QoI類殺菌劑抗藥性機制和治理研究進展

周辰炎 劉慶 李金麗

(天津農學院園藝園林學院，天津 300392)

Quinone outside inhibitors(QoI)類殺菌劑作用于線粒體呼吸鏈復合物III，可以結合在內膜外壁的氧化位點Qo上，阻止復合物III中電子從細胞色素b(Cytochromeb，Cyt b)到細胞色素c1(Cyt c1)的傳遞，從而抑制病原真菌ATP的產生，使菌體缺乏能量而造成生理生化紊亂致死。QoI類殺菌劑是從天然產物嗜球果傘素A(Strobilurin A)衍生合成而來，是一類廣譜、高效、安全、促生的新型仿生型殺菌劑[1]。根據化學基團的不同，殺菌劑抗性行動委員會(FRAC)將QoI類殺菌劑分為9類，常用的有甲氧基丙烯酸酯類(如嘧菌酯Azoxystrobin，啶氧菌酯Picoxystrobin和唑菌酯Pyraoxystrobin)、甲氧基氨基甲酸酯類(如吡唑醚菌酯Pyraclostrobin)和氨基乙酸酯類(如醚菌酯Kresoxim-Methyl和肟菌酯Trifloxystrobin)等。根據是否存在交互抗性，QoI類殺菌劑被分為2個亞組，即代碼11組和11A組，目前除了甲萘威(Metyltetraprole)屬于11A組，其余均屬于11組。甲氧基丙烯酸酯類作為活性成分較高的第1大類，嘧菌酯則是第1代被開發的此類殺菌劑，該藥劑自1996年上市以來，截至目前在殺菌劑行業中依舊維持著不可撼動的銷量[2]。

盡管QoI類殺菌劑效果顯著，被廣泛應用于病原真菌，但隨之出現的抗藥性問題以及后續治理仍是不可避免的。由于其作用靶標位點單一，極易受病原物單基因或寡基因突變的影響，從而使病原物產生抗藥性，目前已被FRAC列入高等抗藥性風險。自1998年，德國北部報道了首例抗醚菌酯的小麥白粉病菌株，至今在全球范圍內已出現了大量QoI類殺菌劑抗藥性菌株[3]。早年間，我國殺菌劑不合理使用和抗性治理不完善等現象導致了此類殺菌劑的抗藥性風險比國外高[4]。此外，由于QoI類具有特殊的廣譜殺菌活性，世界上絕大多數作物或瓜果上的病原菌受到了影響，且對于同類殺菌劑的施用還會產生交互抗性而生成更加耐藥群體，故目前對于該靶標位點新藥的研發進程是一個巨大挑戰。本文重點在于闡述QoI類殺菌劑抗藥性機制和提出相應的抗性治理措施，從而為延緩病原菌抗藥性的產生，保障和提高農作物的品質和產量，新型藥劑的開發提供新思路。

1 QoI類殺菌劑的抗藥性機制

根據全球監測數據顯示，至今已存在多達36種的植物病原菌對QoI類殺菌劑呈現不同水平的抗藥性，由于施用嘧菌酯和吡唑醚菌酯而產生抗藥性的病原菌占多數[3]。

大量研究表明，病原菌對QoI類殺菌劑產生抗性的機制主要有3種：靶標位點突變，旁路氧化途徑和多重抗藥性相關蛋白的過表達，如圖1所示。相較于其他2種作用機制，靶標位點的突變具有遺傳性，在病原菌長期演化過程中占據主導地位，這也是抗藥性監測中最重要的1項依據指標。

注：(A)為運輸體蛋白對QoI殺菌劑分子的外排作用；(B)為靶標位點的突變導致結合位點與QoI類殺菌劑的親和力降低；(C)為AOX途徑。圖1 植物病原真菌對QoI類殺菌劑的抗性分子機制

1.1 靶標位點突變

已有報道顯示，QoI類殺菌劑的抗藥性主要與靶標線粒體復合體Ш細胞色素b基因高度保守區第1個區域(氨基酸位點125～155)的點突變有關，其中單點突變G143A和F129L導致的對應氨基酸的蛋白空間構象變化，從而降低了與藥劑的結合性是抗性產生的常見原因。研究表明，G143A突變會使復合體III Qo結合口袋變窄，從而降低與嘧菌酯的結合性，而F129L突變則干擾殺菌劑藥效基團與結合位點之間的作用力[6]。G143A是抗性菌株中普遍存在的1個突變位點，研究表明，G143A突變能夠賦予多種植物病原真菌高等水平抗性，并且多數情況下的G143A突變株具有遺傳穩定性，能夠發展為優勢種群。如，在田間突變體與敏感參考菌株有性雜交的灰霉(Botrytis cinerea)子囊孢子后代中，G143A類型的抗性基因可以母系穩定遺傳[7]；Wang等[8]通過連續傳代培養黃瓜黑星病菌(Corynespora cassiicola)發現，菌落直徑和孢子數量在G143A突變體中并沒有發生顯著變化。

