索拉菲尼誘導的細胞凋亡和自噬對HeLa細胞耐藥性的影響

楊鎧菲，朱靜格，張洋洋，趙俊果，高雨悅，胡煥煥，2*，姬國杰

新鄉醫學院三全學院1.生命科學技術學院；2.生育力保存重點實驗室；3.生物與基礎醫學實驗教學中心，河南 新鄉 453000

宮頸癌是世界范圍內對女性危害嚴重的第4大惡性腫瘤,主要發病于發展中國家和欠發達國家[1]。凋亡的特征是常見的形態學和生化改變[2],多數化療藥物都是通過誘導細胞凋亡發揮其抗癌活性,細胞產生耐藥性可能與細胞凋亡作用相關[3]。然而,由于外界藥物的刺激,細胞啟動一種自我保護的機制——細胞自噬。細胞自噬是一個嚴格受基因調控的過程,細胞自噬作用在細胞更新和增殖分化過程中都起著作用[4]。自噬與腫瘤密切相關[5],研究表明,細胞自噬作用對宮頸癌細胞藥物敏感性也有一定影響[6]。同種藥物在不同的細胞中對細胞自噬和細胞凋亡有著不同的影響,更好的理解細胞凋亡和細胞自噬的關系有助于腫瘤藥物的研發與腫瘤治療。

Bcl-2蛋白家族成員可以與自噬相關蛋白Beclin1結合從而直接抑制細胞自噬。凋亡途徑的完整性在Bcl-2家族對于自噬的抑制中起重要作用,當Bax和Bak被敲除時,細胞中固有的凋亡途徑也會失去功能,Bcl-2家族也就失去抑制細胞自噬的功能[7]。在肝癌細胞中,自噬對于腫瘤細胞的增殖表現出抑制作用[8]。藥物對細胞凋亡和自噬的影響在不同的細胞中顯示出不同的作用,有相關研究指出自噬促進了腫瘤細胞的凋亡[9]。

目前的大量研究證明索拉菲尼(sorafenib)在多種腫瘤如肝癌[10]、結腸癌[11]、黑色素瘤[12]、宮頸癌HeLa細胞[13-14]中都具有有效性。近年來,也有各種有關提高索拉菲尼的靶向性和治療效果的研究[15]。在某些細胞中(如白血病)索拉菲尼可獨立于RAF/MEK/ERK抑制誘導細胞凋亡[16-17],索拉菲尼介導的人類白血病細胞的殺傷力作用與內質網應激的誘導以及抑制翻譯導致的抗凋亡蛋白髓樣細胞白血病(myeloid cell leukemia-1,Mcl-1)下調有關,但在人類白血病細胞中,使用合適濃度索拉菲尼在細胞內質網發生氧化應激,可以有效的滅活細胞外調節蛋白激酶(extracellular regulated protein kinases 1,ERK1)[17]。

本研究主要針對索拉菲尼如何通過細胞凋亡和細胞自噬影響HeLa細胞增殖,以及細胞凋亡和細胞自噬之間的關系和細胞自噬與HeLa細胞耐藥性的關系來進行研究。在了解細胞自噬和細胞凋亡之間關系的同時,為宮頸癌治療的聯合用藥以及新藥的開發提供指導。

1 材料與方法

1.1 材料

人宮頸癌HeLa細胞系(購買自湖南豐暉生物科技有限公司)。Gibco胎牛血清、2.5%胰蛋白酶(10×)、臺盼藍染液(0.4%)、索拉菲尼、RPMI 1640培養基(北京索萊寶生物科技有限公司);CCK-8試劑、PBS(10×)、BCA蛋白定量試劑盒(上海碧云天生物技術有限公司);二甲基亞砜(DMSO)(Sigma Aldrich公司);TaKaRa RNA PCR Kit(AMV) ver3.0試劑盒(寶日醫生物技術有限公司)。

1.2 方法

1.2.1 體外細胞培養:在37 ℃、5% CO2的培養條件下,保證溫度和濕度,用含10% FBS的RPMI 1640培養基中進行培養。待細胞生長達到80%～90%匯合時,使用0.25%的胰蛋白酶進行消化傳代。取生長狀態良好的細胞用于后續實驗。

