胎兒生長受限孕婦胎盤自噬相關蛋白表達水平及其臨床意義

張玉苓，張 珂，許 艇，張 慶

鄭州大學第二附屬醫院 婦產科，河南 鄭州 450014

胎兒生長受限(fetal growth restriction,FGR)是指女性在妊娠期間,腹中胎兒因各種因素生長發育未達標準,胎兒體質量低于同孕齡平均體質量的第10百分位,或低于同孕齡平均體質量的2個標準差[1]。FGR增加了圍產期發病率和死亡率,其中57%不明原因的死亡認為與FGR有關[2]。但目前臨床關于FGR的病因、病理機制,多認為與母體宮內環境因素異常導致的胎盤功能障礙有關[3]。有研究發現,由于胎盤的功能性異常,引起滋養細胞自噬[4],進而導致FGR,但關于滋養細胞自噬在FGR中具體的形成和調控機制尚無明確的報道。Beclin-1、微管相關蛋白輕鏈3(microtubule-associated protein 1 ligh chain 3,LC3)是自噬蛋白中類型代表,其中Beclin-1是自噬前體細胞膜合成與生長的最早復合體,LC3是自噬體膜構成的關鍵蛋白,Beclin-1和 LC3在妊娠期糖尿病患者中有較高的表達,與妊娠期糖尿病患者不良妊娠結局有關[5],但Beclin-1和 LC3在FGR中的表達尚不清楚。鑒于此,本研究旨在探討胎兒FGR孕婦胎盤自噬相關蛋白Beclin-1、LC3表達水平及其臨床意義,探討自噬與FGR發病的內在關系。

1 材料與方法

1.1 資料

1.1.1 病例來源:選取2022年8月至2023年8月于鄭州大學第二附屬醫院因FGR分娩的孕婦胎盤組織40例作為研究對象,年齡18～38歲;孕次1～3次;孕前體質量47～68 kg;孕周37～41周。納入標準:符合FGR臨床診斷標準[6],單胎、孕周明確、足月。排除標準:合并嚴重肝腎功能損傷和免疫細胞疾病;胎兒畸形;有FGR家族史和既往史。另選取同期正常分娩的孕婦胎盤組織40例為健康組,健康組病例排除內外科疾病和產科并發癥。此次研究為回顧性研究,經鄭州大學第二附屬醫院倫理審批通過,倫理審批號(2021242)。孕婦及家屬知情同意。

1.1.2 臨床資料收集:根據本次研究目的收集孕婦臨床資料,記錄入組孕婦年齡、孕次、孕前體質量、分娩孕周、胎盤厚度、胎盤質量和新生兒體質量等。

1.1.3 試劑(盒):RNA提取試劑盒(天根生化科技公司);GAPDH引物(寶生物工程有限公司)。

1.2 方法

1.2.1 胎盤樣本的處理:所有入組孕婦均于分娩后留取胎盤組織中央組織2 cm×2 cm×2 cm組織塊,常規行0.9%氯化鈉注射液進行漂洗,后取其中小部分行多聚甲醛灌注取材后固定12 h,蒸餾水沖洗3次后置于乙醇中,行脫水、包埋和切片處理。

1.2.2 RT-qPCR法檢測胎盤組織中Beclin-1、LC3 mRNA水平:以RNA提取試劑盒進行RNA提取,后將提取的RNA反轉錄為cDNA行qRT-PCR反應。以GAPDH為內參基因。采用2-ΔΔCt法計算Beclin-1、LC3 mRNA相對表達量。Beclin-1上游引物5′-AGTGGCGGCTCCTATTC-3′、下游引物5′-GGACACC CAAGCAAGAC-3′;LC3上游引物5′-TTCGCCGACC GCTGTAA-3′、下游引物5′-ATCCGTCTTCATCCTT CTCCT-3′。GAPDH上游引物:5′-AGTGGCAAAGTG GAGATTGTTG-3′;下游引物:5′-CAGTCTTCTGGGTG GCAGTGAT-3′。

1.2.3 免疫組化法檢測Beclin-1、LC3蛋白表達:石蠟標本切片后,甲苯脫蠟-酒精脫蠟-PBS清洗-抗原修復后,封閉。以細胞質或細胞核內出現黃色為陽性。采用免疫反應積分法(IRS)評價染色結果,占比0～<25%、25%～<50%、50%～<75%和≥75%分別為1分～4分。陽性細胞染色強度評分:無染色、淺黃色、黃褐色和棕褐色分別為0分、1分、2分和3分。IRS=陽性細胞百分比評分和陽性細胞染色強度評分之積,以IRS≤3分為陰性,>3分為陽性。

