缺氧微環(huán)境中HIP68/RAP1B信號通路對乳腺癌侵襲轉(zhuǎn)移的作用*

屈航英 閆鵬云 張佳 陳強

(1.西安交通大學第一附屬醫(yī)院心外科,陜西 西安 710061;2.西安市第三醫(yī)院放療科,陜西 西安 710000;3.西安交通大學第一附屬醫(yī)院胸外科,陜西,西安 710061)

在我國,乳腺癌是女性常見的腫瘤之一,其死亡率僅次于肺癌、胃癌、肝癌、結(jié)直腸癌,嚴重威脅著女性的身心健康及生活質(zhì)量。近年來我國乳腺癌的發(fā)生逐年增加而且更趨于年輕化,而且也是年輕女性的主要死因。缺氧區(qū)域的存在為局部進展期乳腺癌的常見特征,而在正常乳腺組織中是不存在的[1]。缺氧與乳腺癌復發(fā)和轉(zhuǎn)移明顯相關(guān)[2-3]。前期課題組發(fā)現(xiàn)缺氧模型下低氧誘導因子-1α(Hypoxia-inducible factor-1α,HIF-1α)與HIP68在乳腺癌組織中表達明顯正相關(guān)且促進乳腺癌細胞增生及侵襲轉(zhuǎn)移[4-5]。HIP68在乳腺癌組織中高表達并促進細胞增殖、侵襲及遷移,本研究我們將進一步探討HIP68通過何種途徑參與乳腺癌細胞增殖、遷移及侵襲。

1 資料與方法

1.1 一般資料 選取西安交通大學第一附屬醫(yī)院2012—2013年乳腺癌組織標本共73例,均經(jīng)術(shù)后病理診斷且臨床資料詳實。所有標本均選取自女性乳腺癌患者,年齡37～69歲,其中23例為乳腺小葉癌標本,50例為乳腺導管癌標本。所有標本在手術(shù)前患者均未經(jīng)過系統(tǒng)治療。標本使用獲我院倫理委員會批準。

1.2 細胞與主要試劑 兩種乳腺癌細胞系(MCF-7和MDA-MB-231)和人正常乳腺上皮細胞SK-BR-3購自中科院上海細胞庫。si-HIP68、si-RAP1B及對照shRNA(上海吉凱),Lipofectamine2000(Invitrogen,CA,USA),PVDF膜(Millipore公司),HIP68兔抗人單克隆抗體(Abcam公司),RAP1B兔抗人單克隆抗體(Abcam公司),β-actin兔抗人單克隆抗體(GAPDH),辣根過氧化酶(HRP)標記的山羊抗兔IgG(Abcam公司)。

1.3 細胞培養(yǎng)及分組 用化學藥物CoCl2·6H2O構(gòu)建細胞缺氧模型,用MTT實驗篩選合適的CoCl2·6H2O濃度,確認最終的藥物作用梯度為0、50、100、150、200、250 μg/mL,0 μg/mL為對照組。缺氧乳腺癌細胞系MDA-MB-231、MCF-7用含有10%FBS(Gibco)的Dulbecco改良的Eagle培養(yǎng)基(DMEM,1640)中培養(yǎng),乳腺正常上皮細胞系SK-BR-3細胞用DMEM培養(yǎng)基,含10% 胎清培養(yǎng),3種細胞都在37 ℃、5% CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。培養(yǎng)基每隔一天交換一次,細胞每3天傳代(1∶3)。通過將HIP68、RAP1B編碼序列克隆到pIRES/Red載體中實現(xiàn)過表達,當80%～90%匯合時,基于所提供的方向,通過Lipofectamine 2000用適當?shù)臉?gòu)建體轉(zhuǎn)染所有細胞。在轉(zhuǎn)染后6 h用新鮮的完整環(huán)境替換環(huán)境,并在轉(zhuǎn)染后24～48 h收集細胞用于下一次使用。Control組不做任何處理,轉(zhuǎn)染不帶目的基因的空載體細胞為NC組,轉(zhuǎn)染相應(yīng)的shRNA為實驗組。

