貴州苗族紅酸湯對高脂飲食誘導型大鼠非酒精性脂肪肝的預防作用*

王乃經, 陳云云, 陳莎, 唐擴, 王惠群*

(貴州醫科大學 公共衛生與健康學院 環境污染與疾病監控教育部重點實驗室, 貴州 貴陽 561113)

發酵食品在人類飲食文化中已有數千年的歷史,諸多研究發現發酵食品中含有豐富的對人體健康有益的生物活性成分,如降壓肽、抗氧化肽、抑菌肽等,發揮輔助治療高血壓、清除自由基等作用[1]。日本國立癌癥研究中心提出大豆發酵類食品能減低心血管疾病患者死亡的風險[2],美國斯坦福大學一項研究指出發酵食品可以通過調節腸道菌群減輕人體炎癥反應[3]。基于發酵食品潛在的健康效應,一些組織已建議將發酵食品納入國家膳食推薦指南[4]。苗族紅酸湯在貴州省具有數百年的食用歷史,是貴州省民族特色發酵食品。紅酸湯以番茄、紅辣椒和木姜子作為主要原料,經微生物自然發酵后形成了一個完整的生物系統。發酵是決定紅酸湯酸度和風味成分的關鍵,主要分為兩步:第一步是將番茄和紅辣椒剁碎后密封于壇內發酵成半成品,第二步是在半成品中加入一定比例的木姜子和生姜等輔料經乳酸菌二次發酵。最終制成的紅酸湯富含多種生物活性物質,既保留了原有的番茄紅素和辣椒堿,又形成了乙酸乳酸等風味成分[5],其中番茄紅素和辣椒堿具有抗氧化、降低膽固醇、改善血脂和減輕炎癥的作用[6-7],而有機酸具有抑菌、消炎和抗氧化等作用[8]。上述研究提示紅酸湯作為一種富含多種復雜組分的發酵食品,在預防和治療脂代謝紊亂、非酒精性脂肪肝(nonalcoholic fatty liver disease,NAFLD)等疾病時具有價值。近年來多項研究表明,過量的脂肪攝入會增加機體罹患NAFLD和糖尿病的風險[9-11]。NAFLD是指不飲酒或少量飲酒人群的肝細胞脂肪變性和脂肪積聚而引起的一種臨床常見的慢性疾病,是威脅人民健康的三大肝病之一[12]。目前,有學者針對NAFLD 的發病機制提出了“二次打擊”學說:“一次打擊”即在高脂飲食誘導下體內游離脂肪酸(free fatty acids,FFA)和甘油三酯(triglyceride,TG)不斷增多引起肝臟脂肪積聚,導致肝細胞脂肪變性;“二次打擊”是在此基礎上誘發肝臟炎癥和線粒體功能障礙,并加重氧化應激,最終導致肝細胞受損和脂肪性肝炎[13-14]。研究表明,若不及時干預NAFLD,炎癥持續存在會造成肝細胞壞死嚴重,進而發展為肝硬化和肝癌。目前尚沒有治療NAFLD的有效藥物[15],主要是以祛除誘因、調整飲食及減輕體質量為主。因此,利用某些天然食物、發酵食品及其有效成分來調控血脂代謝,進行體重管理是未來防治NAFLD的發展趨勢[16-18]。本文用貴州苗族紅酸湯對高脂飲食誘導型大鼠NAFLD進行干預,探討苗族紅酸湯對NAFLD的預防作用及可能機制。

1 材料與方法

1.1 實驗材料

1.1.1材料 苗族紅酸湯(食品許可證號SC1245226350006,購自貴州玉夢食品有限公司);基礎飼料由貴州醫科大學動物實驗中心提供,其成分包括粗蛋白、粗脂肪、粗纖維、粗灰分、粗水分及微量元素和氨基酸等;高脂飼料由78.8%基礎飼料、1%膽固醇、10%蛋黃粉、10%豬油及0.2%膽鹽組成。

1.1.2實驗動物 無特定病原體(specific pathogen free,SPF)級雄性SD大鼠,6周齡,體質量(160±20)g,共30只,由貴州醫科大學實驗動物中心提供,許可證號為SCXK(遼)2020-0001。本次動物實驗在貴州醫科大學實驗動物中心進行,已獲得貴州醫科大學實驗動物倫理審查委員會批準(倫理審批號NO.2100228)。實驗環境:環境溫度(25±5)℃,相對濕度55%,明暗交替周期12 h/12 h,保持良好通風。