1.2.4 觀察指標:比較FGR組與健康組一般資料、胎盤厚度、胎盤質量和新生兒體質量;比較FGR組與健康組自噬相關蛋白Beclin-1 mRNA、LC3 mRNA水平和蛋白表達情況;比較胎盤組織Beclin-1、LC3陽性蛋白表達在不同資料FGR患者中差異。

1.3 統計學分析

2 結果

2.1 FGR組與健康組一般資料比較

FGR組與健康組在年齡、孕周等方面比較無統計學顯著性差異(表1)。

表1 FGR組與健康組一般資料比較Table 1 Comparison of general data between FGR group and healthy n=40)

2.2 FGR組與健康組胎盤厚度、胎盤質量和新生兒體質量比較

FGR組與健康組在胎盤厚度、胎盤質量和新生兒體質量方面均有差異(P<0.05)(表2)。

表2 FGR組與健康組胎盤厚度、胎盤質量和新生兒體質量比較

2.3 FGR組與健康組自噬相關蛋白Beclin-1 mRNA、LC3 mRNA水平比較

FGR組Beclin-1 mRNA、LC3 mRNA水平均高于健康組(P<0.001)(圖1)。

FGR. fetal growth restriction; *P<0.001 compared with the healthy group.

2.4 FGR組與健康組自噬相關蛋白Beclin-1、LC3陽性表達比較

FGR組自噬相關蛋白Beclin-1、LC3陽性表達率均顯著高于健康組(P<0.05)(圖2,表3)。

A.Beclin-1 expression in health group; B.Beclin-1 expression in FGR group; C.LC3 expression in health group; D.LC3 expression in FGR group.

表3 FGR組與健康組自噬相關蛋白Beclin-1、LC3陽性表達比較

2.5 FGR孕婦中胎盤組織Beclin-1、LC3蛋白陽性表達不同臨床資料比較

FGR孕婦中胎盤組織Beclin-1、LC3蛋白表達陽性率在胎盤厚度、胎盤質量、新生兒體質量比較上,差異均有統計學意義(P<0.05);在產后大出血、羊水過多和胎兒窘迫比較上無統計學意義(P>0.05)(表4)。

表4 FGR孕婦中胎盤組織Beclin-1、LC3蛋白陽性表達不同臨床資料比較

3 討論

研究顯示,孕婦在妊娠期營養不足,或有妊娠并發癥,是影響胎兒生長的危險因素[7]。本次研究結果顯示,FGR組胎盤厚度、胎盤質量和新生兒體質量水平均較低,與既往報道一致[8]。由于臨床對于FGR的早期監測指標尚無權威的研究,故有必要尋求可靠的生物學指標。

本研究發現,FGR組Beclin-1 mRNA、LC3 mRNA水平均較高。Beclin-1蛋白作為酵母自噬基因Atg6的同源基因,Bcl-2結合部位、螺旋-螺旋結構域和進化保守結構域均是其主要功能位點[9]。LC3是酵母菌自噬基因Ap98在哺乳動物中的同源物[10]。在自噬體形成過程中,Beclin-1可以引導相關蛋白定位,同時依賴Beclin1-PI3KC3復合體參與形成自噬體,該復合體中還同時包括Atg14。自噬體雙層膜結構的形成是Atg14與Beclin-1相互作用的結果,是自噬形成的關鍵起始階段。其中LC3是自噬體形成的生物標志,Beclin-1則可與其他蛋白結合共同調節自噬體形成[11]。分析本研究結果變化,可能是由于胎盤自身發育異常等因素,限制了營養物質攝取和轉運,導致胎盤灌注不足,使滋養細胞及蛻膜細胞凋亡。正常的自噬可以參與細胞的增殖分化,而過度自噬會引發滋養細胞的內皮功能紊亂,引發胎盤功能障礙[12]。本次研究發現,FGR組自噬相關蛋白Beclin-1、LC3陽性表達率,及不同胎盤厚度、胎盤質量、新生兒體質量陽性表達率比較上均有差異。分析其機制可能是由于Beclin-1、LC3抑制了胎盤滋養細胞增殖、侵襲,使胎盤組織被過度激活,誘導并促進自噬,以此影響胎盤的發育及功能,參與FGR疾病進展。

綜上所述,FGR孕婦胎盤組織中自噬基因Beclin-1、LC3陽性表達情況與胎兒發育水平有關,臨床可以通過Beclin-1、LC3檢測為評估FGR提供一定參考。