綿羊去甲基化酶FTO基因的生物信息學分析

孟金柱 楊顯剛 趙園園

(銅仁學院貴州省梵凈山地區(qū)生物多樣性保護與利用重點實驗室，貴州 銅仁 554300)

脂肪肥胖相關基因(Fatmassandobesity-associatedprotein，F(xiàn)TO)最初作為人類肥胖相關基因被發(fā)現(xiàn)，編碼的FTO蛋白屬于雙加氧酶家族，其酶活性依賴于二價鐵離子和2-氧葡萄糖酸酯[1]。在酶學上，F(xiàn)TO是真核細胞中的RNAN6-甲基腺苷(m6A)去甲基化酶[2]。m6A可以調(diào)節(jié)一些細胞過程，包括可變剪接、mRNA穩(wěn)定性、加工、翻譯、運輸、降解和基因調(diào)控等[3-6]。m6A失衡與各種人類疾病有關，如肥胖、糖尿病、心力衰竭、腦部疾病和各種癌癥[7-9]。此外，F(xiàn)TO還影響精原細胞增殖、肌纖維分化、細菌抗性等[10-12]。

近年來，人們陸續(xù)完成了牦牛、豬、驢、山羊等物種的FTO基因的克隆，并發(fā)現(xiàn)FTO基因可能參與畜禽的脂肪沉積、卵母細胞成熟、熱應激、肌肉發(fā)生等生物學過程[13-22]。為探究綿羊FTO基因的結(jié)構及功能，本研究利用RNA-seq獲取的FTO基因序列，采用生物信息學方法，分析FTO基因序列、蛋白理化性質(zhì)、信號肽、跨膜結(jié)構、二、三級結(jié)構、亞細胞定位及與其他蛋白相互作用網(wǎng)絡等，為進一步探討FTO的功能奠定理論基礎。

1 材料與方法

1.1 高通量測序及序列獲取

本課題組前期進行了不同毛色綿羊皮膚的轉(zhuǎn)錄組測序并已發(fā)表相關論文[23]，本研究所用綿羊FTO基因序列由高通量測序結(jié)果中獲取。

1.2 綿羊FTO基因的生物信息學分析

序列通過生物信息學軟件進行分析，具體軟件或工具如表1所示。

表1 綿羊FTO核苷酸和蛋白質(zhì)序列分析軟件

2 結(jié)果

2.1 綿羊FTO基因進化樹

高通量測序共檢測到3個FTO基因的轉(zhuǎn)錄本，分別包含3個、9個、11個外顯子，最長的轉(zhuǎn)錄本CDS區(qū)為1518bp，與NCBI登錄的綿羊FTO基因(NM_ 001104931.1)序列相似性為100%。利用MEGA11.0與GenBank數(shù)據(jù)庫中8個物種的核苷酸序列進行比對并構建進化樹，發(fā)現(xiàn)綿羊FTO基因與山羊的親緣關系最近，其次是羚羊、彎角劍羚，隨后與亞洲水牛、瘤牛、美洲草原野牛、牦牛聚類到一起，再與加拿大馬鹿聚類，與河馬的親緣關系最遠，同時綿羊FTO基因在各物種間具有較高的保守性。

圖1 不同物種FTO基因核苷酸序列構建的系統(tǒng)進化樹

2.2 綿羊FTO蛋白理化性質(zhì)預測

NCBI Open Reading Frame Finder預測綿羊FTO基因CDS區(qū)的開放閱讀框，結(jié)果顯示，F(xiàn)TO基因共編碼505個氨基酸，見圖2，其中亮氨酸(Leu)含量最多(11.1%)，谷氨酸(Glu)含量次之(10.3%)，組氨酸(His)含量最少(2.6%)；肽鏈N端為蛋氨酸(Met)；帶正電荷的氨基酸(Arg+Lys)殘基數(shù)量共60個，帶負電荷的氨基酸(Asp+Glu)殘基數(shù)量共79個，見表2。使用在線工具Expasy-ProtParam預測綿羊FTO蛋白理化性質(zhì)，F(xiàn)TO蛋白分子式C2609H4053N709O771S27，蛋白質(zhì)分子的質(zhì)量為58553.79，由8169個原子構成，理論等電點(isoelectric point，pI)為5.28，<7，表明蛋白為酸性物質(zhì)；半衰期為30h。不穩(wěn)定指數(shù)為51.24，>40，說明該蛋白結(jié)構不穩(wěn)定。親水性平均值(grand average of hydropathicity，GRAVY)為-0.523<0，脂溶指數(shù)為80.71。使用Expasy-ProtScale得到結(jié)果推測FTO蛋白在12位點處存在最小親水指數(shù)-3.222，在438位點存在最大親水指數(shù)2.000，疏水性平均值-0.523，見圖3，表明綿羊FTO蛋白屬于親水性蛋白。

圖3 綿羊FTO蛋白親/疏水性預測

表2 綿羊FTO蛋白的氨基酸組成及數(shù)量

2.3 綿羊FTO蛋白信號肽及跨膜結(jié)構域

使用Signaip-4.1進行綿羊FTO蛋白質(zhì)的信號肽預測，發(fā)現(xiàn)該蛋白無信號肽序列，表明FTO蛋白質(zhì)不具有信號肽結(jié)構。使用TMHMMServerv.2.0分析跨膜結(jié)構域，結(jié)果顯示，F(xiàn)TO蛋白不存在跨膜序列，見圖4，推測FTO蛋白不是膜蛋白或分泌蛋白。

