姜黃素聯合阿扎胞苷對急性髓系白血病細胞增殖的影響及機制研究

王萍 蔣玲琳 廖存香

(1.陸軍軍醫大學附屬西南醫院血液病中心,重慶 400038;2.中國人民解放軍75750部隊衛生所,廣西 柳州 545606)

急性髓系白血病(Acute myeloid leukemia,AML)是一種高度異質性的造血惡性腫瘤,其特征是骨髓中存在過度增殖和積累的未成熟髓系細胞[1]。盡管AML的診斷和治療取得了極大進展,但其發病率和死亡率仍然很高[2]。目前,傳統化療方法是AML治療的主要手段,但其無法根除白血病干細胞(Leukemia stem cells,LSCs),而LSCs是AML患者耐藥和復發的根源[3]。因此,探索新的AML治療策略是當前研究的重要課題。阿扎胞苷是一種去甲基化藥物,在低劑量下可以抑制DNA甲基轉移酶,并逆轉腫瘤抑制基因的轉錄沉默[4],可用于新診斷的老年AML患者[5]。姜黃素可抑制組蛋白去乙酰化酶并誘導腫瘤細胞凋亡,并具有對正常細胞毒副作用小的特點[6]。有研究報道,姜黃素可增強沙利度胺誘導的AML細胞凋亡作用[7]。但姜黃素是否會影響阿扎胞苷對人急性髓系白血病細胞KG-1α的增殖抑制作用尚不清楚。故本研究旨在探討姜黃素聯合阿扎胞苷對KG-1α細胞增殖抑制的作用,并進一步探討其潛在機制,為AML治療提供實驗依據。

1 材料與方法

1.1 實驗材料和儀器 人急性髓系白血病細胞KG-1α購自廣州賽庫生物公司,姜黃素、阿扎胞苷購自美國Sigma公司,RPMI-1640購自美國Gibco公司,胎牛血清購自德國PAN-Seratech公司,CCK-8試劑購自上海MedChemExpress公司,逆轉錄試劑盒、RT-qPCR試劑盒購自日本Takara公司,兔抗人CDK2、p27KIP1、γH2A.X抗體購自沈陽萬類生物,兔抗人p-AKT購自美國CST公司,Caspase-3抗體購自美國Immunoway公司,小鼠抗人β-actin抗體購自天津三箭生物公司,辣根過氧化物酶(HRP)標記山羊抗兔IgG、HRP標記山羊抗小鼠IgG、BCA試劑盒、青-鏈霉素購自上海碧云天生物技術公司,酶標儀為美國Thermo scientific公司產品,流式細胞儀為美國Beckman Coulter公司產品,凝膠成像儀為法國Vilber Lourmat公司產品。

1.2 方法

1.2.1 細胞培養 KG-1α細胞用含有10%胎牛血清、1%青-鏈霉素的RPMI-1640培養基中培養,并置于37 ℃,5% CO2的飽和濕度的孵箱中,每2～3 d傳代一次。

1.2.2 CCK-8法檢測細胞增殖 取對數生長期細胞,以3×103個/100 μL接種于96孔板中,姜黃素濃度：1、5、10、20、40 μmol/L;阿扎胞苷濃度：5、10、20、40、80 μmol/L。每個濃度設置3個復孔,藥物處理后,分別培養24、48和72 h。在各個時間點分別加入10 μL/孔 CCK-8溶液,37 ℃孵育3 h,用酶標儀檢測450 nm處的光密度(OD)值。增殖抑制率(%)=(OD對照組-OD實驗組)/(OD對照組-OD空白組)×100%。

1.2.3 流式細胞術檢測細胞周期和凋亡 取對數生長期細胞,將1×106個細胞接種于6孔板中,予以不同濃度藥物處理48 h。然后收集細胞,PBS清洗細胞兩次。對于細胞周期檢測,細胞用預冷的75%乙醇在4 ℃固定過夜,加入含RNA酶(100 μg/mL)的碘化丙啶(PI),室溫避光孵育30 min。細胞凋亡檢測：用500 μL PBS重懸細胞,加入PI和Annexin V-FITC/7-AAD各5 μL,室溫避光孵育15 min。最后,用流式細胞儀檢測細胞周期分布和凋亡情況。

