老年帶狀皰疹急性期METTL3及Gal-3表達水平對帶狀皰疹后遺神經痛的預測價值

張玉林 方啟帆 趙永明 吳澤宇 楊穎

帶狀皰疹(herpes zoster, HZ)是水痘-帶狀皰疹病毒感染侵犯神經節和皮膚引起的急性皰疹性皮膚病[1]。HZ治療后雖然皰疹已經消失,但感覺神經支配區疼痛可持續存在,對于持續3個月以上的疼痛即發展為帶狀皰疹后遺神經痛(postherpetic neuralgia, PHN),嚴重影響病人的生活質量[2]。深入研究老年PHN的疾病機制,尋找能預測老年PHN發生的血清標志物,具有重要意義。甲基轉移酶樣因子3(methyltransferase 3,METTL3)基因編碼N6甲基腺苷(N6-methyladenosine,m6A)轉移酶復合物催化亞單位,參與RNA合成、成熟和翻譯等過程,與炎癥、免疫系統疾病等關系密切[3]。研究表明,METTL3的表達下調能夠增加脊髓神經元中甲基胞嘧啶雙加氧酶1 mRNA的水平,導致炎癥疼痛時超敏反應的發生[4]。半乳糖凝集素3(galectin-3,Gal-3)是半乳糖凝集素家族成員,能夠結合β-半乳糖苷,參與先天免疫、細胞黏附和T細胞調節等生物學過程[5]。研究發現,坐骨神經內的施旺細胞中Gal-3的表達升高能夠促進巨噬細胞浸潤,導致神經病理性疼痛的發生[6]。本研究通過研究老年HZ病人在HZ急性期外周血METTL3、Gal-3的表達水平,探討其對PHN的預測價值。

1 資料與方法

1.1 研究對象 選取我院自2019年1月至2022年1月期間我院診治的190例老年HZ病人作為HZ組,其中男97例,女93例,年齡60～73歲,平均年齡(65.77±3.17)歲。病例納入標準:(1)HZ的診斷符合2018年中國醫師協會皮膚科醫師分會制定的《帶狀皰疹中國專家共識》[7];(2)年齡≥60歲,急性起病,病程<7 d;(3)病人和家屬對本研究知情同意并簽署知情同意書。排除標準:(1)合并偏頭痛等其他慢性疼痛性疾病;(2)合并獲得性免疫缺陷綜合征、系統性紅斑狼瘡等自身免疫性疾病;(3)合并精神系統疾病;(4)臨床資料不完整或失訪病例。另選取50例健康體檢的健康老年人為對照組,其中男26例,女24例,年齡60～72歲,平均年齡(65.16±3.23)歲,既往均無偏頭痛、自身免疫系統疾病等。HZ組和對照組性別、年齡比較,差異無統計學意義(均P>0.05)。本研究經本院倫理委員會審核批準通過(倫理批號:M2018CK021)。

1.2 研究方法

1.2.1 METTL3、Gal-3表達檢測:留取HZ組及對照組清晨空腹靜脈血5 mL于EDTA抗凝管中,平均分為2份,一份常溫下2000 r/min離心10 min收集上層,應用ELISA法檢測Gal-3蛋白水平,步驟按照實際和說明書進行,人Gal-3 ELISA試劑盒購自上海初態生物科技公司(貨號:CT5545)。微量紫外分光光度計Narodrop 2000購自美國賽默飛公司。另一份采用熒光定量PCR檢測外周血單個核細胞(peripheral blood mononuclear cells,PBMC)中METTL3 mRNA水平。PBMC分離方法:將EDTA抗凝的外周血按照1∶1比例加入1×稀釋洗滌液,輕柔混勻后加入單個核細胞分離液上方(分離液:稀釋全血=1∶2),1000 r/min室溫離心30 min,吸取白膜層,即PBMC層。利用Trizol法提取PBMC中總RNA。Ficoll稀釋液和分離液購自美國Sigma公司(貨號:CAS26873-85-8)。焦碳酸二乙酯(DEPC)水溶解后檢測總RNA濃度和純度,吸光度(OD)260/OD280比值介于1.8～2.1之間。將總RNA反轉錄為cDNA,反轉錄試劑盒購自北京索萊寶公司(貨號:RP1100)。應用實時熒光定量PCR檢測METTL3 mRNA的相對表達量。引物由上海生工公司設計合成。ABI 7500實時熒光定量PCR儀購自美國ABI公司。引物序列,METTL3正向:5’-CCAGCCTCAGCATAGCACCT-3’,反向:5’-ACCCCAAGGGGAGCCATAAC-3’;GAPDH正向:5’-GCTTCGGCAGCACATATACTAAAAT-3’,反向:5’-CGCTTCACGAATTTGCGTGTCAT-3’。反應程序:95℃ 5 min,95℃變性30 s,62 ℃退火30 s,72℃延伸30 s,變性退火延伸共35個循環。總體系20μL:SYBR Green Premix 10μL,上下游引物各1μL,cDNA 1μL,雙蒸水7μL。采用2-ΔΔCt法計算METTL3 mRNA的相對表達量。

