安羅替尼通過調控miR-16-5p/PD-1軸抑制人非小細胞肺癌細胞系增殖并促進凋亡

梁香存，魏小雨，梁 健，王 慶，耿 廣

河北省胸科醫院 腫瘤科，河北 石家莊 050041

肺癌是世界范圍內最常見的癌之一,也是死亡率最高的癌種之一[1]。調查顯示,肺癌每年新增病例200萬,死亡病例約176萬[2],其發病率和死亡率不斷上升,給社會帶來巨大負擔。近幾十年來,中國針對肺癌的靶向藥物研發已經取得了豐碩進展。尤其是分子靶向治療策略已經在非小細胞肺癌(non-small cell lung cancer cell, NSCLC)治療中取得了顯著成就[3]。安羅替尼(Anlotinib),商品名?？删S,是中國自主研發的新型小分子多靶點酪氨酸激酶抑制劑,臨床上被用來提高NSCLC患者的存活期[4]。微小RNA(microRNA, miRNA)是一段長度約為18～22 nt的內源性核苷酸單鏈,其在腫瘤的發生發展中起到重要的調控作用[5]。迄今為止,miR-16-5p在多種癌中扮演抑癌基因的角色,其中包括NSCLC[6]。程序性細胞死亡-1(programmed cell death-1, PD-1) 是T細胞、B細胞和自然殺傷細胞常見的細胞表面受體。在PD-1與其配體結合后,可通過SHP-2抑制T細胞活化,使T細胞受體介導的相關信號Zap 70去磷酸化,最終抑制T細胞增殖[7]。本研究擬以NSCLC細胞系A549和H1299細胞為研究對象,觀察安羅替尼對NSCLC細胞增殖和凋亡的影響,進而揭示安羅替尼與miR-16-5p/PD-1信號軸的相互作用。

1 材料與方法

1.1 實驗材料

人源非小細胞肺癌細胞系A549和H1299(上海科學研究院細胞庫);SPF級6～8周齡的雄性BALB/c-nu裸鼠[北京華阜康生物科技股份有限公司,許可證號:SCXK(京)2020-0004];安羅替尼(正大天晴藥業集團股份有限公司);DMEM培養基(Gibco公司);胎牛血清(Hyclone公司);CCK-8試劑盒(日本同仁化學研究所);EDU細胞增殖檢測試劑盒(廣州銳博生物公司);annexin V-FITC/PI細胞凋亡檢測試劑盒和雙熒光素酶報告基因檢測試劑盒(上海碧云天生物技術有限公司);相關小分子試劑(agomiRNA、agomiR-16-5p、si-NC、si-PD-1)和質粒[pcDNA 3.1(+)-PD-1、pGL3-PD-1-WT、pGL3-PD-1-MUT](上海吉瑪公司)。

1.2 實驗方法

1.2.1 細胞的分組及處理:首先,將無菌水制備的10 nmol/L安羅替尼母液加入A549和H1299細胞中,使其終濃度分別為0、10和20 μmol/L。孵育48 h后,利用LipofectamineTM3000將相關的小分子試劑和質粒分別轉染至A549和H1299細胞中,包括agomiRNA、agomiR-16-5p、si-NC、si-PD-1、pcDNA3.1(+)、pcDNA(+)-PD-1、pGL3-PD-1-WT和pGL3-PD-1-MUT,轉染12 h后,更換新鮮培養液,48 h后,收集細胞,用于后續研究。

1.2.2 CCK-8實驗檢測細胞增殖: 將A549和H1299細胞以2×103個/孔分別接種于96孔板。待細胞貼壁后,每孔加入20 μL的CCK-8試劑,避光孵育20 min。用酶標儀檢測細胞在490 nm的吸光度(A)。計算各組細胞增殖抑制率(%)。細胞增殖抑制率(%)= [(A490對照組-A490實驗組)/A490對照組]×100%。

1.2.3 EDU實驗檢測細胞增殖:將A549細胞和H1299細胞以3×105個/孔分別接種于24孔板。用紅色熒光染料EDU標記細胞。4%多聚甲醛固定。Triton×100細胞膜通透,DAPI核染色。最后,熒光顯微鏡下成像分析,計算EDU陽性率(%)。EDU陽性率(%)= EDU陽性細胞數/總細胞數×100%。

1.2.4 流式細胞術檢測細胞凋亡:收集1×106個細胞,預冷的PBS洗滌3次,用500 μL緩沖液制成單細胞懸液。隨后,加入5 μL的annexin V-FITC,混勻,避光孵育10 min,再加入5 μL的PI,混勻,繼續孵育15 min。最后,利用流式細胞儀分析細胞凋亡情況。

