細胞衰老與特發性肺纖維化藥物治療研究進展

任正肖,張穎穎,車 萍,李紫薇,朱慶均

(山東中醫藥大學實驗中心,山東中醫藥大學中醫學院微生物教研室,山東中醫藥大學中醫藥創新研究院,山東 濟南 250355)

特發性肺纖維化(idiopathic pulmonary fibrosis,IPF)是一種慢性、進行性肺組織纖維化疾病,是最常見的間質性肺病之一。IPF的病理特點是反復的肺泡上皮細胞損傷和修復失衡,肺泡上皮細胞向纖維化細胞轉化,細胞外基質(extracellular matrix,ECM)過度沉積,肺實質結構和功能逐步損傷,最終導致患者多呼吸衰竭而死亡。IPF患病率和發病率隨著年齡增長而急劇增加,大多數IPF患者確診年齡超過65歲,確診后中位生存時間僅為2～4年[1]。近年來研究發現,細胞衰老導致肺組織基質重塑和纖維化可能是IPF疾病進展的關鍵因素,與細胞衰老相關的標志端粒磨損、線粒體功能障礙、自噬不足、細胞凋亡抵抗等在IPF疾病發生和發展中發揮重要作用。深入了解細胞衰老和IPF發生發展的關系,基于細胞衰老開展IPF治療研究具有重要意義。

1 細胞衰老的分子機制

細胞衰老是機體衰老的基礎,是一種不具有增殖能力、但有生存活力的細胞生理狀態。細胞衰老的核心機制是細胞周期的不可逆停滯,衰老細胞長期存活。細胞衰老對機體有利有弊。細胞衰老在胚胎發育、傷口愈合和組織修復過程中可能是有益的。但隨著時間的推移,衰老細胞的不斷聚集,分泌衰老相關分泌表型(senescence-associated secretory phenotype,SASP),產生炎癥反應,作用于自身或其他相鄰細胞,最終導致各器官組織功能障礙、從而產生動脈粥樣硬化、器官纖維性疾病、神經退行性變等各種與老齡化相關的疾病。

端粒縮短、炎癥、DNA損傷和線粒體功能障礙等刺激可以誘發細胞衰老。當誘發因素作用于細胞時,激活DNA損傷反應,ATM和ATR被磷酸化,磷酸化的ATM和ATR激活檢查點激酶CHK1和CHK2,CHK1和CHK2轉位至細胞核激活p53,p53誘導細胞周期蛋白依賴性激酶抑制因子p21的表達,p21抑制CDK2的表達,激活視網膜母細胞瘤蛋白(retinoblastoma,Rb),Rb通過抑制轉錄因子E2F阻止細胞復制進入S期,從而阻斷細胞分裂[2]。另外INK4-ARF基因組去抑制是另一種衰老激活機制,在正常細胞中INK4-ARF基因通常被被多梳蛋白和表觀遺傳因子抑制,但當誘發因素導致其激活時,會促進ARF和p16的表達,ARF通過激活p53信號通路,從而導致細胞周期停滯,誘導細胞衰老,而p16則通過抑制周期蛋白依賴性激酶4(cyclin-dependent kinase4,CDK4)和周期蛋白依賴性激酶6(cyclin-dependent kinase6,CDK6),導致Rb磷酸化,從而抑制E2F導致復制周期停滯誘導細胞衰老。因此,這兩條衰老細胞通路相互聯系,共同促進細胞衰老發生。衰老細胞通過以自分泌或旁分泌方式分泌SASP釋放多種細胞因子,向自身或周圍細胞發出衰老信號,最終導致炎癥、免疫缺陷、纖維化和多器官功能障礙。SASP包括促炎細胞因子、生長因子、趨化因子、基質金屬蛋白酶和纖溶酶原激活劑抑制劑-1 (plasminogen activator inhibitor 1,PAI-1)等,促進成纖維細胞或巨噬細胞的促纖維化表型變化,通過正反饋通路加重炎癥反應,促使細胞衰老,最終導致纖維化、炎癥和促進組織修復等[3](Fig1)。

Fig1 The molecular mechanisms of cellular senescence

2 SASP與IPF

越來越多研究發現,SASP中多種細胞因子在IPF疾病進展中發揮重要作用。Schafor等[4]發現,輻射誘導的IPF患者衰老成纖維細胞中炎性細胞因子IL-1β、IL-6和TNF-α等蛋白表達水平升高,反過來又促進成纖維細胞激活。IPF患者血清中趨化因子CCL25、CCL28、CCL17和CCL22蛋白表達水平相比對照組明顯升高[5]。趨化因子主要介導機體的免疫反應,可能通過對肺組織發揮顯著的促炎以及免疫破壞作用,繼而加劇肺組織損傷,促進IPF的發生和發展。

