十溴聯苯醚灌胃后小鼠宮頸癌皮下移植瘤組織腫瘤相關成纖維細胞標志基因表達變化及其意義

陳楠，李榕，祖尼熱·吐爾遜，劉早玲

新疆醫科大學公共衛生學院，烏魯木齊 830000

多溴聯苯醚（PBDEs）是一種常作為阻燃劑添加到塑料、電子產品、紡織品中的環境內分泌干擾物（EDCs），可誘導上皮—間質轉化、內質網應激、氧化應激等，從而促進腫瘤進展［1］。十溴聯苯醚（BDE-209）是PBDEs同系物中的一員，曾因性能優越而被廣泛量產，可在多種情況下發生脫溴反應轉化為毒性更高的低溴代聯苯醚，已被證實有生殖毒性和致癌性［2-4］。但目前尚缺乏BDE-209對宮頸癌實體瘤組織影響的相關研究。宮頸癌組織由腫瘤細胞及其所在的免疫和基質環境組成，稱為腫瘤微環境（TME）。TME是一種酸性、缺氧和免疫抑制的生物環境，腫瘤相關成纖維細胞（CAFs）是TME基質細胞的主要組成部分，不僅來源廣泛（如通過上皮—間質轉化、骨髓間充質干細胞等分化為CAFs），還可通過分泌免疫調節分子、與免疫細胞相互作用和重塑細胞外基質（ECM）等，促進腫瘤細胞增殖和免疫逃逸，對腫瘤的發生發展至關重要［5-6］。2022年3月—2023年12月，本研究通過皮下注射宮頸癌U14細胞建立小鼠宮頸癌皮下移植瘤模型，并以不同劑量BDE-209進行經口灌胃干預，篩選宮頸癌皮下移植瘤組織CAFs標志差異表達基因，旨在探討BDE-209暴露對宮頸癌腫瘤微環境中CAFs的影響，為深入探討BDE-209對宮頸癌的致癌作用提供參考依據。現報告如下。

1 材料與方法

1.1 材料 實驗動物：SPF級雌性C57BL/6小鼠40只，4～6周齡，體質量14～16 g，購自新疆醫科大學北校區動物實驗中心。細胞：宮頸癌U14細胞購自上海賽百慷生物技術股份有限公司，使用DMEM高糖完全培養基（含10%胎牛血清，1%雙抗），置于37 ℃、5% CO2培養箱中培養。主要試劑：BDE-209購自上海源葉生物科技有限公司，TransZol Up Plus RNA Kit購自北京全式金生物技術有限公司，Prime-ScriptTMRT reagent Kit、TB Green?Premix Ex TaqTMⅡ購自日本TaKaRa公司。主要儀器：HC-3018R高速冷凍離心機購自安徽中科中佳科學儀器有限公司，恒溫培養箱購自上海雙旭電子有限公司，單道手動移液器購自德國Eppendorf公司，熒光定量PCR儀購自美國Thermo Fisher公司。

1.2 小鼠宮頸癌皮下移植瘤模型建立及BDE-209灌胃處理 取對數生長期的宮頸癌U14細胞，以生理鹽水制成細胞懸液，調整細胞密度為2 × 107/mL。40只雌性C57BL/6小鼠適應性喂養1周，隨機分為對照組、BDE-209低劑量組、BDE-209中劑量組、BDE-209高劑量組，每組10只。各組小鼠均于右前腋下接種宮頸癌U14細胞懸液0.1 mL，接種后每日觀察皮下腫瘤生長情況，接種第5天右前腋下有米粒大小腫瘤提示成功建立小鼠宮頸癌皮下移植瘤模型。將BDE-209粉末溶解于玉米油中，BDE-209低劑量組、BDE-209中劑量組、BDE-209高劑量組小鼠建模成功后分別經口灌胃給予20、100、500 mg/kg BDE-209，對照組給予等體積玉米油，連續21 d。

1.3 移植瘤組織差異表達基因篩選 各組灌胃結束后，次日采用頸椎脫臼法處死，完整剝離皮下移植瘤，立即放入液氮中冷凍保存。對移植瘤組織進行轉錄組測序，每組3個樣本。轉錄組測序由北京諾禾致源科技股份有限公司完成操作，包括RNA提取及質量檢測、基因文庫構建、上機測序及數據質量評估等。以對照組為參照，使用R4.2.1軟件的Deseq2 R包分析轉錄組測序數據，以Padj ＜ 0.05、|logFC| ≥ 1為標準，篩選與對照組相比BDE-209高、中、低劑量組的差異表達基因。