1.4 免疫組化染色 將蓋玻片先泡酸處理后洗滌干凈、高壓滅菌后放入24孔培養(yǎng)板中,取對數(shù)生長期細胞,以1×105個/孔接種于24孔,待培養(yǎng)的細胞匯合度達到60%～80%,取出細胞爬片,1×PBS漂洗,3 min×3次;4%多聚甲醛固定細胞,于4 ℃放置30 min;1×PBS漂洗,3 min×3次;0.5%TritonX-100(1×PBS配制)孵育,室溫10 min;1×PBS漂洗3 min×3次;3%H2O2室溫孵育10 min;1×PBS漂洗,3 min×3次;封閉血清室溫孵育10 min,傾去不洗;一抗孵育(陰性對照用1×PBS孵育),于濕盒中4 ℃過夜;1×PBS 漂洗5 min×3 次;生物素標記二抗工作液室溫孵育30 min ;1×PBS 漂洗5 min×3 次;辣根酶標記鏈霉卵白素工作液室溫孵育 30 min;1×PBS 漂洗5 min×3次;DAB 顯色;自來水充分沖洗;蘇木素復染;鹽酸酒精分化,淡氨水反藍;75%、95%、無水乙醇梯度脫水,二甲苯透明,中性樹脂封片;顯微鏡下觀察,采用 DeltaPixViewer 軟件對圖像進行采集。

1.5 Western blot檢測蛋白表達水平 提取處理后腫瘤細胞蛋白,BCA法測定樣品的蛋白濃度。SDS-PAGE對蛋白進行分離,之后轉(zhuǎn)至PVDF膜,5%脫脂奶粉封閉,一抗4 ℃孵育過夜,洗膜,二抗孵育1～2 h,洗膜,用ECL化學發(fā)光試劑檢測,顯影曝光得到目的蛋白表達條帶。

1.6 Real-time PCR檢測靶基因mRNA表達 應(yīng)用Lipid RNeasy Mini Kit RNA(QAIGEN公司)提取不同細胞中的總RNA,使用M-MLV反轉(zhuǎn)錄酶(Invitrogen)進行逆轉(zhuǎn)錄,利用SYBR Green I Master Mix(TAKARA)試劑盒在BioRad公司的iQ5實時定量PCR儀進行PCR擴增,檢測mRNA的表達。

1.7 MTT檢測細胞的增殖能力 將不同細胞(2×103個/孔)接種至96孔板中,37 ℃培養(yǎng)24 h后,不同干預后繼續(xù)孵育48 h。每孔加入20 μL的MTT(5 mg/mL),37 ℃孵育4 h。然后吸去培養(yǎng)基,加入150 μL的DMSO,振蕩10 min至甲瓚結(jié)晶完全溶解。利用分光光度計測量572 nm處吸光度,計算細胞的相對增殖率。

1.8 Transwell法檢測細胞侵襲能力 使用預先鋪好Matrigel孔隙大小為8 μm的24孔Transwell板(BD),待細胞消化好后,用無血清培養(yǎng)液重懸細胞,離心去培養(yǎng)液后再使用無血清培養(yǎng)液重懸細胞,對細胞進行計數(shù),調(diào)整細胞濃度為5×105。Transwell板上室加入200 μL細胞懸液,下室加入0.6 mL含10% FBS的培養(yǎng)液,置于培養(yǎng)箱中培養(yǎng)36 h。將上室置于多聚甲醛中固定15 min,然后用結(jié)晶紫染色5 min,用棉簽擦去上室室內(nèi)未穿過膜的細胞,在高倍顯微鏡下觀察、拍照并計數(shù)。每個樣本取5個高倍視野進行計數(shù)最后取均值。

2 結(jié)果

2.1 HIP68、RAP1B在乳腺癌組織中的表達情況 免疫組化染色結(jié)果顯示,HIP68蛋白和RAP1B蛋白表達均位于細胞核或細胞核和細胞質(zhì),見圖1、2。HIP68和RAP1B蛋白在乳腺癌組織中的表達水平高于癌旁組織(P<0.001),見表1。

表1 HIP68和RAP1B在乳腺癌組織和癌旁組織中的表達差異

圖1 HIP68在乳腺癌組織中的表達 (40×)

圖2 RAP1B在乳腺癌組織中的表達 (40×)

2.2 HIP68、RAP1B在乳腺癌中的表達與臨床病理特征的關(guān)系 73例乳腺癌患者組織中HIP68表達與TNM分期、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移相關(guān)(P<0.05),與患者的腫瘤類型、年齡、腫瘤位置等無關(guān)(P>0.05);RAP1B表達與TNM分期、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、ER、PR狀態(tài)相關(guān)(P<0.05),與患者的腫瘤類型、年齡、腫瘤位置等無關(guān)(P>0.05),見表2。Spearman’s相關(guān)性分析結(jié)果顯示,HIP68表達與RAP1B表達呈正相關(guān)(r=0.427,P<0.001),見表3。