圖4 綿羊FTO蛋白信號肽及跨膜結(jié)構域預測

2.4 綿羊FTO基因亞細胞定位

使用WoLFPSORT預測綿羊FTO的亞細胞定位，結(jié)果顯示FTO主要分布在細胞外基質(zhì)中，其次是質(zhì)膜、細胞核和溶酶體，見表3。

表3 綿羊FTO蛋白亞細胞定位

2.5 綿羊FTO蛋白二、三級結(jié)構

使用SOPMA和SWISSMODEL分別進行綿羊FTO蛋白二、三級結(jié)構預測，結(jié)果表明，該多肽鏈中含有43.17%α螺旋、38.61%無規(guī)則卷曲、11.49%延伸鏈和6.73%β折疊，見圖5。三級結(jié)構也顯示綿羊FTO蛋白以α螺旋和無規(guī)則卷曲為主。

注：h為α-螺旋；t為β-轉(zhuǎn)角；c為無規(guī)則卷曲；e為延伸鏈。

2.6 綿羊FTO互作蛋白網(wǎng)絡圖

通過在線工具STRING在置信度為90%的條件下構建綿羊FTO互作蛋白網(wǎng)絡圖，結(jié)果表明，F(xiàn)TO與FOXO1、CREB1、ALKBH8、ALKBH5、YTHDF1、YTHDF3、YTHDF2、METTL14、WTAP、METTL3等10個蛋白互相緊密聯(lián)系，可能存在互作，見圖6。

圖6 綿羊FTO蛋白互作網(wǎng)絡圖

3 討論與結(jié)論

FTO基因除可直接調(diào)控脂肪合成和分解相關基因進而促使脂肪沉積量外，還能通過調(diào)控RNA m6A水平進而參與各種生物學過程的調(diào)控[19-22]。本研究顯示，綿羊的FTO基因編碼區(qū)為1518bp，編碼505個氨基酸，其中蛋白亮氨酸(Leu)含量最多(11.1%)，為酸性親水性蛋白，帶負電，結(jié)構不穩(wěn)定，與灘羊[13]、牦牛[14]、廣靈驢[15]、陸川豬[16]、山羊[17]一致。綿羊的FTO蛋白不存在信號肽、跨膜結(jié)構，與山羊[17]、牦牛[14]、廣靈驢[15]一致，而灘羊[13]FTO蛋白在第33～34氨基酸殘基處具有信號肽，表明綿羊在導向、分泌和參與蛋白質(zhì)折疊等功能與灘羊具有差異，但在信號傳遞和物質(zhì)轉(zhuǎn)運能力上相同。綿羊的FTO蛋白主要分布于細胞外基質(zhì)中，而廣靈驢FTO蛋白也主要分布于膜外[15]。將綿羊FTO蛋白二級結(jié)構中α螺旋含量最多，其次是無規(guī)則卷曲、延伸連和β折疊，灘羊、牦牛[27]、廣靈驢[28]也呈現(xiàn)出類似的結(jié)構，但山羊[17]FTO蛋白以無規(guī)則卷曲和α-螺旋最多，其次是β折疊，無延長鏈。雖然山羊與其他動物的二級結(jié)構稍有差異，但都以α-螺旋和無規(guī)則卷曲為主，占到80%以上，這也表明FTO蛋白結(jié)構不穩(wěn)定。

蛋白互作網(wǎng)絡圖顯示，綿羊FTO蛋白共與10種蛋白(FOXO1、CREB1、ALKBH8、ALKBH5、YTHDF1、YTHDF2、YTHDF3、METTL14、WTAP、METTL3)具有互作關系，已有研究表明，F(xiàn)TO可能與FOXO1相互作用參與非酒精性脂肪肝的發(fā)病過程[23]。FOXO1作為叉頭轉(zhuǎn)錄家族O亞族成員，參與癌癥、自噬、氧化應激及物質(zhì)代謝等多種生物學過程[24]。這暗示FTO可能通過與FOXO1相互作用參與廣泛的生物學過程。CREB參與了神經(jīng)干細胞的增殖、細胞周期調(diào)控、神經(jīng)元誘導分化、學習記憶等正常生理活動[25]，推測FTO可能通過與CREB互作調(diào)控多個生理活動。ALKBH5和ALKBH8屬于ALKB核酸脫甲基酶家族成員，對細胞核mRNA進行去甲基化修飾[26]。YTHDF1/2/3作為mRNAm6A修飾的閱讀蛋白參與RNA甲基化調(diào)控，而METTL3、WTAP和METTL14組成復合物催化m6A甲基化產(chǎn)生[27]。因此，F(xiàn)TO可能與其他RNA甲基化相關酶共同調(diào)節(jié)RNA的m6A水平。

總之，綿羊FTO基因與其他哺乳動物的相似性高，具有高度保守性，綿羊FTO蛋白由505個氨基酸組成，酸性，結(jié)構不穩(wěn)定，屬親水性非分泌蛋白，無信號肽和跨膜結(jié)構，主要與RNA甲基化相關酶互作，為深入研究綿羊FTO基因功能提供了理論基礎。