氟脅迫條件下茶樹葉部實時熒光定量PCR分析中內參基因的篩選與驗證

李慶會 李睿 溫曉菊 倪德江 王明樂 陳玉瓊

收稿日期：2023-12-16 ????????????修訂日期：2024-01-03

基金項目：國家自然科學基金項目（31972463）

作者簡介：李慶會，女，博士研究生，主要從事茶葉安全生產與品質調控方面的研究。*通信作者：chenyq@mail.hzau.edu.cn

摘要：為了篩選氟脅迫條件下茶樹（Camellia sinensis）葉部用于實時熒光定量PCR（qRT-PCR）分析的內參基因，以課題組前期篩選的低氟茶樹品種福鼎大白茶和高氟茶樹品種金觀音為試驗材料，利用qRT-PCR技術結合geNorm、NormFinder和BestKeeper軟件，分析氟脅迫條件下（0.42 mmol·L-1 NaF）8個候選內參基因（CsACTIN、CsEF-1α、CseIF-4α、CsGAPDH、CsPP2A、CsTBP、CsTIP41和CsUBC）在茶樹不同葉位（新梢和老葉）、不同脅迫時間（0、1、3、7 d）的表達穩定性。結果顯示，在氟脅迫條件下，茶樹新梢中最優內參基因組合是CsEF-1α、CsTIP41、CsTBP和CsACTIN，老葉中最優內參基因組合是CsPP2A和CsUBC。利用篩選得到的最優內參基因組合分析氟輸出蛋白基因（CsFEX）的表達情況，發現CsFEX在兩個茶樹品種的新梢和老葉中的表達趨勢一致，說明篩選的內參組合可用于氟脅迫條件下茶樹新梢和老葉中目的基因的檢測。

關鍵詞：茶樹；氟；內參基因；實時熒光定量PCR；基因表達

中圖分類號：S571.1；Q52? ? ? ? ? ? ?文獻標識碼：A? ? ? ? ? ? ? ?文章編號：1000-369X（2024）01-027-10

Selection and Validation of Internal Reference Genes for qRT-PCR Analysis under Fluoride Stress in

Camellia sinensis Leaves

LI Qinghui， LI Rui， WEN Xiaoju， NI Dejiang， WANG Mingle， CHEN Yuqiong*

National Key Laboratory for Germplasm Innovation and Utilization of Horticultural Crops， College of Horticulture and Forestry Sciences， Huazhong Agricultural University， Wuhan 430070， China

Abstract： In order to screen the internal reference genes for quantitative real-time PCR analysis in tea leaves under fluoride stress， the low-fluoride cultivar ‘Fuding Dabaicha and the high-fluoride cultivar ‘Jinguanyin were used as experimental materials according to the fluoride evaluation results in these tea cultivars previously. The qRT-PCR technology combined with three Excel-based algorithms （geNorm， NormFinder and BestKeeper） were used to analyze the expression stabilities of eight candidate reference genes （CsACTIN， CsEF-1α， CseIF-4α， CsGAPDH， CsPP2A， CsTBP， CsTIP41 and CsUBC） in tea leaves （shoots and old leaves） under fluoride treatment （0.42 mmol·L-1 NaF） for different time periods （0， 1， 3， 7 d）. The results indicate that under fluoride stress， the optimal combination of reference genes in tea shoots was CsEF-1α， CsTIP41， CsTBP and CsACTIN and the optimal combination of reference genes in old leaves was CsPP2A and CsUBC. Moreover， to further confirm the stability of the selected reference genes， the expression levels of CsFEX in tea shoots and old leaves were analyzed using their corresponding optimal internal reference gene combinations. The expression profiles of CsFEX in tea shoots or old leaves between the two cultivars were consistent， indicating that the combinations of four and two internal reference genes were sufficient for normalizing the target gene expression in tea shoots and old leaves under fluoride stress， respectively.

Keywords： Camellia sinensis， fluoride， reference genes， quantitative real-time PCR， gene expression

氟是自然界中廣泛存在的一種非金屬元素，也是人體必需的微量元素之一。適量攝入氟可以促進人體骨骼和牙齒的生長，有利于人體健康，而長期大量攝入氟，會造成氟中毒，出現氟斑牙和氟骨癥等[1]。茶樹（Camellia sinensis）是一種氟富集植物，對氟脅迫具有較高的耐受性[2]。茶樹的葉片是其積累氟的主要器官，新梢中的氟含量低于成熟葉，老葉中氟含量最高[3]。在自然生長環境中，雖然茶樹富集氟，但鮮有茶樹受到氟毒害的報道。在水培條件下，一定濃度的氟脅迫會影響茶葉中茶多酚、氨基酸、兒茶素、芳香化合物等物質的合成，不利于茶葉優良品質的形成；高濃度的氟脅迫會使茶樹生長受阻，甚至死亡[4-5]。茶樹富集氟受土壤環境、茶樹基因型等多種因素影響[6]，因此，有必要研究茶樹中參與氟代謝的功能及調控基因，全面了解茶樹對氟的吸收、轉運和富集的分子機制，針對性地提出茶樹降氟措施，進而提升茶葉飲用安全。