1.2.4 Western blot檢測相關蛋白表達水平 用RIPA裂解液(含1 mM PMSF)提取細胞總蛋白,BCA法測定蛋白濃度后,按每孔40 μg上樣,電泳后將蛋白轉移到PVDF膜上,再用5%脫脂奶粉在室溫封閉蛋白條帶2 h,4 ℃孵育相應一抗,過夜。TBS-T洗膜3次后,條帶在室溫孵育相應二抗1 h。TBS-T洗膜3次后,用化學發光試劑進行凝膠成像。條帶灰度值用Fusion軟件分析,β-actin作為內參。

2 結果

2.1 姜黃素聯合阿扎胞苷對細胞增殖的影響 CCK-8結果顯示,姜黃素和阿扎胞苷均能抑制KG-1α細胞生長,且這種作用呈時間濃度依賴性,處理48 h后,聯合用藥組細胞增殖抑制率明顯高于對照組和各單藥組(P<0.05),見圖1。CompuSyn計算不同濃度姜黃素和阿扎胞苷的CI值結果顯示,5 μmol/L姜黃素和40 μmol/L阿扎胞苷的CI值最小,見表1。故選擇此聯合方案進行后續實驗。

表1 不同濃度姜黃素和阿扎胞苷的聯合指數

圖1 姜黃素和阿扎胞苷對KG-1α細胞增殖的影響

2.2 姜黃素聯合阿扎胞苷對細胞周期的影響 KG-1α細胞可被阿扎胞苷阻滯于G2/M期,而姜黃素對其細胞周期無明顯影響,但聯合用藥組S期細胞百分比高于對照組和各單藥組(P<0.05),見圖2。

圖2 姜黃素聯合阿扎胞苷對KG-1α 細胞周期的影響

2.3 姜黃素聯合阿扎胞苷對細胞凋亡的影響 單用姜黃素和阿扎胞苷處理48 h后,細胞凋亡率無明顯變化,而聯合用藥組的細胞凋亡率明顯高于對照組和各單藥組(P<0.05),見圖3。

圖3 姜黃素聯合阿扎胞苷對KG-1α細胞凋亡的影響

2.4 姜黃素聯合阿扎胞苷對細胞周期和凋亡相關蛋白以及AKT通路蛋白表達的影響 藥物處理48 h后,與對照組相比,聯合用藥組的p27KIP1、Caspase-3和DNA雙鏈斷裂標志物γH2A.X的蛋白表達水平顯著增高(P<0.05),而聯合用藥組的CDK2的蛋白表達水平顯著降低,同時低于姜黃素組(P<0.05);此外,聯合用藥組p-AKT表達水平也較對照組明顯降低(P<0.05),見圖4。

圖4 姜黃素聯合阿扎胞苷對細胞周期和凋亡相關蛋白以及AKT通路蛋白表達的影響

3 討論

阿扎胞苷目前主要用于骨髓增生異常綜合征和AML的治療,具有誘導細胞分化及凋亡的作用,但并非所有患者均能受益于阿扎胞苷,部分患者可出現耐藥[8]。姜黃素具有多種抗腫瘤活性,并且能逆轉細胞對化療藥物的耐藥性[9-11]。KG-1α是一種具有LSCs特性的AML細胞系,高表達CD34,缺失CD38抗原,可作為研究LSCs較好的替代模型[12]。然而,姜黃素能否增強阿扎胞苷對KG-1α細胞的影響并不明確。

本研究發現,姜黃素和阿扎胞苷可抑制KG-1α細胞增殖,并呈時間濃度依賴性。同時,我們發現藥物不同濃度組合的聯合效應也不同,部分聯合方案甚至存在拮抗效應,這可能與藥物代謝方式和作用靶點相互影響有關。經CompuSyn軟件計算可知,5 μmol/L姜黃素和40 μmol/L阿扎胞苷對KG-1α細胞增殖抑制的協同作用最明顯。