表2 HIP68和RAP1B與乳腺癌臨床病理數(shù)據(jù)相關(guān)性分析

表3 HIP68和RAP1B表達相關(guān)性分析

2.3 細胞水平檢測HIP68和RAP1B表達情況 用不同濃度的CoCl2·6H2O作用乳腺癌細胞系24 h后,采用Western blot及qRT-PCR檢測各組HIP68、RAP1B表達情況顯示,隨著CoCl2·6H2O藥物濃度的增高,RAP1B的表達在3種乳腺癌細胞系中也在逐漸增加,同時HIP68表達水平隨著缺氧程度的增加而逐漸增高(P<0.05);HIP68在MCF-7、MDA-MB-231的表達水平高于SK-BR-3細胞(P<0.05),見圖3。

圖3 缺氧模型中HIP68/RAP1B蛋白和mRNA在3種乳腺癌細胞中的表達情況

2.4 沉默HIP68對RAP1B蛋白的影響及對細胞生物學行為的影響 缺氧環(huán)境下應(yīng)用si-HIP68轉(zhuǎn)染MDA-MB-231和MCF-7 24 h后進行RAP1B測定蛋白表達情況和腫瘤細胞遷移、侵襲能力的測定,未轉(zhuǎn)染的細胞為Control組,轉(zhuǎn)染不帶目的基因的空載體為NC組,轉(zhuǎn)染si-HIP68為si-HIP68組。結(jié)果顯示沉默HIP68蛋白后可以顯著的抑制RAP1B蛋白的表達(P<0.05),見圖4。細胞增殖和侵襲實驗結(jié)果表明,si-HIP68轉(zhuǎn)染的乳腺癌細胞后,腫瘤細胞增殖及侵襲能力較Control組明顯降低,低表達HIP68可以顯著抑制MDA-MB-231和MCF-7的增殖及侵襲能力(P<0.001),見圖5。

圖4 沉默HIP68抑制RAP1B蛋白表達

圖5 沉默HIP68抑制乳腺癌細胞增殖與侵襲轉(zhuǎn)移

2.5 過表達HIP68對RAP1B蛋白的影響及對細胞生物學行為的影響 缺氧環(huán)境下應(yīng)用pIRES/Red-HIP68轉(zhuǎn)染MDA-MB-231和MCF-7 24 h后進行RAP1B測定蛋白表達情況和腫瘤細胞增殖、侵襲能力的測定,未轉(zhuǎn)染的細胞為Control組,轉(zhuǎn)染不帶目的基因的空載體為NC組,轉(zhuǎn)染pIRES/Red-HIP68為pIRES/Red-HIP68組。結(jié)果顯示過表達HIP68蛋白后RAP1B蛋白也明顯高表達(P<0.05),見圖6。細胞增殖和細胞侵襲實驗結(jié)果表明,pIRES/Red-HIP68轉(zhuǎn)染的乳腺癌細胞后,腫瘤細胞的增殖和侵襲能力較Control組明顯增強,過表達HIP68可以顯著增強MDA-MB-231和MCF-7的增殖和侵襲能力(P<0.05),見圖7。

圖6 過表達HIP68促進RAP1B蛋白表達

圖7 過表達HIP68促進乳腺癌細胞增殖與侵襲轉(zhuǎn)移

2.6 沉默RAP1B對HIP68蛋白的影響及對生物學行為的影響 缺氧環(huán)境下應(yīng)用si-RAP1B轉(zhuǎn)染MDA-MB-231和MCF-7 24 h后進行HIP68測定蛋白表達情況和腫瘤細胞遷移、侵襲能力的測定,未轉(zhuǎn)染的細胞為Control組,轉(zhuǎn)染不帶目的基因的空載體為NC組,轉(zhuǎn)染si-RAP1B為si-RAP1B組。結(jié)果顯示沉默RAP1B蛋白后對HIP68蛋白影響不大(P=0.13),見圖8。細胞增殖、侵襲實驗結(jié)果表明,si-RAP1B轉(zhuǎn)染的乳腺癌細胞后,腫瘤細胞增殖、遷移和侵襲能力較Control組明顯降低,低表達RAP1B可以顯著抑制MDA-MB-231和MCF-7增殖及侵襲能力(P<0.05),見圖9。

