞,將其轉移到15 mL離心管中,進行1 000 r/min離心5 min,倒棄上清液,再加入完全培養基輕柔吹打細胞并重懸備用;膠質瘤U87、U251細胞按照1∶3的細胞密度進行傳代,膠質瘤Hs683細胞按照1∶6的細胞密度進行傳代;將膠質瘤細胞各分為3組,不加藥物的對照組(Control組)、6 μmol/L和8 μmol/L NPS-2143處理組(指定濃度)。

1.2.2CCK-8實驗檢測細胞增殖能力 取備用膠質瘤U87、U251細胞以1 000個/孔的密度接種于96孔板,培養12 h;根據文獻調研及前期實驗摸索,用濃度分別為0.0 μmol/L、2.5 μmol/L、5.0 μmol/L、7.5 μmol/L、10.0 μmol/L NPS-2143處理細胞,檢測NPS-2143處理濃度與膠質瘤細胞增殖之間的關系;再用濃度分別為0.0 μmol/L、2.5 μmol/L、5.0 μmol/L的NPS-2143處理膠質瘤細胞,培養24 h、48 h和72 h,檢測NPS-2143處理時間與膠質瘤細胞增殖之間的關系。用含10 μL CCK-8的100 μL DMEM替換培基,在37 ℃下避光孵育1 h;使用酶標儀在450 nm處測定光密度(optical density, OD)值。

1.2.3平板克隆形成試驗檢測細胞克隆數 取備用膠質瘤U87和U251細胞以1 000個細胞/孔的密度接種在6孔板,用指定濃度的NPS-2143處理細胞,每間隔7 d更換1次含NPS-2143的培基,連續培養21 d后于顯微鏡下觀察細胞克隆形成情況;棄去培養板中的培基,1 mL/孔PBS洗滌培養皿2次,4%多聚甲醛固定細胞15 min,小心吸棄多聚甲醛,用1 mL PBS清洗2次,然后用0.1%結晶紫染色10 min,用1 mL/孔PBS洗滌3次后,放置37 ℃的烘箱烘干后,拍攝細胞板,用Image J軟件計菌落形成數。

1.2.4流式細胞術檢測細胞周期 將適量備用膠質瘤U87和U251細胞接種于6孔板,過夜培養后用指定濃度的NPS-2143處理細胞72 h,用0.25%胰酶消化膠質瘤細胞,加入1 mL/孔完全培基終止消化;將細胞懸液轉移到15 mL離心管中,1 000 r/min離心5 min,棄上清,加入70%預冷的乙醇,輕柔的渦旋混勻后在-20 ℃的冷凍室中固定過夜;取出固定后細胞,1 000 r/min、4 ℃、離心5 min,棄上清,用含2 μL RNase A(10 g/L)的100 μL PBS重懸細胞,37 ℃孵育30 min;1 500 r/min、4 ℃、離心5 min,棄上清;用含有20 μL PI(1 g/L)的400 μL PBS重懸細胞,37 ℃避光孵育30 min,流式細胞儀分析,Modifit軟件計算細胞周期分布。

1.2.5Annevin V-FITC/PI試劑盒檢測細胞凋亡 將適量備用膠質瘤U87和U251細胞接種于6孔板,過夜培養后用指定濃度的NPS-2143處理細胞72 h,用不含EDTA的胰蛋白酶消化膠質瘤細胞,1 mL完全培養基終止消化;1 500 r/min離心5 min,棄上清液,加入1 mL PBS溶液,輕柔的吹打重懸細胞,1 500 r/min離心5 min,用含5 μL Annexin V-FITC和10 μL PI的200 μL染色緩沖液重懸細胞,37 ℃避光孵育30 min;流式細胞儀進行檢測,Version 10.0 FlowJo軟件分析細胞凋亡情況。

1.2.6劃痕實驗測細胞遷移能力 將備用膠質瘤U87和Hs683細胞以2.5×105個/孔的密度接種于6孔板中,并在37 ℃、5%CO2的培養箱中過夜,當細胞融合度達到90%時,棄去原培養液,用1 mL PBS洗滌2次后,吸去PBS,于板底合適位置用直尺畫直線用于固定拍照視野,加入6 μmol/L NPS-2143后用100 μL移液管尖端劃傷痕形成傷口,于之后24 h、48 h時間點用顯微鏡觀察并拍攝愈合圖像,計算并分析創面閉合的相對距離。

