沒食子酸抑制人舌鱗癌SCC-9細胞增殖、凋亡及可能機制研究*

海樂 易必新 潘小紅

(1.湖南省藥品審核查驗中心, 湖南 長沙 410000;2.湖南省藥品檢驗研究院, 湖南 長沙 410000)

口腔頜面部惡性腫瘤占全身惡性腫瘤的3%～5%,組織病理學類型多樣,以鱗狀細胞癌最多見,屬于世界范圍內第六大常見的惡性腫瘤,其發生與多種內、外因素有關,尤以吸煙、飲酒的危險性最大[1]。口腔頜面部惡性腫瘤的治療以手術為主,但預后效果欠佳,復發轉移率較高,放化療效果也不理想[2]。因此,尋找一種對腫瘤敏感性高、不良反應少、療效好的藥物是亟待解決的問題。一般認為腫瘤的發生不僅與分化異常有關,與細胞凋亡機制也有密切關系[3]。沒食子酸(Gallic acid,GA)是一類多酚類化合物[4],可通過阻滯細胞周期和誘導細胞凋亡在人腫瘤細胞系中發揮抗腫瘤作用,在藥理學方面具有安全性和高效性,已成為腫瘤預防及治療領域的熱點之一。迄今為止,GA對人口腔癌SCC-9細胞的影響少見報道,本研究觀察沒食子酸對SCC-9細胞增殖及凋亡的影響,探討其可能機制,為進一步闡明沒食子酸的抗腫瘤機制提供理論依據。

1 材料與方法

1.1 材料 沒食子酸購自Sigma公司,SCC-9人舌鱗癌細胞株來自中國科學院上海細胞所,噻唑藍(MTT)購自北京索來寶科技有限公司,膜聯蛋白V(Annxin V)/碘化丙錠(propidium iodide,PI)凋亡檢測試劑盒購自上海碧云天生物科技有限公司,細胞裂解液和BCA蛋白含量測定試劑購自江蘇碧云天公司,鼠抗人Cleaved-PARP、Cleaved-caspase9、Cleaved-caspase8和Cleaved-caspase3一抗購自abcam公司,鼠抗人p-ERK1/2、p-JNK1/2和p-P38一抗購自美國Cell Signaling Technology公司。

1.2 細胞培養及分組 將SCC-9人舌鱗癌細胞用含10%胎牛血清的DMEM高糖培養基,置于37 ℃、5% CO2恒溫培養箱培養,收集對數生長期細胞進行實驗。細胞貼壁后,將細胞分為4組：對照組、低濃度沒食子酸組(30 μM GA組)、中濃度沒食子酸組(60 μM GA組)、高濃度沒食子酸組(90 μM GA組)。

1.3 MTT檢測細胞增殖 將SCC-9細胞以密度為5×104個細胞/孔,接種于24孔培養板上過夜,加入含沒食子酸(0、30、60和90 μM)培養液37 ℃下分別培養24和48 h,然后按照MTT試劑盒說明書進行操作,并使用酶標儀在563 nm處測量每個孔的吸光度。

1.4 流式細胞儀檢測SCC-9細胞周期 SCC-9細胞同“1.3方法”接種在培養皿上,并與沒食子酸(30、60和90 μM)共孵育24 h,收集細胞、重懸,4 ℃固定24 h 后離心去除固定液,在室溫下加入嗅化乙錠(PI)溶液避光染色15 min,使用流式細胞儀檢測細胞周期。

1.5 流式細胞儀檢測SCC-9細胞凋亡率 將SCC-9細胞同“1.3方法”接種到24孔板,待細胞貼壁后將細胞分組,按照FITC Annexin V凋亡檢測試劑盒說明書進行操作,SCC-9細胞加入5 μL FITC Annexin V和5 μL PI染色,混合液置于暗處室溫反應15 min,然后加入400 μLAnnexin V-結合緩沖液重懸1 h后,采用流式細胞儀進行細胞分析。

1.6 TUNEL法檢測SCC-9細胞凋亡 SCC-9細胞培養及分組同“1.3方法”,按照TUNEL法檢測試劑盒說明進行操作,在37 ℃、5% CO2恒溫培養箱中培養48 h后進行檢測,顯微鏡下觀察凋亡陽性細胞。

1.7 Western blot檢測SCC-9細胞中Cleaved-caspase9、Cleaved-caspase8、Cleaved-caspase3、Cleaved-PARP、p-ERK1/2、p-JNK1/2和p-P38蛋白表達 收集各組SCC-9細胞,裂解后BCA試劑盒檢測總蛋白濃度。電泳分離,PVDF膜轉膜、封閉,加入一抗,4 ℃輕搖過夜,再加入HRP標記的二抗孵育2 h、顯色,采用凝膠成像技術進行分析。

2 結果

2.1 沒食子酸抑制人口腔癌SCC-9細胞增殖 培養24、48 h后,與對照組比較,低、中和高濃度沒食子酸組SCC-9細胞增殖率逐漸下降,差異均有統計學意義(均P<0.05),見圖1。

圖1 MTT檢測SCC-9細胞增殖

2.2 沒食子酸誘導人口腔癌SCC-9細胞sub G1細胞周期阻滯 使用流式細胞儀對碘化丙啶(PI)染色后的細胞進行定量分析,與對照組比較,沒食子酸組SCC-9細胞的sub G1期DNA含量逐漸增加,差異均有統計學意義(均P<0.05),見圖2。