1.1.3主要試劑與儀器 總抗氧化能力(total antioxidant capability,T-AOC)、丙二醛(malondialdehyde,MDA)試劑盒購自南京建成生物工程研究所;腫瘤壞死因子α(tumor necrosis factor α,TNF-α)、白介素6(interleukin 6, IL-6)試劑盒購自武漢伊萊瑞特生物科技股份有限公司;二喹啉甲酸(bicinchoninic acid,BCA)蛋白濃度測定試劑盒購自北京索萊寶科技有限公司;10%多聚甲醛、蘇木精染料、伊紅染料、改良油紅O染色液購自上海麥克林生物有限公司。TDL-5000bR臺式高速離心機購自上海安亭儀器廠;Multiskan GO超級酶標儀、HPX-9162MBE恒溫孵育箱購自美國Thermo Scientific公司;HD-F2600全自動血生化分析儀購自濟南漢方醫療器械有限公司。

1.2 研究方法

1.2.1抗氧化成分含量檢測 番茄紅素檢測按照GB/T 22249-2008《保健食品中番茄紅素的測定》[19],辣椒堿檢測按照GB/T 30389-2013《辣椒及其油樹脂 總辣椒堿含量的測定 分光光度法》[20],有機酸檢測按照GB 5009.157-2016《食品有機酸的測定》[21]。

1.2.2貴州苗族紅酸湯的制備和灌胃劑量 將苗族紅酸湯和水按質量比 4∶1 稀釋,稀釋后的紅酸湯加熱至沸騰,冷卻后過濾收集濾液備用。經過前期人群攝入苗族紅酸湯的調查和《實驗動物學》的換算關系[22],本次實驗酸湯灌胃劑量定為根據體質量按照8 g/kg給予。

1.2.3實驗動物分組及干預 實驗動物分組:30只6周齡雄性SD大鼠適應性喂飼基礎飼料1周后,按照體質量隨機分為酸湯組、模型組和正常組(每組10只)。酸湯組喂飼高脂飼料,同時根據體質量按照8 g/kg灌胃苗族紅酸湯;模型組喂飼高脂飼料,灌胃同等體積的蒸餾水;正常組喂飼普通飼料,灌胃同等體積的蒸餾水。干預方式和時間:每日下午3時,以灌胃方式對3組大鼠連續干預12周,每次灌胃前稱取大鼠體質量,其余時間動物可自由攝食及飲水。

1.2.4實驗動物解剖和取材 實驗干預12周末,所有大鼠禁食12 h,并稱量體質量,腹腔注射1%的戊巴比妥鈉進行麻醉,心尖取血并保存在非抗凝的生化管中,常溫靜置10～20 min后,3 000 r/min離心15 min,取血清分裝,-80 ℃冷凍保存。剝離大鼠肝臟后稱重,并用生理鹽水漂洗,切取完整的一葉肝臟浸泡在10%多聚甲醛進行固定。

1.2.5肥胖指數(Lee's指數)和肝臟指數的計算 將記錄的大鼠體質量、身長及肝臟質量代入下列公式計算,Lee's指數(%)=體質量(g)1/3×103/身長(cm),肝臟指數(%)=肝臟質量/體質量×100% 。

1.2.6血清血脂四項和肝功能檢測 取400 μL血清用全自動血生化分析儀測定大鼠血清中甘油三酯(triglyceride, TG)、總膽固醇(total cholesterol, TC)、低密度脂蛋白膽固醇(low density lipoprotein cholesterol, LDL-C)、高密度脂蛋白膽固醇(high density lipoprotein cholesterol, HDL-C)、谷丙轉氨酶(alanine aminotransferase,ALT)和谷草轉氨酶(aspartate aminotransferase,AST)含量。

1.2.7血清T-AOC、MDA、TNF-α和IL-6檢測 取血清按照對應試劑盒說明書中蛋白濃度測定步驟依次加入標準品、待測樣品和BCA工作液,于37 ℃恒溫箱孵育30 min,用酶標儀設置波長562 nm處測量各孔吸光度,根據標準曲線計算蛋白濃度。