1.2.7Transwell實驗測細胞遷移能力 將適量備用膠質瘤U87和Hs683細胞接種于6孔板中,并在37 ℃、5%CO2的培養箱中過夜,24 h后用指定濃度的NPS-2143處理,當細胞處理48 h時,準備Matrigel膠,溶膠并4 ℃過夜,試管和槍頭于-20 ℃預冷備用;當細胞處理72 h后,用無血清的培養基DMEM稀釋Matrigel膠,取100 μL稀釋膠加到24孔Transwell上室中,37 ℃孵育4～5 h備用;棄去細胞原培養液,1 mL PBS洗滌2次后0.25%胰酶消化細胞、1 mL無血清DMEM重懸、1 500 r/min離心5 min,棄上清液,1 mL無血清DMEM輕柔的吹打重懸細胞,接種到鋪有Matrigel膠的Transwell上室,將500 μL含10%胎牛血清的DMEM添加到Transwell下室,培養48 h;然后取出小室,吸去上室液體,PBS輕柔洗滌2次,4%多聚甲醛固定細胞15 min,小心吸棄多聚甲醛,PBS輕柔清洗2次,0.1%結晶紫染色10 min,用PBS清洗2次,晾干于倒置顯微鏡下觀察并拍攝。

1.2.8Western blot檢測蛋白表達 將適量備用膠質瘤U87、U251及Hs683細胞接種于6孔板,過夜培養后用指定濃度的NPS-2143處理細胞72 h,PBS 清洗2次并消化細胞,1 500 r/min離心5 min,棄上清,加適量RIPA裂解液于冰上裂解15 min,4 ℃、12 377 r/min離心15 min,取上清液用BCA法測定蛋白濃度,按規定比例將上樣緩存液加入上清液中,99 ℃水浴10 min,將制備好的蛋白樣品進行SDS-PAGE電泳、轉膜、5%脫脂牛奶室溫封閉1 h、一抗4 ℃孵育過夜,TBST洗膜3次、室溫孵育二抗1 h、TBST洗膜3次(10 min/次),加ECL發光試劑顯影,采用Image Lab4.1進行圖像分析。

1.3 統計學分析

2 結果

2.1 細胞增殖

CCK-8實驗結果表明NPS-2143可以抑制膠質瘤細胞的增殖,且具有濃度依賴性和時間依賴性(P<0.05);平板克隆形成實驗結果發現,NPS-2143處理組的細胞集落形成數量少于Control組(P<0.05);上述結果提示NPS-2143可以抑制膠質瘤細胞增殖及克隆形成能力。見圖1。

注：A、B為CCK-8實驗結果;C為細胞平板克隆實驗結果及定量結果;與同類細胞Control組相比,(1)P<0.05,(2)P<0.01。

2.2 細胞周期及P21、Cyclin D1的蛋白表達

流式細胞實驗結果顯示,NPS-2143組中G1期細胞的比例高于Control組(P<0.05)。 Western blot結果顯示,NPS-2143顯著增加膠質瘤U87和U251細胞中P21、降低Cyclin D1的蛋白表達水平(P<0.01)。見圖2。

注：A為細胞周期實驗分析膠質瘤細胞的結果及定量結果,B為Western blot 實驗結果及定量結果;與同類細胞Control組相比,(1)P<0.05,(2)P<0.01,(3)P<0.001。

2.3 細胞凋亡及促凋亡蛋白Bax和Caspase 3表達

流式細胞實驗結果顯示,與Control組相比,NPS-2143處理組中膠質瘤U87和U251細胞的凋亡細胞增加(P<0.05);Western blot結果顯示,NPS-2143組中促凋亡蛋白Bax和Caspase 3表達水平高于Control組(P<0.05);上述結果提示,NPS-2143可誘導膠質瘤細胞凋亡。見圖3。

注：A為流式細胞術分析膠質瘤細胞凋亡結果;B為凋亡蛋白Bax和Caspase 3蛋白條帶圖及定量結果;與同類細胞Control組相比,(1)P<0.05,(2)P<0.001。

2.4 細胞遷移和侵襲能力

劃痕實驗和Transwell實驗結果顯示,NPS-2143降低膠質瘤U87、Hs683細胞的遷移能力(P<0.05);Western blot結果顯示,NPS-2143降低膠質瘤U87、Hs683細胞中MMP2、MMP9、N-cadherin蛋白表達水平(P<0.05);上述結果表明,NPS-2143可能通過調節上皮間質轉化(epithelial-mesenchymal transition, EMT),干擾膠質瘤U87、Hs683細胞的遷移能力。見圖4。

注：A為劃痕實驗膠質瘤細胞的遷移侵襲能力和定量結果;B為Transwell實驗膠質瘤U87、Hs683細胞的遷移能力的形態學和定量結果;C為 Western blot 實驗結果及EMT蛋白定量結果;與同類細胞Control組相比,(1)P<0.05,(2)P<0.01。

2.5 NPS-2143通過激活AKT-mTOR通路抑制膠質瘤細胞自噬

實驗結果表明:NPS-2143可以顯著增加膠質瘤U87和U251細胞LC3Ⅱ、LC3Ⅱ/Ⅰ和P62的蛋白表達水平(P<0.05),提示NPS-2143可能抑制膠質瘤細胞晚期自噬。透射電鏡觀察膠質瘤細胞自噬囊泡結果表明:與Control組相比,NPS-2143處理組膠質瘤細胞自噬囊泡數量增加,提示NPS-2143可以阻礙膠質瘤細胞晚期自噬。Western blot檢測結果顯示,NPS-2143提高膠質瘤U87和U251細胞p-AKT和p-mTOR蛋白表達水平(P<0.05),提示NPS-2143可以激活AKT-mTOR通路。上述結果表明,NPS-2143可能通過激活AKT-mTOR信號通路抑制膠質瘤細胞自噬。見圖5。