圖2 沒食子酸對SCC-9細胞周期的影響

2.3 沒食子酸誘導SCC-9細胞凋亡 與對照組比較,低、中和高濃度沒食子酸組細胞晚期凋亡率逐漸增加,差異均有統計學意義(均P<0.05),見圖3。

圖3 沒食子酸對SCC-9細胞凋亡的影響

2.4 4組SCC-9細胞凋亡情況比較 與對照組比較,低、中和高濃度沒食子酸組陽性細胞凋亡數逐漸增加,差異均有統計學意義(均P<0.05),見圖4。

圖4 TUNEL法檢測各組SCC-9細胞凋亡

2.5 沒食子酸誘導SCC-9細胞中Caspase活化及PARP的裂解 與對照組比較,中、高濃度食子酸組SCC-9細胞中Cleaved-caspase9、Cleaved-caspase8、Cleaved-caspase3和Cleaved-PARP蛋白表達增加,差異均有統計學意義(均P<0.05),見圖5A。與對照組比較,低、中和高濃度沒食子酸組SCC-9細胞中p-ERK1/2、p-JNK1/2和p-P38蛋白表達增加,差異均有統計學意義(均P<0.05),見圖5B。

圖5 沒食子酸對SCC-9細胞中凋亡及MAPK信號通路的影響

3 討論

細胞凋亡是由基因控制的細胞自主、有序死亡,也是機體清除不必要受損細胞的一種病理生理過程[5-6],因此凋亡可作為腫瘤治療的一種治療策略。沒食子酸(GA)是一種天然多酚類化合物,具有多種生物學活性,如抗炎、抗氧化等作用[7],還能選擇性抑制腫瘤細胞增殖并誘導其凋亡[8]。但目前關于GA對口腔癌作用的具體機制尚不完全清楚,并且缺乏多種藥理作用之間相關性研究。

本研究MTT檢測結果顯示,相同作用時間下,隨著GA濃度增加,SCC-9細胞的增殖率逐漸下降,具有藥物濃度相關性;而相同作用濃度下,48 h作用時間的SCC-9細胞增殖率低于24 h,說明其抑制效果具有時間相關性。流式細胞儀和TUNEL檢測結果提示,GA參與了細胞凋亡調控,藥物濃度的增加能誘導SCC-9細胞sub、G1細胞周期阻滯,從而晚期凋亡率逐漸增加、抑制其增殖,且凋亡具有濃度依賴性。

Caspases蛋白酶激活級聯反應在凋亡各個階段發揮重要作用[9]。細胞內凋亡信號轉導涉及兩條基本途徑：外源性通路和內源性通路[10]。外源性凋亡信號可誘導形成死亡誘導信號復合物,激活細胞膜近端的Caspase-8等,然后剪切活化執行型Caspase(如Caspase-3),同時活化的Caspase-8還可以剪切活化PARP,進而誘導細胞凋亡[11];內源性通路也稱為線粒體途徑,線粒體膜電位變化和線粒體內外膜通透性增加引導釋放細胞色素C,隨后與胞漿中的凋亡蛋白酶激活因子-1(Apaf-1)結合,激活Caspase-9,啟動caspase級聯反應,誘導細胞凋亡[12]。PARP是真核細胞中的DNA修復酶,可識別結構損傷的片段DNA[13]。Caspase-3一旦被激活,即可誘導PARP發生斷裂,使細胞進入凋亡途徑[14]。Western blot檢測發現,與對照組比較,中、高濃度沒食子酸組SCC-9細胞中Cleaved-caspase9、Cleaved-caspase8、Cleaved-caspase3和Cleaved-PARP蛋白表達增加,提示沒食子酸可能通過細胞外傳導途徑活化Caspase-8,進一步激活下游效應因子Caspase-3,誘導細胞凋亡;沒食子酸還可能通過線粒體途徑,促進凋亡刺激因子與Apaf-1形成多聚復合物,激活Caspase-9,進而激活下游的 Caspase-3,誘導PARP發生剪切,進入凋亡途徑。

MAPK是一絲席氨酸蛋白激酶家族,p38、ERK 1/2、JNK是MAPK家族的主要成員,其中JNK、p38 MAPK 信號通路活化與細胞凋亡有關[15]。研究表明,活化的MAPK通過級聯反應將外界信號傳遞給細胞核,調節細胞增殖、遷移、分化和凋亡[16-17]。文獻報道[18],人肝癌和早幼粒細胞白血病細胞中,甘草黃酮通過JNK1/2途徑激活Caspase-9、Caspase-8和Caspase-3導致細胞凋亡;ERK 1/2級聯是一種經典的細胞內信號通路,ERKl/2磷酸化是功能活動的標志,能介導細胞的增殖、分化和死亡多種病理生理過程[19-20]。Western blot檢測發現,沒食子酸組p-ERK1/2、p-JNK1/2和p-P38蛋白表達較對照組逐漸增加(P<0.05),提示沒食子酸可能通過磷酸化JNK、p38、ERK1/2途徑激活下游信號因子Caspase-9、Caspase-8和Caspase-3,發揮促進SCC-9細胞凋亡、抑制其增殖的作用,這與本研究MTT結果基本一致。

4 結論

沒食子酸具有抑制SCC-9細胞增殖、誘導凋亡作用,這與其可以通過激活MAPK/ERK信號通路,活化下游Caspase信號因子,誘導PARP發生斷裂,促使細胞進入凋亡途徑有關,提示沒食子酸可作為一種潛在的口腔癌治療劑。