1.2.8肝臟蘇木素-伊紅染色(HE染色)和油紅O染色 用10%多聚甲醛固定肝組織,一部分經脫水、包埋、切片、HE染色、脫水后顯微鏡觀察肝組織病理變化;一部分經脫水、透明、冰凍固定、切片、復水、蘇木素染色、分化、反藍、0.5%伊紅染色、脫水后顯微鏡觀察肝組織脂質沉積情況;一部分組織經脫水、包埋、切片、滴加50%油紅O染色液染色、清洗、蘇木素染色、清洗、65%甘油封片后顯微鏡觀察肝組織脂質沉積情況。

1.3 統計學分析

2 結果

2.1 貴州苗族紅酸湯抗氧化成份的含量

苗族紅酸湯含有多種抗氧化成份,包括番茄紅素、辣椒堿、乳酸和乙酸,各種抗氧化成分的含量見表1。

表1 貴州苗族紅酸湯抗氧化成份的含量Tab.1 The antioxidant contents of antioxidant components of Guizhou Miao red sour soup

2.2 貴州苗族紅酸湯對大鼠體質量、攝食量、Lee's指數和肝臟指數的影響

各組大鼠體質量在實驗開始干預前無差異(P>0.05);經12周干預后,模型組體質量高于酸湯組和正常組大鼠(P<0.05),且酸湯組和正常組大鼠體質量差異無統計學意義(P>0.05),提示紅酸湯可以有效抑制高脂飲食誘導的大鼠體質量增加;模型組大鼠的Lee's指數和肝臟指數高于酸湯組和正常組(P<0.05),提示紅酸湯能降低高脂飲食導致的大鼠體內脂肪積聚;在干預期間,正常組、模型組和酸湯組大鼠攝食量無差異(P>0.05),提示紅酸湯沒有抑制酸湯組大鼠攝食量進而影響實驗結果。見圖1。

注：(1)與正常組比較,P<0.05; (2)與模型組比較,P<0.05。

2.3 貴州苗族紅酸湯對大鼠血脂四項水平的影響

紅酸湯可降低酸湯組大鼠血清TG、TC、LDL-C含量,同時升高血清HDL-C含量(P<0.05),提示紅酸湯具有預防高脂飲食導致的大鼠血脂紊亂的可能。見圖2。

注：(1)與正常組比較,P<0.05; (2)與模型組比較,P<0.05

2.4 大鼠肝功能ALT和AST水平

模型組大鼠的血清ALT和AST水平高于酸湯組和正常組(P<0.05),提示紅酸湯具有預防高脂飲食誘導的大鼠肝功能損傷的可能。見表2。

表2 貴州苗族紅酸湯對大鼠肝功能的影響Tab.2 Effect of Guizhou Miao red sour soup on liver function of

2.5 大鼠血清T-AOC、MDA、TNF-α和IL-6含量

由表3可知,紅酸湯可以升高酸湯組大鼠血清T-AOC含量,并降低MDA水平(P<0.05),提示紅酸湯具有預防機體氧化應激,提高抗氧化能力的可能。與正常組比較,模型組大鼠血清TNF-α和IL-6含量升高,經紅酸湯干預后酸湯組大鼠TNF-α和IL-6含量下降(P<0.05),提示紅酸湯具有預防高脂飲食誘導型大鼠NAFLD慢性炎癥的可能。

表3 貴州苗族紅酸湯對大鼠氧化應激和炎癥因子的影響Tab.3 Effect of Guizhou Miao red sour soup on oxidative stress and inflammation levels of

2.6 貴州苗族紅酸湯對大鼠肝臟脂質沉積的影響

肝組織HE染色結果顯示,正常組大鼠的肝細胞圓潤、飽滿,肝板排列規則、整齊,肝竇無明顯擴張或擠壓,未見明顯異常;模型組大鼠的肝臟廣泛可見肝細胞脂肪變性、胞質內可見大小不一的圓形空泡;酸湯組大鼠肝臟有少量肝細胞輕度脂肪變性,胞質內可見微小的圓形空泡。油紅O染色結果顯示模型組大鼠肝臟有大量紅色脂肪滴,而酸湯組和正常組大鼠只有少量紅色脂肪滴,提示貴州苗族紅酸湯能有效改善高脂飲食誘導下大鼠肝臟脂質沉積。見圖3。