根據近年來的QoI類殺菌劑的抗藥性監測結果顯示，多數的抗性突變體在Cyt b上存在多位點突變[9-17]，如表1所示。如，對嘧菌酯耐藥的稻瘟病菌(Magnaporthe oryzae)突變體中，G143S與G143A的突變比達8∶1；G143S、G137R和M296V 3個點突變賦予了M.oryzae對肟菌酯的抗性；小麥褐斑病(Pyrenophora tritici-repentis)種群中存在G143A、F129L和G137R的不同抗性水平的突變位點，在歐洲等地也監測到了這3種類型的突變位點[10]；在曲霉菌(Aspergillus uvarum)分離株監測到含有S108A、F129L和A194V 3個突變位點[13]。由此可見，隨著藥劑選擇壓的增加，病原菌產生的適應性變異使靶標位點突變的多樣性和可變性的趨勢更加明顯。

表1 QoI類殺菌劑抗藥性菌株在Cyt b上的突變類型

1.2 旁路氧化途徑

旁路氧化途徑(Alternative oxidase，AOX)也稱交替氧化途徑，普遍存在于多種高等植物、真菌、藻類和原生動物中。AOX途徑是除細胞色素途徑外，真菌和高等植物線粒體的另一呼吸電子傳遞鏈，以旁路氧化酶AOX為末端氧化酶。AOX途徑可直接接受輔酶Q傳來的電子傳遞到氧生成水，而不經過復合物Ⅲ和復合物Ⅳ 2個ATP能量合成位點，因而形成較少的ATP，從而導致真菌對殺菌劑的敏感性降低[5]。已有研究證實，AOX途徑編碼基因aox的表達水平參與調控真菌對一些殺菌劑的抗藥性，在常見病原真菌核盤菌屬(Sclerotinia spp.)和核果類褐腐病菌(Monilinia fructicola)中，田間或室內誘導抗性突變體均未發現靶標基因cytb的點突變[18，19]，故推測其抗藥性機制可能與AOX途經有關。

aox基因在不同植物病原真菌中的表達方式不同，aox過表達突變體一般僅出現在高等抗性水平分離株中[20]。當以cytb介導的呼吸途徑受阻或線粒體蛋白合成受抑制時，aox表達方式為誘導表達型，這是病原真菌對QoI類殺菌劑產生抗藥性的主要原因。有實驗研究表明，aox的誘導表達增強了小麥葉枯病菌(Septoria tritici)對嘧菌酯的抗藥性，嘧菌酯抗性突變體與敏感菌株相比具有較高的aox表達水平[21]；aox參與調控核盤菌(S.sclerotiorum)對啶氧菌酯的敏感性[18]；在稻瘟病菌(Magnaporthe grisea)和灰葡萄孢(B.cinerea)中aox基因敲除突變體降低了對嘧菌酯的抗藥性[22，23]。此外，AOX途徑對Cyt途徑抑制劑氰化物不敏感，但對氧肟酸化合物敏感[5]，水楊羥肟酸(Salicylhydroxamic acid，SHAM)就是常用的一種AOX抑制劑，所以，SHAM在阻斷病原菌的AOX途徑，協同增強以復合物III為靶標殺菌劑的防治效果中起重要作用。

1.3 多重抗藥性

多重抗藥性(Multipledrug resistance，MDR)是指病原物在藥劑選擇作用下，產生了對多種類型作用機制藥劑具有抗性的群體，導致對許多藥劑產生敏感性下降的系列問題。細胞內藥物外排活性的增強導致了多重抗藥性的產生，該活動的載體蛋白主要為ABC運輸體蛋白(ATP-binding cassette)和MFS運輸體蛋白(Major facilitator superfamily)。ABC蛋白和MFS蛋白普遍存在于所有生物體中，ABC運輸體蛋白是真菌細胞膜上的膜轉運蛋白，通過結合并水解ATP產生的能量將藥物分子外排出胞內，與ABC蛋白不同的是MFS蛋白通過質子驅動力將藥物外排出真菌體內[24]。