1.4 CAFs標志差異表達基因篩選 通過查閱文獻得到小鼠CAFs標志基因［7-9］，使用VennDiagram R包將CAFs標志基因與“1.3”得到的BDE-209高、中、低劑量組差異表達基因取交集，獲得CAFs標志差異表達基因，并通過Heatmap R包將其在各樣本中的表達情況進行可視化。

1.5 CAFs標志差異表達基因相關功能及通路分析 將CAFs標志差異表達基因上傳至Metascape在線網站（https：//metascape.org/gp/index.html#/main/step1），進行基因本體論（GO）功能和基因組百科全書（KEGG）通路富集分析。

1.6 CAFs標志差異核心基因篩選 利用String數據庫（https：//cn.string-db.org/）構建CAFs標志差異表達基因的蛋白質相互作用網絡（PPI）圖，使用Cytoscape軟件（版本v3.9.0）的cytoNCA插件，采用Betweenness算法確定排名前十的CAFs標志差異表達基因，并進行可視化，即為CAFs標志差異核心基因。

1.7 移植瘤組織CAFs標志差異核心基因檢測 采用實時熒光定量PCR法。取BDE-209高劑量組與對照組小鼠的部分移植瘤組織各5例份，TransZol Up Plus RNA Kit試劑盒提取組織總RNA，Prime-ScriptTMRT reagent Kit逆轉錄試劑盒說明書將其逆轉錄為cDNA，TB Green?Premix Ex TaqTMⅡ試劑進行聚合酶鏈式反應。PCR反應條件：95 ℃、30 s，95 ℃、5 s，60 ℃、34 s，95 ℃、15 s，60 ℃、1 min，95 ℃、15 s（40個循環），每個樣本重復3次。采用2-ΔΔCt法計算目的基因相對表達量。

1.8 統計學方法 采用SPSS26.0統計軟件。計量資料采用S-W法檢驗正態性，呈正態分布以±s表示，多組間比較采用方差分析，兩組間比較采用兩獨立樣本t檢驗，重復測量數據采用重復測量的方差分析；非正態分布以M（P25，P75）表示，兩組間比較采用Wilcoxon秩和檢驗。P＜0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 各組小鼠移植瘤組織差異表達基因篩選結果 BDE-209高、中、低劑量組與對照組比較分別有957、24、14個差異基因，其中上調基因分別為816、21、7個，下調基因分別為141、3、7個。因BDE-209中、低劑量組與對照組間差異基因較少，故使用BDE-209高劑量組與對照組間的957個差異基因用于后續分析。

2.2 CAFs標志差異表達基因篩選結果 將122個CAFs標志基因與957個BDE-209高劑量組差異表達基因取交集，得到CAFs標志差異表達基因30個（OSID碼圖1），其中BDE-209干預后上調29個、下調1個（OSID碼圖2）。

2.3 CAFs標志差異表達基因富集分析結果 GO功能富集分析結果顯示，CAFs標志差異基因主要富集在ECM、生殖結構發育、PI3K/Akt信號轉導、對活性氧的反應等，見OSID碼圖3。KEGG通路富集分析結果顯示，CAFs標志差異基因主要富集在補體和凝血級聯反應、腫瘤發病途徑、蛋白質消化吸收、流體剪切應力與動脈粥樣硬化及腫瘤中的蛋白聚糖等代謝通路，見OSID碼圖4。

2.4 CAFs標志差異核心基因篩選結果 CAFs標志差異基因的PPI圖包含30個節點和70條邊，見OSID碼圖5。Betweenness算法篩選出排名前十的CAFs標志差異核心基因分別為核心蛋白聚糖（Dcn）、細胞間黏附分子1（Icam1）、C-X-C基序趨化因子配體12（Cxcl12）、基質金屬蛋白酶2（MMP-2）、血小板衍生生長因子受體（Pdgfrb）、Ⅴ型膠原蛋白α2（Col5a2）、補體成分1的子成分1（C1s1）、肝細胞生長因子（Hgf）、補體成分3（C3）、纖溶酶原激活物（Plat），其Betweenness得分分別為123.01、102.73、88.56、65.45、64.33、58.76、47.25、39.71、13.77、12.88分，見OSID碼圖6。

2.5 BDE-209高劑量組與對照組小鼠移植瘤組織CAFs標志差異核心基因表達比較 與對照組比較，BDE-209高劑量組小鼠癌組織Dcn、Icam1、Cxcl12、MMP-2、Pdgfrb、Col5a2、C1s1、Hgf、C3、Plat mRNA相對表達量均升高（P均＜0.05），Pdgfrb mRNA相對表達量無明顯變化（P＞0.05）。見表1。