注：A為Western blot 實驗結果及自噬蛋白定量結果;B為透射電鏡觀察膠質瘤細胞中自噬囊泡形態變化和結果(上8 000×,下20 000×,紅色箭頭指示為自噬囊泡);C為Western blot 實驗結果及AKT-mTOR通路蛋白的定量結果;與同類細胞Control組相比,(1)P<0.05,(2)P<0.01,(3)P<0.001。

3 討論

膠質瘤是成人最常見的中樞神經系統惡性腫瘤之一,即使積極接受標準治療,患者預后也十分不理想。因此,臨床迫切需要發現和開發治療膠質瘤的新化合物。NPS-2143是一種選擇性CaSR拮抗劑,在體外表現出抑制多種腫瘤生長與增殖的抗腫瘤能力[20-21],但NPS-2143在膠質瘤中的作用尚不清楚。

自噬是一種進化上保守的蛋白和細胞器降解過程,它對細胞的生存、分化、發育及穩態至關重要[22]。作為一個動態循環系統,自噬可以通過降解蛋白和細胞器為細胞提供必要能量和蛋白合成原料。自噬不僅對正常生理環境中細胞生命活動有重要調控作用,并且在癌癥、肌病及神經退行性變等多種疾病的病理過程中也扮演重要角色。癌前病變過程中,自噬可以阻止正常細胞發生惡性轉化,抑制癌癥發生。但當腫瘤形成后,自噬可以幫助腫瘤細胞克服缺氧、營養缺乏及免疫監視等不利的腫瘤微環境,促進腫瘤生長、增殖與放化療抵抗。為探討NPS-2143是否通過抑制自噬來抑制膠質瘤發展,我們采用Western blot方法分析LC3Ⅱ、LC3Ⅱ/Ⅰ和P62的蛋白表達水平,結果顯示,與Control組相比,NPS-2143處理組的膠質瘤細胞中LC3Ⅱ、LC3Ⅱ/Ⅰ和P62的表達顯著增加,提示NPS-2143可能抑制自噬的晚期。為了進一步證實這一結果,本研究采用透射電鏡觀察了膠質瘤細胞自噬囊泡,結果顯示,NPS-2143處理后的膠質瘤細胞中自噬囊泡數量增加,進一步表明NPS-2143可以抑制膠質瘤細胞晚期自噬。

自噬在腫瘤發生中扮演重要角色,抑制自噬可以誘導腫瘤細胞發生凋亡、細胞周期阻滯,并抑制腫瘤細胞的侵襲與遷移。膠質瘤細胞的遷移和侵襲是導致術后患者復發的主要因素,抑制膠質瘤細胞侵襲與遷移對改善患者預后具有重要意義。過往研究提示,抑制膀胱癌細胞自噬可誘導細胞凋亡[23],并且抑制自噬可抑制基質金屬蛋白酶MMP2和MMP9介導的膀胱癌細胞遷移和侵襲[24]。此外,相關研究表明抑制惡性黑色素瘤和膠質瘤細胞自噬可誘導凋亡和細胞周期阻滯,進而導致細胞死亡,還能抑制膠質瘤細胞的遷移和侵襲[25-28]。Xing等[18]的研究發現,通過破壞自噬小體和溶酶體之間的融合來特異性地抑制自噬,從而誘導胰腺癌、胃癌和乳腺癌細胞等多種癌細胞系的凋亡來觸發細胞死亡。與上述研究類似,本研究結果提示,NPS-2143通過抑制膠質瘤細胞自噬誘導G1期細胞周期阻滯和凋亡,并抑制膠質瘤細胞的增殖和遷移能力。

AKT-mTOR信號通路是細胞信號傳導的經典信號通路之一,與眾多人類疾病相關。過往研究報道表明mTOR是自噬的負調控因子[29]。AKT是將生長因子信號連接到下游通路的中心節點,同時也是mTOR的上游信號調控通路,激活AKT-mTOR通路可以抑制細胞自噬水平[30]。同樣,我們的研究結果顯示:NPS-2143可以導致p-AKT和p-mTOR的蛋白表達水平上升,提示NPS-2143可能通過激活AKT-mTOR信號通路進而抑制膠質瘤細胞自噬。

綜上所述,本研究發現NPS-2143可能通過激活AKT-mTOR信號軸抑制晚期自噬,從而抑制膠質瘤的進展。本研究將為膠質瘤的治療藥物篩選提供新的思路與可能。同時,本研究未能進一步在動物水平探究NPS-2143的抗膠質瘤能力、血腦屏障通透性和安全性,這些有待于我們在未來的研究中進一步探索和驗證。