SASP所含的轉化生長因子-β(transforming growth factor-β,TGF-β)是重要的促纖維化因子,具有促進傷口修復、導致炎癥細胞募集和成纖維細胞分化等生物學作用。有研究發現博來霉素缺乏誘導的IPF小鼠中TGF-β/IL-11/MEK/ERK通路被激活會導致肺上皮細胞衰老、肺上皮細胞的上皮-間充質轉化以及肺成纖維細胞中膠原蛋白沉積,從而促進IPF發生,而這些過程可以被抗IL-11或MEK抑制劑阻滯[6]。PAI-1是組織型和尿激酶型纖溶酶原激活劑tPA和uPA抑制劑,在纖維蛋白溶解中發揮重要作用。在博萊霉素誘導的IPF小鼠模型中,野生型小鼠肺上皮細胞中PAI-1表達增加,而PAI-1基因敲除小鼠肺上皮細胞中p53和p21蛋白表達量表達減少,IPF疾病程度減輕,提示PAI-1通過激活p53-p21-pRb細胞周期促進博萊霉素誘導的肺上皮細胞衰老,而上皮細胞衰老則加重了IPF[7]。

3 不同類型細胞衰老與IPF

3.1 上皮細胞衰老與IPFⅡ型肺泡上皮細胞(alveolar epithelial cells type 2,AEC2)具有干細胞活性,在肺組織損傷時向I型肺泡上皮細胞轉化,還能夠分泌肺泡表面活性物質,維持肺泡微環境。IPF患者外植體纖維化組織區域顯示出AEC2細胞耗竭,p53等細胞衰老相關的信號通路異常激活[8],表明AEC2細胞在IPF中經歷衰老。衰老的AEC2細胞可能通過分泌SASP等促進AEC2向肌成纖維細胞轉化及增加膠原的合成,最終加重IPF。衰老的AEC2細胞向其他細胞發出促纖維化信號,驅動肺成纖維細胞分化為肌成纖維細胞,最終導膠原蛋白過度沉積。

3.2 成纖維細胞衰老與IPF成纖維細胞在肺損傷修復時發揮關鍵作用。肺泡上皮細胞受損,肺成纖維細胞被激活,活化的成纖維細胞增殖并遷移到受損區域,分化成肌成纖維細胞并產生ECM,并表現出收縮性功能。堆積的肌成纖維細胞在肺損傷正常修復后逐漸變成衰老,因此減少成纖維細胞的活化并限制其纖維化進展。由此看來,衰老的肺成纖維細胞在肺損傷早期起到保護作用,因為隨著修復過程的結束衰老的肺成纖維細胞阻止ECM的沉積,促進傷口愈合。

然而,也有研究發現,隨著成纖維細胞大量衰老,衰老成纖維細胞降解ECM能力的下降,衰老的肺成纖維細胞的破壞作用增強,最終導致組織疤痕和無法修復的器官損傷。在IPF疾病進展中發揮使用抗衰老藥物去除衰老的成纖維細胞會減輕IPF小鼠的肺纖維化程度,表明衰老的成纖維細胞是不利因素,促進纖維化的進展。IPF動物模型的成纖維細胞表現出衰老表型,DNA損傷水平加重,SA-β-gal染色呈陽性,并分泌各種SASP細胞因子,從而促IPF[9]。在IPF疾病早期衰老成纖維細胞似乎是促進傷口愈合,起到肺損傷修復作用,但隨著IPF疾病進展,衰老成纖維細胞數量增多,ECM產生增加,從而促進纖維化進展,加重疾病。至于衰老的成纖維細胞在IPF疾病具體作用,需要進一步研究探討。

3.3 免疫細胞衰老與IPF免疫衰老被廣泛定義為隨著年齡的增長或過早的免疫力下降。免疫衰老或免疫系統老化是由炎癥和抗炎機制之間的不平衡引起的,衰老細胞的持續積累會引起免疫系統失調,釋放炎性細胞因子,導致炎癥積聚,同時識別病原體的能力受損,通過信號傳遞TLR級聯,呈遞抗原,吞噬異物能力也減弱。免疫衰老在肺纖維化的發病機制主要有兩種:促進衰老細胞積累,釋放SASP等多種細胞因子導致IPF;衰老免疫細胞釋放到肺微環境中的促炎介質增多,為SASP提供附加效應加劇炎癥反應。

3.3.1巨噬細胞衰老 巨噬細胞衰老會導致巨噬細胞M1/M2比值降低,釋放炎性細胞因子增多,但對清除衰老細胞無效。有研究發現,電離輻射誘導的IPF小鼠巨噬細胞中衰老相關SA-β-Gal和衰老特異性基因 (p16、p21、Bcl-2 和 Bcl-xl) 、促纖維化因子(TGF-β1和Arg-1)、促炎因子Il-6和TNF-α表達增加,SA-β-Gal衰老巨噬細胞的百分比在電離輻射小鼠肺組織的巨噬細胞中顯著增加,另外肺成纖維細胞中的纖維化表型增加[10]。蛋白酶激活受體1(protease-activated receptor1,PAR-1)也是促進IPF的關鍵調節因子。PAR-1刺激增加了體外衰老巨噬細胞聚集,巨噬細胞衰老會誘導成纖維細胞遷移、分化和膠原蛋白分泌。

