不同溫度單增李斯特菌和金黃色葡萄球菌混合培養生物被膜的形成

齊龍升，孫 博，韓志東，汪倫記

（河南科技大學食品與生物工程學院，河南洛陽 471023）

單增李斯特菌和金黃色葡萄球菌都是常見的人畜共患病原菌[1-2]，廣泛存在于自然界中。單增李斯特菌可在低溫下生長繁殖[3]，會污染各類冷凍食品[4]，對其他肉類食品也會造成污染。金黃色葡萄球菌近年來的檢出報道較多[5-6]，對各類食品尤其是肉制品污染較多[7]。在對食品的安全抽檢中，單增李斯特菌和金黃色葡萄球菌經常會被同時檢出，尤其肉類制品[8-11]，給食品安全帶來很大威脅。

生物被膜是指微生物為了適應生存環境而分泌的胞外多聚物[12]。在食品安全領域，食源性致病菌可在固體表面形成生物被膜，且長時間黏附于固體表面[13-14]，這些生物被膜的形成引起了食品、用品衛生安全的隱患。現有研究表明，80%的食源性疾病與食源性致病菌形成的生物被膜有關[15-16]，生物被膜極易黏附于食品接觸表面，27%的食品污染皆來自食品機械設備表面存在的生物被膜[17]。關于單增李斯特菌和金黃色葡萄球菌的單物種生物被膜的研究已有很多[18-19]，但關于單增李斯特菌和金黃色葡萄球菌的混合生物被膜研究還未見報道，而混合培養的微生物生長狀況與生物被膜的形成不同，主要體現在對一些微生物的生物被膜清除劑的抵抗作用與單物種培養形成的生物被膜不同[20-21]。研究了不同溫度下單增李斯特菌和金黃色葡萄球菌混合培養生物被膜的形成，為在食品中控制單增李斯特菌和金黃色葡萄球菌的污染提供參考。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

1.1.1 菌株

單增李斯特菌（Listeria monocytogenes，簡寫為LM）、金黃色葡萄球菌（Staphylococcus aureus，簡寫為SA），河南科技大學食品與生物工程學院實驗室保存。菌株保存于專用菌種保藏管中，使用前挑出管中瓷珠，在液體培養基中活化后接種于平板上，于37 ℃條件下培養24 h 后挑取單菌落使用。

1.1.2 材料與試劑

胰蛋白胨大豆肉湯（TSB）培養基、胰蛋白胨大豆瓊脂（TSA）培養基，北京奧博星生物技術有限責任公司提供；單增李斯特菌增菌（LEB）肉湯培養基，青島海博生物技術有限公司提供；結晶紫（AR），天津市科密歐化學試劑有限公司提供；DAPI（4',6 -二脒基-2 -苯基吲哚二鹽酸鹽）溶液（即用型），北京索萊寶科技有限公司提供；MTT 細胞增殖檢測試劑盒，生工生物工程（上海）股份有限公司提供；磷酸氫二鈉、氯化鈉、冰乙酸、氯化鉀等試劑，均為分析純。

1.1.3 試驗儀器

UV1800PC 型紫外可見分光光度計，上海菁華科技儀器有限公司產品；Infinite F50 型酶標儀，瑞士帝肯（Tecan）公司產品；TM3030Plus 型掃描電鏡，日本日立高新技術公司產品；Leica DM2500 型熒光正置顯微鏡，萊卡顯微系統貿易有限公司產品；FV3000 型激光掃描共聚焦顯微鏡，奧林巴斯公司產品。

1.2 試驗方法

1.2.1 菌種活化和菌懸液制備

無菌條件下用接種環挑取1 環LM 接入LEB 培養基中，SA 接入TSB 培養基中，置于搖床，于37 ℃條件下以轉速180 r/min 培養24 h。用紫外分光光度計調細菌濃度為OD600nm=0.1。將制好的LM 和SA 菌懸液1∶1 等體積混合即為混合菌液。