圖8 沉默RAP1B蛋白表達情況

圖9 沉默RAP1B抑制乳腺癌細胞增殖及侵襲轉(zhuǎn)移

2.7 過表達RAP1B對HIP68蛋白的影響及對生物學行為的影響 缺氧環(huán)境下應(yīng)用pIRES/Red-RAP1B轉(zhuǎn)染MDA-MB-231和MCF-7 24 h后進行HIP68測定蛋白表達情況和腫瘤細胞增殖、侵襲能力的測定,未轉(zhuǎn)染的細胞為Control組,轉(zhuǎn)染不帶目的基因的空載體為NC組,轉(zhuǎn)染pIRES/Red-RAP1B為PIRES/Red-RAP1B組。結(jié)果顯示過表達RAP1B蛋白后對HIP68蛋白影響不大(P=0.13),見圖10。細胞增殖和細胞侵襲實驗結(jié)果表明,pIRES/Red-RAP1B轉(zhuǎn)染的乳腺癌細胞后,腫瘤細胞的增殖和侵襲能力較Control組明顯增強,過表達 RAP1B可以顯著促進MDA-MB-231和MCF-7的增殖和侵襲能力(P<0.05),見圖11。

圖10 過表達RAP1B蛋白表達情況

圖11 過表達RAP1B促進乳腺癌細胞增殖及侵襲轉(zhuǎn)移

2.8 HIP68/RAP1B免疫共沉淀結(jié)果 進一步免疫共沉淀結(jié)果提示HIP68與RAP1B可特異性結(jié)合,乳腺癌組織中研究發(fā)現(xiàn)HIP68與RAP1B表達呈正相關(guān),且沉默RAP1B對HIP68無影響,低表達或高表達HIP68相應(yīng)地會引起RAP1B低表達或高表達,見圖12。提示RAP1B可能為HIP68基因的下游。

圖12 HIP68/RAP1B免疫共沉淀結(jié)果

3 討論

乳腺癌作為全球女性發(fā)病率最高的惡性腫瘤,具有增長快、易轉(zhuǎn)移等特點,其病死率約占全球惡性腫瘤的25%,嚴重威脅著女性健康[6]。目前乳腺癌的治療逐步形成個體化的綜合治療,積極尋找分子靶向治療提高無病生存期和乳腺癌的總生存期至關(guān)重要。

課題組一直致力于乳腺癌的研究,前期也已證實HIP68在乳腺癌組織中高表達,HIP68高表達可促進乳腺癌細胞生長增殖、遷移和侵襲。

1999年,我們課題組開始用cDNA microarrays技術(shù)研究缺氧對基因表達的影響,發(fā)現(xiàn)缺氧能強烈誘導EST表達序列EST 188825(GenBank Accession Number：AA799328,基因名稱為FAM111A)。這項研究結(jié)果與2002年Bernaudin等[7]的研究結(jié)果一致,同樣顯示在缺氧再氧合時通過基因芯片篩查技術(shù)發(fā)現(xiàn)EST 188825基因在新生鼠的各個組織(腦組織、心臟組織、腎臟組織、肺組織、肝組織等)中均呈現(xiàn)不同程度(數(shù)倍到幾十倍不等)的高表達狀態(tài)。隨后課題組根據(jù)EST 188825 的核苷酸序列設(shè)計了引物,用RACE技術(shù)克隆了EST 188825的全長cDNA 序列,用體外蛋白翻譯技術(shù)證實該基因表達分子量為68 kDa的蛋白。該cDNA是在缺氧環(huán)境中高表達被發(fā)現(xiàn)的,且編碼的蛋白分子量為68 kDa,因此把其命名為HIP68。到目前為止,HIP68(FAM111A)基因的功能是未知的,國內(nèi)外對該基因的研究也很少,大多是近幾年研究報道的。HIP68位于常染色體11q12附近16kb處,編碼含有611個氨基酸的核表達蛋白[8-10]。2012年有報道稱SV40病毒的LT抗原可以與HIP68特異性的相互作用,LT抗原通過損耗HIP68來穩(wěn)固和重建病毒在宿主中的表型,提示HIP68可能具有抗病毒的特性;該研究還發(fā)現(xiàn)HIP68的表達具有細胞周期依賴性[11]。2012年Nature Genetics報道稱HIP68基因的突變可能與日本男性前列腺癌易感性有關(guān)[8];隨后在2014年有學者發(fā)現(xiàn)這可能是由于HIP68基因可以調(diào)控雄激素受體有關(guān)[12]。2013年有研究發(fā)現(xiàn)HIP68的高表達與糖尿病的發(fā)病有關(guān),可能是由于HIP68的高表達影響了胰島B細胞的存活[13]。Kenny-Caffey氏綜合癥是一種相當罕見的遺傳性骨骼疾病,一般表現(xiàn)為出生后生長遲滯,身材短小,大頭,臉部有輕微的畸形,前額微凸,高的發(fā)際線,眉毛與睫毛較不明顯;且骨質(zhì)較硬,長骨的骨干較為狹窄,皮層較厚而髓質(zhì)腔狹窄,常伴有低鈣血癥[10,14]。2013年之后有報道稱Kenny-Caffey氏綜合癥可能是因為HIP68基因的突變引起的[9-10,15],HIP68基因的突變可導致骨骼系統(tǒng)發(fā)育異常[16]。從這些文獻報道來看,HIP68可能與基因的轉(zhuǎn)錄有關(guān)[11],對調(diào)控骨骼的生長增殖、甲狀旁腺激素分泌、體內(nèi)鈣水平穩(wěn)定、男性生殖系統(tǒng)發(fā)育等起重要作用[10,14]。