單用阿扎胞苷處理KG-1α細胞后,細胞周期主要被阻滯于G2/M期。這與Logan等[13]研究結果類似,阿扎胞苷可將人子宮內膜基質細胞阻滯于G2/M期。Deng等[14]也發現,阿扎胞苷可誘導白血病K562細胞阻滯于G2/M期。單用姜黃素處理后,KG-1α的細胞周期分布無明顯變化。而在Zhou等[15]的研究中,姜黃素可誘導AML細胞系OCI-AML5和ML-2的細胞周期阻滯于G0/G1期,這種差異可能是因為此研究使用的細胞系和姜黃素劑量與我們的不一致。本研究發現,阿扎胞苷和姜黃素共處理可將KG-1α細胞阻滯于S期,提示兩者在細胞周期方面存在協同作用,同時說明姜黃素可增強KG-1α細胞對阿扎胞苷敏感性可能和阻滯細胞周期有關。本研究結果與Shi等[16]研究結果類似,姜黃素與柚皮素聯用可通過阻滯細胞周期于S期從而抑制AML細胞系THP-1增殖。

阿扎胞苷具有去甲基化作用,可通過重新表達腫瘤抑制基因,從而促使白血病細胞死亡[17]。此外,姜黃素也有去甲基化作用,但其與阿扎胞苷的作用機制不同。阿扎胞苷可摻入DNA,與DNA甲基轉移酶DNMT1共價結合,誘導細胞凋亡[18]。姜黃素則是通過破壞DNMT1的合成,抑制酶活性,進而誘導細胞凋亡[19]。流式細胞術結果顯示,阿扎胞苷和姜黃素對KG-1α細胞凋亡無明顯影響,而當兩者聯合使用時細胞凋亡水平顯著增高,表明姜黃素與阿扎胞苷促進KG-1α細胞凋亡具有協同效應,而這種效應可能與兩者均具有去甲基化作用有關。這與Martín等[20]研究結果一致,發現姜黃素聯合阿扎胞苷可顯著促進AML細胞系(HL-60、U937)凋亡。

研究顯示,單用姜黃素和去甲基化藥物均能顯著下調白血病細胞中AKT磷酸化水平[15,21]。AKT在AML中經常被過度激活,其磷酸化是AML患者總體生存期的一個獨立預后不良因素[22]。據報道,AKT參與多種細胞生物學進程,包括細胞增殖、凋亡和血管生成[23]。CDK2能被AKT正向調節[24],當Cyclins/CDK2復合物形成受抑時,細胞周期可被阻滯于S期[25]。p27可抑制Cyclins/CDK2復合物的形成,并受到AKT的負調控[24]。此外,AKT受抑后可激活Caspase-3的表達并促進AML細胞的凋亡[26]。組蛋白H2A.X第139位絲氨酸磷酸化形成γH2A.X,γH2A.X是DNA雙鏈損傷標志物[27]。有文獻報道,AKT可負調控腫瘤細胞中H2A.X磷酸化水平進而影響細胞生存[28-29]。本研究結果顯示,姜黃素聯合阿扎胞苷可顯著下調AKT磷酸化和CDK2表達水平,上調p27KIP1、Caspase-3和γH2A.X的蛋白表達水平,表明姜黃素聯合阿扎胞苷抑制KG-1α細胞增殖可能與下調AKT磷酸化水平調控其下游分子相關。

4 結論

姜黃素聯合阿扎胞苷通過阻滯細胞周期,誘導細胞凋亡,發揮協同抗KG-1α細胞增殖的效應,這可能與調控AKT信號通路有關。本研究為姜黃素聯合阿扎胞苷治療AML,特別是耐藥和復發患者,提供了一定的實驗室依據,但其具體分子機制和作用療效還需進一步探索。