1.2.2 MTT法檢測索拉菲尼的IC50值:將對數生長期細胞制成濃度為3×104cells/mL的單細胞懸液,向各孔加入100 μL細胞懸液;待細胞貼壁后,換不同濃度加藥培養基(每個濃度做6個重復),放入恒溫培養箱繼續培養24 h;24 h后,用5 mL針管吸出加藥培養基,用0.9%氯化鈉溶液洗1～2次,再向每孔加入10 μl 5 mg/mL MTT溶液,在恒溫培養箱繼續培養4 h;用5 mL針管吸去MTT溶液,向每孔加150 μl DMSO,在室溫將96孔板在黑暗狀態下震蕩10 min,570 nm下測定吸光值,計算索拉菲尼對HeLa細胞抑制率及IC50值。

1.2.3 建立細胞耐藥株:用間歇誘導法構建耐藥細胞株[18],以0、2.5、5.0、7.5、10.0、15.0、20.0 μmol/L為梯度的索拉菲尼處理HeLa細胞,每個濃度維持1周,并篩選出可穩定傳代的耐藥細胞株,然后用常規培養基穩定耐藥細胞株,最后維持在含索拉菲尼藥物的培養液中。

1.2.4 流式細胞測量術檢測細胞增殖周期:在MTT法測定細胞增殖活性后,用無血清培養基培養HeLa細胞24 h,選用合適濃度的索拉菲尼處理HeLa細胞。將細胞收集在1.5 mL 離心管中,用0.9%氯化鈉溶液洗滌細胞3次,離心之后棄去上層清液,以200 μL生理鹽水重懸細胞,再將800 μL乙醇加入離心管,固定-20 ℃過夜;低速離心機離心,用1mL低滲溶液,在37 ℃孵箱中放置30 min;再進行離心,加入1mL PI溶液(50 μg/mL),放入冰水混合物30 min;用流式細胞儀測定熒光染料激發后PI-DNA復合物發出的熒光,用ModFit3.2進行細胞周期各階段的量化。

1.2.5 總RNA提取和PCR檢測:TRIzol法提取細胞的總RNA,將樣品進行反轉錄反應,以反轉錄得到的cDNA為模板用PCR試劑盒說明書進行實驗,以GAPDH為內參。取10 μL Taq mix(Taq+dNTP)、6 μL H2O、1 μL Forward Primer、1 μL Reverse Primer、2 μL Sample混合為20 μL總體系,放入PCR儀,設定程序,PCR擴增結束,進行電泳,對電泳圖進行灰度值分析,進而分析實驗結果。

1.2.6 Western blot檢測蛋白質表達:HeLa細胞中加適量細胞裂解液,冰上裂解30 min;于4 ℃下12 000 rpm離心5 min,保留上清,使用BCA蛋白質定量試劑盒測定樣品蛋白質濃度并進行定量。取20 μL樣品進行SDS-PAGE電泳分離,設置90 V電泳30 min,達到分離膠后調整電壓為120 V,待其達到末端停止電泳。使用電泳槽濕轉1 h,將樣品轉移至 PVDF膜,再用5%脫脂奶粉在37 ℃孵箱中封閉0.5 h。取出膜,進行一抗孵育,放置于4 ℃冰箱過夜。之后用HRP二抗,在室溫狀態下孵育1 h,最后在凝膠成像系統中進行曝光,進行灰度值分析。

1.3 統計學分析

2 結果

2.1 HeLa細胞耐藥株的構建

以間歇誘導法構建耐藥細胞株,最終篩選出的索拉菲尼IC50濃度為16.992 μmol/L。親本株:細胞多為圓形;耐藥株:在細胞進行耐藥誘導之后,多為不規則形狀,且細胞體積增大(圖1)。

A.parental cell strain; B.drug-resistant strains of sorafenib.