1.2.5 Western blot檢測PD-1蛋白表達:收集細胞,用RIPA裂解液冰上裂解,提取總蛋白。Bradford法定量總蛋白濃度,沸水浴變性。等量蛋白用10%的SDS-PAGE膠電泳。待蛋白分離后,將蛋白轉移至PVDF膜。隨后,脫脂奶粉封閉處理。用PBS稀釋的鼠抗PD-1(1∶1 000) 4 ℃孵育過夜。HRP標記的二抗37 ℃孵育2 h。洗膜,滴加ECL顯影液,顯色曝光。利用Image J分析條帶吸光度。

1.2.6 雙熒光素酶報告基因實驗檢測miR-16-5p與PD-1的靶向性:首先,利用Starbase(https://starbase.sysu.edu.cn)數據庫評估miR-16-5p與PD-1之間的作用靶點。根據預測到的靶點信息設計合成pGL3-PD-1-WT和pGL3-PD-1-MUT質粒,構建熒光酶報告基因載體。隨后將上述報告基因載體分別與agomiRNA、agomiR-16-5p、antagomiRNA以及antagomiR-16-5p共轉染至A549細胞。按照雙熒光素酶報告基因試劑盒說明,檢測A549細胞中的熒光素酶活性。

1.2.7 移植瘤模型實驗檢測安羅替尼對A549細胞成瘤性的抑制能力:將BALB/c-nu裸鼠隨機分為3組,即對照組、安羅替尼組、陽性組,每組6只。將處于增殖期的A549細胞,制備成單細胞懸液。用生理鹽水調整濃度至2×1010/L,在無菌條件下每只裸鼠右側腋窩皮下注射0.2 mL。陽性組灌胃4 mg/kg順鉑處理,安羅替尼組灌胃50 mg/kg安羅替尼處理,對照組灌胃等體積生理鹽水,1次/d,持續28 d。記錄各組小鼠移植瘤體積,并且麻醉處死各組小鼠后,記錄移植瘤體質量。移植瘤體積(mm3)=(長×寬2)/2。

1.3 統計學分析

2 結果

2.1 安羅替尼對NSCLC細胞增殖和凋亡的影響

與對照組相比,安羅替尼組細胞增殖抑制率顯著升高,Edu陽性率顯著降低,凋亡率顯著升高(P<0.05)(圖1)。

A.cell proliferation was detected by EDU assay; B.Cell apoptosis was detected by annexin Ⅴ/PI staining; C.cell proliferation was detected by CCK-8 assay;*P<0.05 compared with control group.

2.2 安羅替尼調控NSCLC中的miR-16-5p和PD-1表達

與對照組相比,安羅替尼組細胞miR-16-5p表達顯著升高,PD-1的mRNA和蛋白表達均顯著降低(P<0.05)(圖2)。

A.miR-16-5p expression; B.expression of PD-1 mRNA; C.expression of PD-1 protein;*P<0.05 compared with control group

2.3 miR-16-5p直接靶向結合PD-1 3′UTR

Starbase(https://starbase.sysu.edu.cn/)預測 miR-16-5p和PD-1之間的結合序列(圖3A)。雙熒光素酶報告實驗結果顯示,僅agomiR-16-5p組PD-1 3′UTR-WT細胞的熒光活性明顯降低,agomiR-16-5p組PD-1 3′UTR-MUT細胞、antagomiR-16-5p組PD-1 3′UTR-WT細胞、antagomiR-16-5p組PD-1 3′UTR-MUT細胞的熒光活性均未發生明顯變化(圖3B)。與agomiRNA組相比,agomiR-16-5p組細胞PD-1的mRNA和蛋白表達均顯著降低,與antagomiRNA組相比,antagomiR-16-5p組細胞PD-1的mRNA和蛋白表達均顯著升高(均P<0.05)(圖3C、D)。

2.4 過表達miR-16-5p對NSCLC細胞增殖和凋亡的影響

與agomiRNA組相比,agomiR-16-5p組細胞miR-16-5p表達顯著升高,細胞增殖和凋亡率均顯著升高,EDU陽性率顯著降低(P<0.05)(圖4)。

A.miR-16-5p expression; B.cell proliferation was detected by CCK-8 assay;C.cell proliferation was detected by EDU assay; D.cell apoptosis was detected by annexin Ⅴ/PI staining;*P<0.05 compared with agomiRNA group.