實時熒光定量PCR（Quantitative real-time PCR，qRT-PCR）具有靈敏度高、特異性強、重復性好等特點，已被廣泛應用于目標基因在轉錄水平的檢測和定量研究[7-9]，然而，qRT-PCR結果的準確性受RNA質量、引物的特異性、內參基因的穩定性等因素影響[10-11]。理想的內參基因應在各種條件下都能穩定的表達，但目前常見的內參基因在不同條件、不同物種、不同組織或不同發育階段的表達并非絕對穩定[12-15]。在研究某些特定條件下的基因表達時，內參基因選擇不合理會影響分析結果的準確性，因此有必要對所選內參基因的表達穩定性進行鑒定。

茶樹中常用的內參基因有肌動蛋白基因（CsACTIN）、轉錄延伸因子基因（CsEF-1α）、真核生物翻譯起始因子基因（CseIF-4α）、甘油醛-3-磷酸脫氫酶基因（CsGAPDH）、蛋白磷酸酶基因（CsPP2A）、TATA-box結合蛋白基因（CsTBP）、TIP41-like家族蛋白基因（CsTIP41）和泛素蛋白連接酶基因（CsUBC）[16-21]。已有研究表明，在茶樹不同組織中β-肌動蛋白基因（Csβ-actin）的表達較穩定，在不同成熟度茶樹葉片和愈傷組織中CsGAPDH基因的表達較穩定[22]；冷害、干旱、傷害和鹽脅迫下CsGAPDH在茶樹幼葉中的表達穩定性較好[23]；不同氮濃度和氮源處理下，CsGAPDH或Csβ-actin的表達穩定性較好，CsGAPDH和Csβ-actin組合的表達穩定性最好[24]。然而，尚未見有關氟脅迫條件下茶樹內參基因的報道。

本研究以課題組前期篩選得到的低氟茶樹品種福鼎大白茶和高氟茶樹品種金觀音為試驗材料，進行氟脅迫處理（0.42 mmol·L-1 NaF），系統分析不同處理時間點（0、1、3、7 d）茶樹新梢和老葉中的8個候選內參基因（CsACTIN、CsEF-1α、CseIF-4α、CsGAPDH、CsPP2A、CsTBP、CsTIP41和CsUBC）的表達穩定性，并利用氟輸出蛋白基因（CsFEX）驗證所選內參基因的穩定性，以期篩選出較優的內參基因，為進一步開展茶樹響應氟脅迫的分子生物學研究提供有益參考。

1 材料與方法

1.1 茶樹材料及處理

在本課題組對華中農業大學茶樹種質資源圃中203份茶樹材料氟含量評價的基礎上，選擇低氟茶樹品種福鼎大白茶（ICR-22965）和高氟茶樹品種金觀音（ICR-23027）作為供試材料。試驗所用茶苗為兩年生無性系扦插苗，于2021年10月購于福建省福安市利農茶苗專業合作社。茶苗用清水洗凈根部泥土后培養在華中農業大學南湖茶園溫室大棚[晝/夜溫度為24 ℃/20 ℃，14 h光照（200 μmol·m-2·s-1），10 h黑暗，相對濕度為70%]，利用茶樹營養液[25]進行培養，每隔7 d更換1次營養液，6個月后對其進行氟脅迫（0.42 mmol·L-1 NaF）處理[26]，分別在第0、1、3、7 d采摘新梢（一芽二葉）和老葉（圖1），液氮速凍后置于–70 ℃冰箱保存，用于RNA的提取。每個取樣點設置3個生物學重復，共計48個樣品。

1.2 總RNA的提取與第一鏈cDNA的合成

利用多糖多酚植物RNA提取試劑盒（華越洋，北京）提取茶樹各樣品的總RNA，使用Bioanalyzer 2100 System（Agilent，美國）檢測RNA的濃度、純度和完整性。利用PrimeScript? RT Reagent Kit with gDNA Eraser（Perfect Real Time）反轉錄試劑盒（TaKaRa，大連）將總RNA反轉錄為第一鏈cDNA，–20 ℃冰箱保存備用。