1.2.2 單增李斯特菌和金黃色葡萄球菌混合培養生物被膜的制備

將1.2.1 中制備的菌懸液用TSB 培養基稀釋103倍，取LM 和SA 混合菌液1 mL 加入96 孔細胞培養板中或LM和SA 混合菌液2 mL 加入24 孔細胞培養板中，分別于4 ℃條件下培養1，3，7，10，15，20 d；于25 ℃條件下培養12，24，36，48，60，72 h；于37 ℃條件下培養12，24，36，48，60 h以形成生物被膜。同時，對LM和SA 按相同方法進行單獨培養作為對比。

1.2.3 不同溫度單增李斯特菌和金黃色葡萄球菌混合培養生物被膜的形成量

采用結晶紫染色法測定不同溫度單增李斯特菌和金黃色葡萄球菌混合培養生物被膜的形成量。參照顧玉卿等人[21]的方法進行結晶紫染色，酶標儀測量OD595吸光度。試驗重復3 次，取平均值。

1.2.4 不同溫度單增李斯特菌和金黃色葡萄球菌混合培養生物被膜的代謝活性

采用MTT 法測定不同溫度單增李斯特菌和金黃色葡萄球菌混合培養生物被膜的代謝活性。參照孫月林[22]的方法進行MTT 染色，酶標儀測量OD595吸光度。試驗重復3 次，取平均值。

1.2.5 熒光顯微鏡觀察

參照顧玉卿等人[21]的方法進行生物被膜制備：24 孔板每孔加入無菌的2%瓊脂溶液，凝固后，插入1 片無菌蓋玻片（14 mm×14 mm），然后加入2 mL 制備的菌懸液，置于4 ℃條件下孵育15 d，于25 ℃條件下孵育48 h，于37 ℃條件下孵育24 h。參照顧玉卿等人[21]的方法熒光染色后進行觀察。

1.2.6 掃描電鏡觀察

生物被膜制備同1.2.5，參照顧玉卿等人[21]的方行掃描電鏡制片和觀察。

1.2.7 激光共聚焦顯微鏡觀察

生物被膜制備同1.2.5，參照陳萍等人[23]的方法進行制片與染色，然后進行激光共聚焦顯微鏡觀察。

1.3 數據分析

采用SPSS 20.0 統計軟件進行數據分析，結果以平均值±標準差來表示。

2 結果與分析

2.1 不同溫度單增李斯特菌和金黃色葡萄球菌混合培養生物被膜的形成

采用結晶紫法研究了不同溫度下LM 和SA 混合培養生物被膜形成量隨時間變化的情況。

4 ℃時LM和SA 混合培養生物被膜形成量見圖1，25 ℃時LM 和SA 混合培養生物被膜形成量見圖2，37 ℃時LM和SA 混合培養生物被膜形成量見圖3。

圖1 4 ℃時LM 和SA 混合培養生物被膜形成量

圖2 25 ℃時LM 和SA 混合培養生物被膜形成量

圖3 37℃時LM 和SA 混合培養生物被膜形成量

由圖1 可知，4 ℃時，LM 和SA 生物被膜的形成能力比較弱，但LM對外界環境的耐受性強，4 ℃的低溫條件下仍能生長。4 ℃時，LM 生物被膜量隨著時間的增加逐漸增多，15 d 達到最大值。LM 和SA 混合培養的生物被膜量的增加趨勢與LM 單獨培養時幾乎一致，表明在4 ℃混合形成的生物被膜中單增李斯特菌占優勢。由圖2 和圖3 可知，25 ℃和37 ℃SA 和LM都具有較強的生物被膜形成能力，但金黃色葡萄球菌生物被膜的形成能力高于單增李斯特菌。25 ℃和37 ℃單獨培養LM 和SA 時，生物被膜量分別在48 h 和24 h 時達到最大。LM 和SA 混合培養時，形成的生物被膜的量低于SA，高于LM。表明LM 和SA 混合培養時存在拮抗作用，混合生物被膜的量與生長趨勢跟SA 較為接近，說明2 種菌共培養時SA 是優勢菌。

2.2 不同溫度下單增李斯特菌和金黃色葡萄球菌混合培養生物被膜的代謝活性

采用MTT 法分析了不同培養溫度下LM和SA 混合培養生物被膜的代謝活性。

4 ℃時LM 和SA 混合培養生物被膜的代謝活性見圖4，25 ℃時LM和SA 混合培養生物被膜的代謝活性見圖5，37 ℃時LM和SA 混合培養生物被膜的代謝活性見圖6。