圖3 各組大鼠肝臟組織學特征Fig.3 Histological characteristics of the rat liver in each group

3 討論

肝臟在維持機體代謝和內環境的平衡方面起著重要作用,肝功能失調可能會導致代謝性疾病[23],而脂質代謝參與了NAFLD的發展,若不及時干預,該疾病有可能發展為脂肪性肝炎、纖維化、肝硬化和肝癌[24]。NAFLD的發生往往伴隨著肝細胞脂肪變性、脂質積聚和機體氧化應激、慢性炎癥的現象。因此,本研究首先通過對貴州苗族紅酸湯的抗氧化成分進行檢測,發現番茄紅素、辣椒堿、乳酸和乙酸的含量較為豐富。然后本研究以高脂飲食誘導的NAFLD肥胖大鼠為研究對象,用貴州苗族紅酸湯進行干預后結果顯示,酸湯組大鼠的體質量、Lee's指數及肝臟指數較模型組大鼠均降低,提示進行酸湯干預后能夠預防大鼠體內的脂肪蓄積。干預期間,正常組大鼠、酸湯組大鼠及模型組大鼠在每日平均攝食量上無差異,提示紅酸湯并不是通過抑制大鼠食欲導致能量攝入減少從而發揮減輕體質量和減少脂肪生成的作用。說明貴州苗族紅酸湯對高脂飲食誘導型NAFLD具有一定的預防作用。

高脂飲食導致的NAFLD往往會伴隨著機體脂質代謝紊亂,研究表明,血清LDL-C能輸送TC至血液,HDL-C則是能運載血液中TG、TC向肝臟運輸,轉化為膽汁酸,促進膽固醇代謝,從而穩定血脂水平[25],而長期攝入過量飽和脂肪酸和膽固醇會導致機體血脂代謝負荷增加,引發血脂紊亂[26]。在本實驗中,酸湯組大鼠血清TG、TC、LDL-C和AST及ALT水平較模型組降低,同時HDL-C水平增高,提示紅酸湯干預能夠預防高脂飲食誘導的NAFLD大鼠血脂紊亂和肝功能受損。HE染色和油紅O染色結果顯示,酸湯組大鼠肝臟脂肪變性不明顯,圓形空泡和紅色脂肪滴數量較少,說明紅酸湯可以有效預防NAFLD大鼠肝臟脂肪變性和脂質沉積的現象,改善大鼠機體內脂代謝紊亂。

高脂飲食后能量攝入過剩導致脂質代謝紊亂,機體內會產生氧化應激。肝臟脂肪變性是NAFLD發病的重要機制,上述結果說明紅酸湯可能有效干預了NAFLD的“一次打擊”,從而緩解NAFLD的發生。值得注意的是,持續性高熱量飲食會加重脂肪細胞內TG沉積,造成細胞氧化應激,脂肪細胞中 TNF-α 和IL-6等炎癥因子分泌發生改變,造成慢性炎癥癥狀[27-28]。T-AOC是反應細胞內抗氧化能力總和的指標,一定程度上反映機體清除活性氧/一氧化氮合酶的能力;MDA 是脂質過氧化的終端產物,提示體內氧化應激程度,過量累積會對機體產生毒性[29]。TNF-α和IL-6是典型的炎癥因子[30-31],TNF-α可以抑制胰島素的信號轉導,引起血糖升高。長期攝入高脂飲食時脂肪組織可以分泌大量IL-6,而IL-6可以促進脂肪分解,升高FFA,并抑制胰島素肝糖原代謝從而引起胰島素抵抗,最終導致肥胖、動脈粥樣硬化和NAFLD等疾病。紅酸湯干預后,與模型組比較酸湯組大鼠血清T-AOC水平升高,MDA水平降低,并且酸湯組較模型組大鼠血清TNF-α和IL-6含量降低,說明紅酸湯能提高大鼠抗氧化能力和抗氧化酶活力,清除脂質過氧化產物,預防大鼠機體氧化應激,并且能夠減輕機體慢性炎癥。提示紅酸湯可能有效干預了NAFLD的“二次打擊”,預防機體氧化應激和慢性炎癥,從而緩解NAFLD的進一步發展。

綜上所述,本研究通過高脂飲食誘導NAFLD,在喂養高脂飲食的同時用貴州苗族紅酸湯進行干預,結果提示苗族紅酸湯對NAFLD有一定的預防作用,可能與其調節血脂紊亂、改善肝臟脂肪變性和脂質沉積、減輕機體氧化應激和慢性炎癥有關。