關于多重抗藥性的報道常見于灰霉菌株(B. cinerea)中，灰霉病是我國作物常見真菌病害，因常年受到多種藥劑施加處理從而產生多重抗藥性。灰霉菌具有3個ABC運輸體蛋白(BcatrB、BcatrD、BcatrK)和2個MFS運輸體蛋白(Bcmfs1、BcmfsM2)，這些運輸體蛋白已被證明，是室內或野外突變體中產生MDR的決定因素。Pierre等[25]從法國和德國葡萄園中采集到的MDR灰霉菌菌株中檢測到了BcatrB和BcmfsM2的表達，并發現MDR灰霉菌株對大多數殺菌劑均具有一定抗藥性，如BcatrB過表達菌株對醚菌胺、吡唑醚菌酯和肟菌酯具有抗性，而BcmfsM2過表達菌株對吡唑醚菌酯和肟菌酯具有抗性，并推測種群內頻繁的基因重組可能是產生多重抗藥性的主要原因之一。

2 QoI殺菌劑抗藥性治理

殺菌劑抗藥性治理的實質是以科學的手段最大限度地阻止或延緩抗性群體的形成與發展。基本原則以預防為主，在綜合防治中輪換或交替用藥。目的是使具有抗藥性風險的殺菌劑使用壽命延長，降低抗性種群出現的風險，使敏感種群在病原菌群體中一直處于優勢地位，當下一個種植循環中再次使用具有抗藥性風險的殺菌劑時，這些殺菌劑仍然具有較好的防治效果。本文結合QoI類殺菌劑的特點，主要介紹3種抗性治理方法降低該類殺菌劑的抗藥性風險。

2.1 抗藥性快速監測方法

關注病原菌對QoI類殺菌劑的敏感性動態，加強殺菌劑抗藥性菌株的田間監測力度，以便于進一步掌握抗性菌株適合度變化程度，解析其抗藥性機制，從而對植物病害的合理防控，延緩該類殺菌劑使用壽命及新型藥劑創制具有重要基礎意義。

基于QoI類殺菌劑的抗藥性機制，目前針對靶標位點的突變類型已建立了快速、高效、靈敏的檢測方法，可有效驗證cytb基因的單核苷酸多態性(Single nucleotide polymorphism，SNPs)，如數字液滴法PCR(Digital Droplet PCR)可用于快速檢驗的常規定量突變，該方法具靈敏性和準確性，對于早期田間抗性菌株的監測十分重要。根據cytb基因突變轉換或顛換類型的不同而建立精準高效的監測體系，快速環介導等溫擴增(LAMP)技術能夠快速檢測從而識別突變類型。分子對接(Molecular docking)也是一種快速檢測QoI類殺菌劑抗性的方法，該方法可用于判定cytb亞基中蛋白構象改變程度和結合模式[10]，如在稻瘟病菌(M.grisea)抗性突變體中，預測到G143S突變減弱了氫鍵的相互作用，而G137R和M296V改變了肟菌酯分子在Cyt b結合口袋中的構象[12]。在未來，高通量測序或分子檢測技術是抗藥性快速檢測的主要發展方向之一。

2.2 QoI類殺菌劑的合理使用

要關注作物在病害發生前后的概況，做好預測預報，制定綜合防治策略，一般推薦在病害發生前使用保護性殺菌劑，在病害發生后使用治療性殺菌劑，從而減少化學用藥過程中病害抗性突變體的產生。針對農作物的種類和殺菌劑的不同類型，做出相應治理措施。有關殺菌劑的合理使用，提出2點建議。

2.2.1 使用多位點殺菌劑的共制劑或交替施用不同類型殺菌劑

雖然藥劑混用無法從根本上阻止殺菌劑抗藥性的產生，但是可以降低殺菌劑抗藥性選擇的壓力，從而延長殺菌劑的使用壽命。同時，由于QoI類殺菌劑易產生抗藥性，因而復配制劑中另一成分應選用不易產生抗性的藥物來延長QoI類農藥的生命期，或者選取不存在交互抗性的藥劑交替使用，從而延緩抗藥性的產生。

2.2.2 殺菌劑與助劑或生物制劑的復配，可優化殺菌劑劑型、構型和效果

目前許多研究用于開發農藥助劑，這類助劑大多基于緩釋劑或控釋劑構造，能夠有效協助殺菌劑進入病原真菌細胞內，從而從原藥總量上減少藥物分子的施用，同時能夠提供植物所需的微量元素營養。Shan的研究中，鐵基多孔金屬有機框架(Metal-organic frameworks，MOFs)作為控制殺菌劑釋放的載體，搭載了嘧菌酯的MOFs對小麥赤霉病(Fusarium graminearum)和番茄晚疫病(Phytophthora infestans)表現出良好的殺菌活性[26]；CuZn和ZnO無機納米顆粒(Inorganic nanoparticles，INPs)可加工為納米殺菌劑用來防治灰霉菌(B.cinerea)和核盤菌(S.sclerotiorum)，對施藥后的植物保護作用和藥劑易位有顯著影響[27]。使用天然化合物對植物病原真菌進行化學增敏是降低殺菌劑抗性風險和殺菌劑其他負面影響的最具前景的手段之一，近年來研究較多的生防菌有青霉屬(Penicillium spp.)、擬青霉屬(Purpureocillium spp.)、木霉屬(Trichoderma spp.)、枯草芽孢桿菌(Bacillus subtilis)等。畢秋艷等研究顯示，枯草芽孢桿菌HMB20428與嘧菌酯有協同增效作用，增強了葡萄霜霉病(Plasmopara viticola)的防治效果[28]；橘青霉(Penicillium citrinum)的次生代謝產物能夠增強白粉病菌(Parastagonospora nodorum)對嘧菌酯的敏感性[29]。此外，為提高殺菌劑利用率和防效，應當優化藥劑劑型和構型，針對不同作物在不同環境條件下選用對應的農藥劑型，如粉劑(DP)、可濕性粉劑(WP)、懸浮劑(SC)等，且對施藥器材應進行科學校正，防止大面積噴施時產生的藥劑漂移等情況。