1.2.2 資料收集:收集HZ組病人的臨床資料,包括病人性別、年齡、病程、發病部位(顏面部、軀干四肢部、混合型)、發病疼痛程度、帶狀皰疹分型(頓挫型或普通型、大皰型、出血型或壞疽型)及是否接受小劑量糖皮質激素治療。發病疼痛程度采用VAS進行評估,分值范圍為0～10分,分數越高表示疼痛程度越嚴重。

1.2.3 治療和隨訪分組:所有HZ病人均接受足量抗病毒藥物治療,伐昔洛韋片0.3 g/次,2次/d,連用10 d。隨訪3個月,以門診方式隨訪,當病人局部皮疹消退,疼痛持續≥3個月,同時符合美國神經病協會制定的PHN診斷標準[8],則診斷為PHN。根據HZ組病人隨訪3個月時是否發生PHN分為PHN組(n=44)和NPHN組(未發生PHN,n=146)。

2 結果

2.1 HZ組與對照組METTL3 mRNA、Gal-3水平比較 HZ組病人外周血PBMC中METTL3 mRNA相對表達量為(1.44±0.24),低于對照組(2.35±0.41),差異具有統計學意義(t=20.198,P<0.001)。HZ組病人血清Gal-3水平為(2.16±0.31)μg/L,高于對照組(1.02±0.27)μg/L,差異具有統計學意義(t=23.734,P<0.001)。

2.2 PHN組病人METTL3、Gal-3表達與VAS評分的相關性 Pearson相關分析顯示,PHN組病人METTL3 mRNA與VAS評分呈明顯負相關(r=-0.612,P<0.001),Gal-3蛋白與VAS評分呈明顯正相關(r=0.604,P<0.001)。PHN組病人METTL3 mRNA與Gal-3蛋白呈顯著負相關(r=-0.616,P<0.001)。

2.3 影響PHN發生的單因素分析 PHN組病人在HZ急性期的VAS評分、病程及血清Gal-3水平高于NPHN組,而PBMC中METTL3 mRNA表達水平低于NPHN組,差異具有統計學意義(均P<0.05)。見表1。

表1 PHN組和NPHN組病人臨床資料的比較

2.4 多因素Logistic回歸分析影響老年PHN的因素 以是否發生PHN為因變量,將表1中差異有統計學意義的指標,包括METTL3 mRNA、Gal-3蛋白、VAS評分及病程為自變量,納入多因素Logistic回歸分析,結果顯示病程、Gal-3蛋白水平是影響老年PHN發生的獨立風險因素,METTL3 mRNA是保護因素。見表2。

表2 多因素Logistic回歸分析影響老年PHN的因素

2.5 METTL3 mRNA、Gal-3蛋白對老年PHN的預測價值 METTL3 mRNA、Gal-3蛋白兩者聯合預測老年PHN的AUC為0.924,高于METTL3 mRNA、Gal-3 蛋白單項檢測(AUC=0.812、0.859),差異具有統計學意義(Z=4.312,3.363,均P<0.01)。見表3。