RAP1B是RAP1的異構(gòu)體,是一種小的Ras樣GTP酶,在調(diào)控多種信號通路如增殖、分化、形態(tài)形成以及凋亡中起分子開關(guān)的作用[17]。RAP1B在內(nèi)皮遷移與血管生成的作用相對明確。在RAP1B基因敲除的裸鼠動物模型研究證實,RAP1B缺失可以導致血管生成、內(nèi)皮細胞遷移及增殖的功能受損以及MAPK信號通路的受阻,無論是血管發(fā)生、內(nèi)皮遷移以及MAPK通路都在腫瘤的發(fā)生發(fā)展中發(fā)揮重要作用[18]。雖然RAP1B在很多腫瘤中的突變不多,但其癌基因的功能已在多種腫瘤中被證實,也是腫瘤治療的潛在位點[19-21]。Infante等[22]研究發(fā)現(xiàn)RAP1B可以作為預防急性淋巴細胞白血病組織侵襲的有效手段,與本實驗結(jié)果一致。以往報道在結(jié)腸癌肝轉(zhuǎn)移瘤、黑色素瘤、甲狀腺乳頭狀癌、膠質(zhì)瘤等的研究中也發(fā)現(xiàn)RAP1B參與了腫瘤的增殖與遠處轉(zhuǎn)移[23-26]。課題組前期研究也發(fā)現(xiàn),RAP1B與食管癌增殖和侵襲相關(guān),且為miR-518b的下游[27];在胃癌中RAP1B高表達,且與胃癌患者預后相關(guān),缺氧可誘導RAP1B在胃癌細胞中高表達,且與胃癌侵襲明顯相關(guān)[28]。

本研究中乳腺癌缺氧組織IHC結(jié)果顯示,HIP68、RAP1B蛋白高表達于乳腺癌細胞,而前期已經(jīng)證實HIP68高表達于乳腺癌,RAP1B參與腫瘤的發(fā)生,且有報道高表達RAP1B促進乳腺癌轉(zhuǎn)移,但具體機制尚未報道。本研究我們設(shè)想HIP68與RAP1B可能共同參與乳腺癌的惡行生物學行為,且證實RAP1B為HIP68的下游作用靶點,促進乳腺癌的生物學行為,通過免疫共沉淀實驗表明HIP68與RAP1B結(jié)合并作為下游靶點促進乳腺癌侵襲轉(zhuǎn)移及細胞增殖,這與Bischoff等[29]報道的結(jié)果一致,高表達RAP1B可以促進乳腺癌遠處轉(zhuǎn)移及定植, RAP1B通過上游分子激活形成活性形式促進腫瘤細胞群體性的聚集及延伸促進癌細胞遠處轉(zhuǎn)移,RAP1B通過促進細胞外張力作用參與腫瘤的進一步發(fā)展。本研究未在動物水平驗證HIP68/RAP1B促進乳腺癌惡行生物學行為的機制,接下來我們將進一步在體內(nèi)及動物實驗中驗證HIP68/RAP1B在乳腺癌侵襲轉(zhuǎn)移中的機制,為乳腺癌的防治提供新的依據(jù)。

4 結(jié)論

HIP68/RAP1B信號通路在缺氧乳腺癌組織中高表達并促進乳腺癌細胞遷移和侵襲。