2.5 敲減PD-1對NSCLC細胞增殖和凋亡的影響

與si-NC組相比,si-PD-1組細胞PD-1的mRNA和蛋白表達均顯著降低,細胞抑制率和凋亡率均顯著升高,EDU陽性率顯著降低(P<0.05)(圖5)。

A.PD-1 mRNA expression; B.PD-1protein expression;C.cell proliferation was detected by CCK-8 assay;D.cell proliferation was detected by EDU assay; E.cell apoptosis was detected by annexin Ⅴ/PI staining;*P<0.05 compared with si-NC group.

2.6 過表達PD-1逆轉安羅替尼介導的miR-16-5p對A549細胞的生物學行為

與20 μmol/L組相比,20 μmol/L+agomiR-16-5p組細胞miR-16-5p表達顯著升高,細胞抑制率和凋亡率均顯著升高,EDU陽性率顯著降低(P<0.05);與20 μmol/L+agomiR-16-5p+pcDNA組相比,20 μmol/L+agomiR-16-5p+pcDNA-PD-1組細胞miR-16-5p表達顯著降低,細胞抑制率和凋亡率均顯著降低,EDU陽性率顯著升高(P<0.05)(圖6)。

A.miR-16-5p expression in A549 cells; B.cell proliferation was detected by CCK-8 assay in A549 cells;C.cell proliferation was detected by EDU assay in A549 cells; D.cell apoptosis was detected by annexin Ⅴ/PI staining in A549 cells; *P<0.05 compared with 20 μmol/L group; #P<0.05 compared with 20 μmol/L +agomiR-16-5p+pcDNA group.

2.7 裸鼠移植瘤實驗

體內實驗結果顯示,與對照組相比,安羅替尼組瘤體積(7 d、14 d除外)和瘤質量明顯降低(P<0.05)(圖7)。

*P<0.05 compared with control group.

3 討論

安洛替尼是一種新型口服酪氨酸激酶抑制劑,作為一種新型分子靶向藥物能夠靶向血小板衍生生長因子受體、成纖維細胞生長因子受體和血管內皮生長因子受體。在晚期NSCLC 患者的3期試驗中,安羅替尼能夠明顯提高患者的總生存期和無進展生存期[4]。然而,安羅替尼治療NSCLC的機制仍需深入研究[8]。本研究初步探索了安羅替尼抗NSCLC的作用以及與miR-16-5p/PD-1信號軸的關系。

已有的研究證明,miR-16在人類多種癌中發揮重要的抑癌作用,包括乳腺癌、宮頸癌、和膀胱癌等[9-11]。例如,miR-16作為長鏈非編碼RNA(lncRNA)XIST的下游靶點,通過靶向CDK8抑制NSCLC細胞增殖、遷移和侵襲,同時阻滯細胞周期[13]。然而,關于miR-16-5p作為抗癌藥物作用靶點的研究尚少。本研究發現在A549和H1299細胞中miR-16-5p的表達水平與安羅替尼的濃度呈正相關,即安羅替尼能夠上調miR-16-5p表達。進一步研究發現,過表達miR-16-5p能夠顯著抑制A549和H1299細胞增殖,促進細胞凋亡。

PD-1/PDL-1阻斷抗體通過調節免疫細胞和腫瘤細胞之間的相互作用發揮腫瘤抑制劑的作用。PD-1阻斷劑在多種惡性腫瘤中具有顯著的臨床療效,尤其NSCLC[12]。研究顯示,PD-1在55%的NSCLC患者中高表達,利用PD-1阻斷劑治療的NSCLC晚期患者的無進展生存期顯著延長[13]。另外,PD-1抗體聯合安羅替尼對發生肝、腦轉移的NSCLC患者表現出良好的可耐受毒性和抗腫瘤活性[14]。本研究結果顯示,PD-1的表達水平與安羅替尼的濃度呈負相關,PD-1是miR-16-5p的下游靶基因。降低PD-1表達能夠明顯抑制A549和H1299細胞增殖,促進凋亡;相反,過表達PD-1可逆轉安羅替尼介導的miR-16-5p對NSCLC細胞增殖的促增殖、抗凋亡作用。

綜上所述,安羅替尼能夠抑制NSCLC細胞增殖,促進凋亡,其機制可能與miR-16-5p/PD-1信號通路相關。因此,本研究為安羅替尼用于NSCLC的治療提供了一定的實驗數據和理論基礎。