表3 METTL3 mRNA、Gal-3蛋白對老年PHN的預測價值

3 討論

PHN是一種神經病理性疼痛,表現為刀割樣、針刺樣及感覺異常等。PHN的發病率隨年齡的增加逐漸升高,60～65歲的老年HZ病人PHN的發病率約為20%,80歲以上老年病人的發病率達30%以上[9]。目前PHN的治療包括藥物治療、微創介入治療等,但由于老年人群是HZ的主要發病人群,常伴有基礎疾病、免疫功能降低、臨床抗病毒治療多有受限、神經系統損傷修復能力相對較差,故老年病人更易并發PHN[10]。目前認為,PHN的發生與中樞或外周致敏、神經炎癥反應及機體細胞免疫功能降低等因素有關[11]。深入研究PHN發生的機制,尋找HZ急性期的血清學標志物,有助于PHN的早期診治。

m6A是一種RNA的甲基化修飾方式,參與細胞生長、神經信號轉導等過程。研究表明,m6A修飾的異常與神經損傷后神經性疼痛癥狀的發生密切相關[12]。METTL3是m6A甲基轉移酶的“書寫者”,定位于核旁斑,參與神經系統發育過程[13]。本研究中,老年PHN病人HZ急性期外周血PBMC中METTL3 mRNA表達降低是老年HZ病人PHN發生發展的獨立風險因素。分析其原因,可能與METTL3參與調控神經系統炎癥反應有關。有學者發現,脊髓中METTL3的表達下調導致miR-365-3p前體穩定性降低,TNF-α、IL-6及IL-1β等促炎性細胞因子過度表達,促進神經損傷處巨噬細胞聚集,導致神經脫髓鞘和神經性疼痛的發生[13-14]。Zhang等[15]研究報道,METTL3的表達下調能夠促進miR-150的表達及成熟,miR-150通過抑制腦源性神經生長因子的表達,抑制Ras-絲裂原活化蛋白激酶通路的活化,減弱腦源性神經生長因子對神經元損傷的修復能力,導致PHN的發生。本研究中,METTL3 mRNA表達與VAS評分呈負相關,提示METTL3 mRNA表達降低加重病人疼痛嚴重程度。有研究顯示,脊髓神經元中過表達METTL3能夠降低甲基胞嘧啶雙加氧酶1 mRNA中m6A修飾水平及蛋白表達,減輕炎癥性疼痛及痛覺過敏等PHN癥狀[4]。提示METTL3 mRNA是評估老年PHN發生的潛在生物標志物。

Gal-3是半乳糖凝集素家族的成員,參與調節細胞黏附、炎癥免疫細胞趨化及細胞凋亡,在自身免疫性疾病、心力衰竭等疾病中發揮重要作用。本研究中,Gal-3蛋白表達升高是影響HZ病人PHN發生的獨立風險因素,提示Gal-3蛋白是新的評估老年PHN發生的標志物。分析其機制可能是Gal-3促進神經細胞的炎癥反應。研究發現,腦組織缺血再灌注損傷能誘導小膠質細胞中Gal-3表達,Gal-3以自分泌或旁分泌方式結合激活小膠質細胞表面Toll樣受體4,促進IL-1β的分泌,導致神經炎癥及神經性疼痛的發生[16]。本研究中,血清Gal-3表達與VAS評分呈正相關,表明Gal-3的表達升高加重病人疼痛程度。Takasaki等[17]發現,在脊髓背角的F4/80陽性細胞能夠分泌產生Gal-3,Gal-3通過促進細胞外信號調節激酶1/2的表達和磷酸化激活,加重HZ的疼痛程度。

本研究中,PHN組METTL3 mRNA與Gal-3蛋白呈負相關,提示兩者在老年PHN發生過程中可能存在相互作用的關系。筆者分析,METTL3能夠通過m6A調節下游微小RNA的成熟,其表達降低導致微小RNA-124的表達缺失,Gal-3 mRNA穩定性增加,Gal-3蛋白表達增加[18]。ROC曲線分析顯示,METTL3 mRNA聯合Gal-3蛋白對老年PHN的發生具有較高的預測效能,敏感度和特異度分別為80.2%和90.4%。臨床醫師可根據老年HZ病人METTL3 mRNA、Gal-3蛋白水平,對PHN發生的風險進行評估,對于高危病人予以早期診斷和治療,預防PHN的發生。

綜上所述,老年HZ病人外周血PBMC中METTL3 mRNA表達降低,血清Gal-3蛋白表達升高,兩者與VAS評分高度相關。METTL3 mRNA是影響老年PHN發生的獨立保護因素,Gal-3蛋白是風險因素,兩者聯合檢測可作為評估老年PHN發生的血清生物學指標。本研究也存在一定的不足,如樣本量有限,有待今后設計多中心臨床試驗擴大樣本量進一步研究。