圖4 4 ℃時LM 和SA 混合培養生物被膜的代謝活性

圖5 25 ℃時LM 和SA 混合培養生物被膜的代謝活性

圖6 37 ℃時LM 和SA 混合培養生物被膜的代謝活性

由圖4 可知，在4 ℃時，LM 和SA 單獨培養和混合培養生物被膜的代謝活性都較低，但SA 的生物被膜的代謝活性顯著低于LM 與LM 和SA 混合培養的生物被膜代謝活性。表明在4 ℃混合培養形成的生物被膜中單增李斯特菌代謝活性占優勢。由圖5和圖6 可知，25 ℃和37 ℃SA 和LM 都具有較強的生物被膜代謝活性，但金黃色葡萄球菌的生物被膜的代謝活性高于單增李斯特菌。25 ℃和37 ℃單獨培養LM和SA 時，生物被膜代謝活性分別在48 h和24 h時達到最大。LM 和SA 混合培養時，生物被膜代謝活性低于SA，高于LM。表明從生物被膜代謝活性看，LM 和SA 混合培養時存在拮抗作用，混合生物代謝活性跟SA 較為接近，說明2 種菌共培養時SA是優勢菌，結論與2.1 相符。

2.3 熒光顯微鏡

用熒光顯微鏡觀察了不同溫度下LM 和SA 混合培養生物被膜熒光圖。

不同溫度LM和SA 混合培養生物被膜熒光圖見圖7。

圖7 不同溫度LM 和SA 混合培養生物被膜熒光圖

由圖7 可知，4 ℃時對LM 和SA 單獨培養或混合培養，顯微鏡觀察到的圖像熒光都非常弱，沒有生物被膜量的形成；25 ℃和37 ℃時顯微鏡觀察到的圖像熒光則比較強，能觀察到有大量的生物被膜形成，特別是37 ℃培養時，形成的生物被膜連成一片。與2.1 和2.2 的結果相同，LM和SA 混合培養的熒光強度和形成的生物被膜量比對其單獨培養的熒光強度要弱和低。試驗結果進一步證實LM和SA 混合培養時存在拮抗作用。

2.4 掃描電鏡

用掃描電鏡觀察了不同溫度下LM 和SA 混合培養生物被膜形成情況。

不同溫度LM和SA 混合培養生物被膜掃描電鏡圖見圖8。

圖8 不同溫度LM 和SA 混合培養生物被膜掃描電鏡圖

由圖8 可知，4 ℃培養時，沒有生物被膜形成，菌體散布分開；25 ℃培養時，菌體聚集成團，堆疊在一起形成生物被膜；37 ℃培養時，更多的菌體堆積聚集在一起，堆疊在一起形成生物被膜區域也變大。LM 和SA 混合培養的生物被膜量要低于金黃色葡萄球菌，且聚集成團形成生物被膜是金黃色葡萄球菌，生物被膜中也有少量的單增李斯特菌分布。

2.5 激光共聚焦顯微鏡

用激光共聚焦顯微鏡觀察了LM和SA 混合培養時生物被膜的形成隨培養時間延長的變化情況。

37 ℃培養不同時間LM和SA 混合培養生物被膜激光共聚焦顯微鏡圖見圖9。

圖9 37 ℃培養不同時間LM 和SA 混合培養生物被膜激光共聚焦顯微鏡圖

由圖9 可知，37 ℃培養24 h 時，生物被膜形成量達到最大；48 h 時，生物被膜一部分已發生解聚，只有部分生物被膜存在；60 h 時，生物被膜已大部分解離，菌體量非常少，且呈零散分布。

3 結論

研究了不同溫度下LM和SA 這2 種食源性致病菌混合培養生物被膜的形成情況。試驗結果表明，在4 ℃時，LM 和SA 生長和生物被膜的形成能力都受到抑制，但仍能緩慢生長，混合培養時，優勢菌是LM；25 ℃和37 ℃時LM 和SA 都能快速生長，并有較強的生物被膜形成能力，混合培養時，優勢菌是SA。