表1 BDE-209高劑量組與對照組小鼠移植瘤組織10個CAFs標志差異核心基因表達比較［-x ± s/M（P25，P75）］

3 討論

宮頸癌的發生發展是由人乳頭瘤病毒（HPV）持續感染、遺傳因素、個人生活習慣、環境因素等共同導致的，近年來EDCs對宮頸癌的影響逐漸引起關注［10］。EDCs是一類能擾亂機體內分泌系統的外源性化學物，可通過干擾多種激素的分泌而引發生殖毒性和誘導多種腫瘤發生［11-13］。BDE-209是一種EDCs，作為添加型溴化阻燃劑被廣泛應用，其不與塑料或其他產品形成化學鍵，易在產品生產、使用或回收過程中釋放到環境中，且具有環境持久性和體內蓄積性等特點，故可在于人體多種組織（血清、頭發、糞便等）中被檢測到［14-15］。研究表明，BDE-209參與調控人類乳腺癌、卵巢癌和宮頸癌細胞的增殖和凋亡［4］。本課題組前期通過HE染色觀察到，BDE-209高劑量組的宮頸癌皮下移植瘤腫瘤細胞大小形態嚴重不一，部分區域出現壞死，可見BDE-209暴露會影響宮頸癌的腫瘤組織病理改變；進一步探究BDE-209對宮頸癌TME的影響時發現CAFs亦發生了變化。CAFs作為TME中的重要組成成分，可通過影響ECM、與免疫細胞相互作用等多種途徑促進腫瘤細胞遷移、侵襲。因此，闡明BDE-209對CAFs的影響可為研究其致癌作用提供依據。

本研究對BDE-209干預后的宮頸癌皮下移植瘤組織進行轉錄組測序分析，篩選出BDE-209高劑量組與對照組間的差異基因，并通過查閱文獻獲得小鼠CAFs的標志基因，取交集后得到BDE-209灌胃后發生改變的CAFs標志差異表達基因，其中29個基因上調、1個基因下調；GO功能和KEGG通路富集分析結果表明，CAFs標志差異基因主要集中在ECM、生殖結構發育、PI3K/Akt信號轉導、補體和凝血級聯反應、腫瘤發病途徑等通路。ECM是防止腫瘤遷移侵襲的有效屏障，當腫瘤細胞穿透ECM的基底膜后會向外侵襲轉移，導致原位癌發展為浸潤癌。CAFs不僅可以分泌基質金屬蛋白酶（MMPs）降解ECM，還可以分泌ECM成分層粘連蛋白1，導致ECM重塑，從而促進宮頸癌細胞遷移侵襲［16］。PI3K/Akt信號通路是導致多種疾病發展的經典信號通路，該通路異常激活可影響腫瘤血管生成、調控細胞存活、促進轉移等。研究發現，相較于正常成纖維細胞，CAFs能通過激活PI3K/Akt信號通路促進肺癌遷移侵襲［17］；同時被激活的PI3K/Akt信號通路亦能活化CAFs，促進細胞前轉移性細胞因子分泌和ECM相關成分在CAFs中的表達［18］。以上結果表明，BDE-209暴露可影響宮頸癌CAFs標志基因表達，這些標志基因改變可能通過重塑ECM及激活PI3K/Akt信號通路等途徑促進宮頸癌進展。

本研究通過實時熒光定量PCR檢測對CAFs標志差異核心基因的mRNA表達情況進行驗證，結果顯示與轉錄組測序的趨勢基本一致。研究顯示，CAFs在多種腫瘤組織中可通過分泌轉化生長因子β（TGF-β）、白細胞介素6（IL-6）等細胞因子，上調MMP-2表達，從而促進腫瘤轉移和ECM重塑［19］。TME中的補體系統不僅參與先天免疫，還參與促進腫瘤進展，C3是補體激活的核心成分，可通過C3a/C3aR信號通路調控乳腺癌CAFs功能，本研究中BDE-209干預后的宮頸癌上皮移植瘤組織C3表達亦上調。

綜上所述，BDE-209灌胃會導致小鼠宮頸癌移植瘤組織CAFs相關標志基因Dcn、Icam1、Cxcl12、MMP-2、Col5a2、C1s1、Hgf、C3、Plat表達升高，其機制可能與誘導CAFs的ECM改變和激活PI3K/Akt信號通路有關。