1.3 引物設計

根據茶樹中已報道的內參基因[17，20-21]及其他物種中常用的內參基因[27-28]，篩選出CsACTIN、CsEF-1α、CseIF-4α、CsGAPDH、CsPP2A、CsTBP、CsTIP41和CsUBC等8個候選內參基因。利用Primer PREMIER 5.0軟件設計各基因的特異性定量引物（表1）。利用PrimeSTAR GXL DNA Polymerase（TaKaRa，大連）擴增基因的目的片段，使用E.Z.N.A.? Gel Extraction Kit（OMEGA Bio-Tek，美國）回收產物，將其連接至pTOPO-Blunt Vector（艾德萊，北京）并轉化到大腸桿菌DH5α感受態細胞，挑取單克隆后進行測序，進一步確認目的產物的正確性。引物序列合成和PCR產物測序均委托北京擎科新業生物技術有限公司完成。引物擴增效率的計算參照張秋悅等[15]的方法。

1.4 qRT-PCR分析

參照Bestar? SybrGreen qPCR Mastermix（DBI Bioscience，上海）使用手冊，利用ABI Step One Plus? Real-Time PCR System（Applied Biosystems，美國）進行qRT-PCR分析。qRT-PCR反應體系：cDNA 1.0 μL，上下游引物（10 μmol·L-1）各0.4 μL，Bestar? SybrGreen qPCR Mastermix 10.0 μL，50× ROX Reference Dye 0.4 ?L，ddH2O 7.8 μL。qRT-PCR

反應程序：95 ℃預變性2 min；95 ℃變性10 s，60 ℃退火30 s，72 ℃延伸30 s，40個循環。每個反應設置3個技術重復。通過熔解曲線檢測產物特異性：從65 ℃緩慢升溫至95 ℃，每升溫1 ℃采集5次熒光信號。反應結束后，根據各候選內參基因的Ct值分析其在氟脅迫條件下茶樹新梢和老葉中的表達情況。

1.5 候選內參基因的表達穩定性評估

通過geNorm（version 3.4）[29]、NormFinder（version 20）[30]和BestKeeper（version 1）[31]統計軟件對候選內參基因的表達穩定性進行評價。

1.6 內參基因的穩定性驗證

為驗證篩選得到的最優內參基因組合的穩定性，利用不同的內參基因組合對目的基因CsFEX的表達量進行歸一化。利用算法[32]計算CsFEX的相對表達量。qRT-PCR反應體系和反應程序參照1.4章節。每個處理設置3個生物學重復。

2 結果與分析

2.1 內參基因引物的特異性

瓊脂糖凝膠電泳檢測結果顯示，8個候選內參基因的PCR擴增產物均為單一條帶，說明各候選基因的qRT-PCR引物滿足試驗基本要求（圖2A）。測序分析發現，擴增產物均為目的片段。熔解曲線分析顯示，各基因的熔解曲線峰值重合率較高且只有單一主峰（圖2B～圖2I），表明各候選內參基因引物的特異性較好，可用于后續的試驗。

2.2 候選內參基因的表達穩定性分析

2.2.1 候選內參基因的表達豐度

利用qRT-PCR分析了茶樹8個候選內參基因在氟脅迫條件下的表達豐度。結果表明，候選內參基因的Ct值分布在26.16～30.69，CsUBC的表達豐度較高，CsPP2A的表達豐度相對較低（圖3）。此外，Ct值的變化范圍可以反映基因的表達穩定性，Ct值的變化范圍越小，基因越穩定。由圖3可知，CsEF-1α、CsTBP和CsPP2A的表達穩定性較高。

2.2.2 內參基因的最佳數量

為確保qRT-PCR結果的準確性，有時需要使用2個或2個以上內參基因對目標基因的表達量進行校正。可利用geNorm計算標準因子配對變異值V來確定最適合內參基因的數量，其中，0.15被普遍接受為臨界值；當Vn/n+1＜0.15時，n個內參基因已達到校正目的基因表達量的要求；反之，則需使用n+1個內參基因進行校正。氟脅迫條件下，在茶樹新梢中，V4/5值（0.129）最先小于0.15，表明在研究氟脅迫條件下，茶樹新梢中最佳內參基因數是4個；在老葉中，V2/3值（0.113）小于0.15，表明最佳內參基因數是2個（圖4）。