2.3 發展抗性治理新策略

由于不同作用機制的殺菌劑資源十分有限，近年來新靶標殺菌劑的開發和上市率逐漸下降等問題[5]，進一步加劇了現有殺菌劑的使用壽命和抗性治理方面的挑戰。因此，新藥的開發與選擇，及延緩現有殺菌劑的使用壽命仍是抗性治理的關鍵。

丁香菌酯(Coumoxystrobin)和氯啶菌酯(Triclopyricarb)由我國沈陽化工研究院研發，于2016年在我國登記使用，是近年來取得顯著效果的新型QoI類殺菌劑，都位于代碼11組。根據FRAC評定的相同組別中的殺菌劑具有直接的交互抗性的特點，丁香菌酯和氯啶菌酯在擁有良好殺菌活性的同時，仍具有中、高抗藥性風險，需合理使用。由于QoI類殺菌劑的另一亞組11A與11組之間無交互抗性，這是一個重要的抗藥性治理依據，為新構型化合物的篩選提供了有力思路。四唑啉酮類的甲萘威正是目前獨屬于11A的新型殺菌劑，其關鍵結構對于QoI類抗性突變體仍然具有高的抑制活性，并且尚未增加G143A抗性分離株的比例[30]，未來可根據甲萘威的活性結構和制備路線，研發篩選出其他具有良好殺菌活性且無交互抗性的QoI類殺菌劑。

研發與利用具有負交互抗性的殺菌劑也是抗性治理的新策略。當前對QoI類產生負交互抗性的特殊殺菌劑有醌外Qi位點抑制劑(QiIs)。吡啶酰胺類化合物Fenpicoxamid和Florylpicoxamid是近年來研發的新型QiI類殺菌劑，這類殺菌劑以線粒體呼吸鏈復合物III的醌還原位點Qi位點為靶標，同樣可阻止復合物III中電子從Cyt b傳遞到Cyt c1，使用該類殺菌劑可以延緩病原體對QoI類抗藥性的出現。因此，探索其他殺菌劑與QoI類之間的負交互抗性，以彌補QoI類殺菌劑在抗性菌株中的良好防治作用，也是一個有力的抗性治理思路。

此外，針對不同病原菌和植株的相互作用，加快培育抗病、耐病植株進程仍是可持續農業生產與發展的必要策略。

3 結論與展望

QoI類殺菌劑是防治植物真菌性病害中常用的殺菌劑，目前多種作物或瓜果蔬菜上的病原菌已對其產生抗藥性，因此，了解病原真菌對殺菌劑的抗性機制是做好抗藥性監測和抗藥性治理的前提。相關研究發現，植物病原真菌對QoI類殺菌劑產生抗性的機制主要是靶標位點突變、旁路氧化酶作用和多重抗藥性蛋白過表達。抗性突變菌株在靶標位點即細胞色素b基因的Qo位點上常具有G143A、F129L以及其他基因突變類型，現已向多位點突變和突變多樣性的趨勢發展；旁路氧化酶是抗性菌株繞開細胞色素b途徑而進行呼吸鏈中能量傳遞的重要酶，表達方式常為誘導表達；多重抗藥性的產生一般是指在多種類型殺菌劑的選擇壓下，病原真菌將過表達產生相應的運輸體蛋白，從而將藥劑排出細胞內使其免受大部分殺菌劑的干擾。基于近年來抗性種群發展速率的不斷提升，提前做好病蟲害的預測預報分析，施用高效安全綠色的藥劑仍是農作物病害大規模發生的阻斷環節。采取綜合防治措施，科學合理精準用藥，培育抗性植株和持續開發新型靶標藥物是當前抗藥性治理的根本策略。結合綠色智慧農業，拓寬田間抗性監測技術，建立健全種植體系，帶動高素質農戶進行科普實踐也是發展農業現代化的關鍵一環。