2.2 MTT法測定細胞增殖

MTT結果顯示,隨著藥物濃度的增加,細胞活力逐漸下降且親本株下降較為明顯(圖2)。同時,索拉菲尼藥物對親本細胞有更高的抑制率,說明索拉菲尼藥物對細胞的增殖具有抑制作用,并且對親本細胞株的抑制作用更加顯著(P<0.05),而耐藥細胞株則具有更強的增殖能力(圖3)。

圖2 細胞活性比較Fig 2 Comparison of cell viability in each group

圖3 細胞增殖情況比較Fig 3 Comparison of cell proliferation curves in each

2.3 流式細胞術檢測細胞周期

流式檢測結果顯示,加藥組G0/G1期細胞數量顯著升高(圖4)。耐藥細胞株在G0/G1期發生細胞周期阻滯,在G1期細胞有明顯數量增加。說明索拉菲尼是通過阻滯細胞周期來抑制細胞增殖(圖5)。

A.control group; B.sorafenib group; C.cell quantification map of each stage; *P<0.05 compared with control group.

A.parental strain; B.drug-resistant strain; C.cell quantification map of each stage; *P<0.05 compared with parental group.

2.4 目標mRNA表達量在親本株和耐藥株中的測定

PCR結果顯示, 經索拉菲尼處理的細胞耐藥基因表達量相對升高,凋亡基因與凋亡抑制基因也相對升高,但凋亡基因升高更為顯著(P<0.05)(圖6)。在15 μmol/L之前,細胞凋亡起促進作用,在15 μmol/L之后,細胞凋亡被抑制(圖7)。

A.parental group; B.drug-resistant strain group; *P<0.05 compared with 0 μmol/L group.

*P<0.05 compared with control group.

2.5 自噬標志物蛋白在親本和耐藥細胞的表達情況

LC3有兩種亞型分別為LC3-Ⅰ和LC3-Ⅱ,常被作為檢測細胞自噬的標志,LC3-Ⅱ/LC3-Ⅰ的比值被用來判定細胞自噬程度的高低。Western blot結果顯示,耐藥細胞的LC3-Ⅱ/LC3-Ⅰ的比值顯著高于親本細胞,表明索拉菲尼會誘導細胞LCs的自噬水平升高(圖8)。

*P<0.05 compared with parental strain.

3 討論

近幾年來,宮頸癌被稱為危害女性生殖功能的惡性腫瘤之一,迄今仍缺乏有效的治療手段,一方面因為錯綜復雜的病理因素,另一方面因為服藥一段時間后腫瘤出現耐藥性。近幾年的研究認為細胞自噬是腫瘤細胞出現耐藥性的原因之一,但目前對細胞凋亡與自噬對腫瘤增殖作用的影響仍存在爭議,高水平的自噬伴隨caspase家族蛋白的低表達[19]。所以,一定程度上細胞自噬與細胞凋亡呈現負相關, 促進腫瘤細胞的存活; 外界藥物的刺激在引起細胞自噬,自噬相關蛋白作為caspase家族蛋白的底物,輕微的下調caspase蛋白活性,調控細胞凋亡,這時細胞自噬與腫瘤細胞的耐藥性呈現正相關。由于細胞自噬在一定程度上引起細胞死亡,如果藥物的刺激對腫瘤細胞的刺激較大,這時細胞自噬與細胞耐藥性呈現出負相關,即自噬促進腫瘤細胞的死亡。所以,細胞凋亡和細胞自噬對于腫瘤細胞都存在拮抗效應,只是在不同的時期發揮的主效應不同,若細胞凋亡大于細胞自噬所發揮的效應,自噬就引起細胞的耐藥性;若細胞自噬大于細胞凋亡所發揮的效應,自噬就會促進細胞死亡。所以,探索細胞凋亡和細胞自噬的界限有助于更好的理解藥物對腫瘤細胞增殖的影響。在了解細胞自噬和細胞凋亡之間關系的同時,為宮頸癌治療的聯合用藥以及新藥的開發提供指導。

綜上所述,藥物索拉菲尼通過阻滯細胞周期來達到抑制腫瘤細胞增殖的目的。細胞自噬一方面參與了細胞耐藥的發展,促進細胞存活;另一方面,在一定的限度上,也能激活耐藥細胞的凋亡信號通路,促進細胞耐藥逆轉。隨著對自噬和凋亡界限研究的不斷深入,以及科學技術的不斷發展,相信未來在宮頸癌的治療方面將會取得重大進展。