2.2.3 候選內參基因的表達穩定性

利用geNorm、NormFinder和BestKeeper 3個數據分析軟件來分析氟脅迫條件下候選內參基因在茶樹新梢和老葉中的表達穩定性。geNorm軟件分析結果發現，8個內參基因的M值均低于1.5，表明它們均具有較好的穩定性。在新梢中，CsTBP和CsEF-1α表達穩定性最好，其次是CsACTIN和CsGAPDH；在老葉中，CsPP2A和CsGAPDH表達穩定性最好。NormFinder軟件分析發現，在新梢中，CsEF-1α、CsTIP41、CsACTIN和CsTBP表達穩定性較好；在老葉中CsTIP41和CsUBC表達穩定性較好。BestKeeper軟件分析顯示，8個內參基因的標準偏差均小于1，表明它們具有較好的表達穩定性。在新梢中，CseIF-4α、CsTIP41、CsEF-1α和CsTBP表達穩定性較好；在老葉中，CsUBC和CseIF-4α表達穩定性較好。可能是由于軟件對內參基因穩定性算法的不同，造成3種方法在穩定性評價結果上存在一定差異。綜合分析顯示，新梢中最佳內參基因組合為CsEF-1α、CsTIP41、CsTBP和CsACTIN，老葉中最佳內參基因組合為CsPP2A和CsUBC（表2）。

2.3 最適內參基因穩定性驗證

CsFEX通過外排氟離子調控茶樹對高濃度氟的耐受性，其表達量在高濃度氟條件下顯著升高[26]，因此本研究使用CsFEX來驗證所篩選得到的內參基因的可靠性。以穩定性較好的CsEF-1α、CsTIP41、CsTBP和CsACTIN作為

茶樹新梢內參基因，CsPP2A和CsUBC作為茶樹老葉內參基因，分析CsFEX在福鼎大白茶和金觀音新梢和老葉中的相對表達量。結果發現，CsFEX在兩個品種新梢和老葉中的表達趨勢一致，表達量都是先升高后降低，在第3天達到最高值（圖5），說明所篩選的內參基因組合可用于檢測氟脅迫條件下茶樹新梢和老葉中目的基因的表達量。

3 討論

近年來，qRT-PCR技術被廣泛應用于基因的表達分析，而內參基因選擇是否合理關系到qRT-PCR結果的準確性[33-35]。因此，研究特定試驗條件下基因的表達量變化時先對內參基因進行篩選具有一定的必要性。

研究發現，CsTBP和CsTIP41的表達量在茶樹葉片發育過程中比較穩定[12]。本研究中，CsTBP和CsTIP41在茶樹新梢中的表達穩定性較好，適合作為研究氟脅迫條件下茶樹新梢中基因表達的內參基因。GAPDH是較常用的內參基因之一，在杜梨葉片[15]、秋石斛花芽[28]、山茶不同組織或不同發育程度的花瓣中表達穩定性較好[36]；在茶樹的冷害、干旱、鹽脅迫及不同氮濃度和氮源處理下，CsGAPDH的表達也比較穩定[23-24]。本研究發現，8個候選內參基因中，CsGAPDH在茶樹新梢和老葉中的表達穩定性均不是最好，這說明氟脅迫條件下，CsGAPDH并不是最佳的內參基因。CsEF-1α和CsACTIN在茶樹新梢中的表達穩定性較好，在老葉中穩定性較差；而在茶樹老葉中表達比較穩定的CsPP2A和CsUBC在新梢中表達穩定性較差，這說明同一內參基因并非在所有的情況下都有較穩定的表達。孫美蓮等[22]研究發現，ACTIN和UBC等適合作為非生物脅迫研究中的內參基因。肌動蛋白是細胞器骨架的重要組成成分，可以通過減少ACTIN的表達，調節細胞周期，防止細胞凋亡，從而穩定細胞骨架[37]；UBC是泛素蛋白酶體途徑的重要組分，識別和清除非生物脅迫下產生的異常蛋白[38]。基于此，推測在氟脅迫條件下，為了減少脅迫損傷，植物體可能調動多種基因響應逆境脅迫，最終引起這些內參基因的表達量變化。綜上所述，在不同的植物組織和試驗條件下，內參基因的穩定性存在差異，應根據具體的試驗條件選擇較穩定的內參基因。

本研究使用geNorm、NormFinder和BestKeeper數據分析軟件，對候選內參基因進行穩定性分析。結果發現，在氟脅迫條件下，茶樹新梢中最優內參基因組合是CsEF-1α、CsTIP41、CsTBP和CsACTIN，老葉中最優內參基因組合是CsPP2A和CsUBC，這為后續開展氟脅迫條件下茶樹相關基因的研究奠定了基礎。

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