3.3.2T細胞衰老 CD3+、CD4+、CD8+的初始T細胞數量隨著年齡的增長而減少,而記憶T細胞數目則逐步升高,使其對抗原的反應能力減弱。衰老的T細胞表達CD45分子增加,分泌高水平促炎細胞因子,包括TNF-α和IL-2等[11]。在衰老的T細胞會表達負反饋調節因子PD-1,減弱T細胞介導的免疫反應。CD8+T細胞對于誘導人源化小鼠肺纖維化至關重要,究其原因發現在IPF患者的CD8+T細胞中PD-1表達升高,提示靶向控制衰老T細胞將改善IPF。

4 細胞衰老相關因素與IPF

4.1 端粒縮短端粒縮短加速了衰老。端粒是短DNA序列串聯重復的區域,位于染色體的末端,可保護染色體免受侵蝕。端粒縮短被認為是細胞衰老的主要標志之一,可以觸發其它衰老相關事件,如基因組不穩定性、細胞凋亡、線粒體功能障礙等,加速細胞衰老。研究發現,IPF患者與正常對照組比較,AEC2細胞端粒長度明顯縮短和DNA損傷增加,衰老標志物p16、p21、p53等蛋白表達水平升高,導致肺組織重塑,加重IPF,因此端粒縮短可能導致細胞衰老從而促進IPF[12]。

端粒酶由端粒酶逆轉錄酶(telomerase reverse transcriptase,TERT)和端粒酶RNA (telomerase RNA Gene,TERC)兩部分組成,其功能是合成染色體DNA,維持端粒長度。編碼TERT的基因種系突變會導致端粒酶活性降低,端粒合成障礙,加速端粒縮短,被認為是導致家族性IPF的主要原因。

DNA需要與端粒結合蛋白TRF1結合促進端粒形成,因此,缺乏TRF1蛋白質可以防止端粒組裝,從而導致端粒縮短。在AEC2細胞中,編碼端粒結合蛋白TRF1基因的缺失,會導致端粒縮短,DNA損傷增加,另外調控細胞周期蛋白p21和p53蛋白表達增加,加速AEC2細胞衰老,IPF程度加重,然而,在表達膠原蛋白的細胞TRF1的缺失只會引起肺水腫,不會引起IPF[13]。這說明端粒縮短和細胞衰老之間的聯系可能僅發生在AEC2細胞中,不發生在肺成纖維細胞中,從而顯示細胞類型特異性。總之,端粒縮短似乎是促進AEC2細胞衰老和導致IPF的驅動機制。

4.2 線粒體功能障礙線粒體功能障礙是細胞衰老的重要標志之一。線粒體通過氧化磷酸化產生ATP和通過調節ROS和鈣等多種信號通路在細胞生理學中發揮多種重要作用。IPF衰老的肺泡上皮細胞中表現出與年齡相關的線粒體功能障礙。研究發現線粒體功能障礙與線粒體穩態調節因子(pTEN induced putative kinase 1,PINK1)的低表達有關,PINK1缺陷小鼠對TGF-β驅動的肺纖維化的敏感性增加[14]。PINK1是線粒體調節體內平衡的主要調節因子,當線粒體受損時,PINK1轉運到線粒體受阻,從而作用于線粒體外膜,導致自身磷酸化從而被激活,激活后的PINK1可以招募和激活下游自噬蛋白E3泛素連接酶 Parkin,促進線粒體自噬,從而改善上皮細胞的衰老,可能是限制纖維形成所必需的。

4.3 自噬不足自噬在細胞衰老中起著重要的調節作用,自噬水平不足會帶來細胞的快速衰老,提高細胞自噬水平可以一定程度上抑制細胞衰老。在IPF小鼠中同時觀察到自噬降低和細胞衰老同時發生,在IPF小鼠觀察到肺上皮細胞中調節細胞自噬水平泛素結合蛋白p62表達增加,細胞自噬水平降低,而細胞衰老標志物p21表達增加。該研究提示自噬水平降低加速肺上皮細胞衰老,而肺上皮細胞衰老則導致肺纖維化程度加重,在IPF疾病中發揮重要作用[15]。

衰老導致的壓力性反應通過激活肺成纖維細胞中的雷帕霉素靶蛋白(mammalian target of rapamycin,mTOR)減少自噬,促進肌成纖維細胞分化,從而導致IPF發生,靶向PI3K/AKT/mTOR信號通路的雷帕霉素治療改善IPF成纖維細胞中饑餓誘導的自噬[16]。在IPF患者中發現自噬表達水平受到抑制和細胞衰老,而增加自噬水平可以改善細胞衰老,但是自噬和細胞衰老以及IPF之間具體機制,有待于進一步研究。

4.4 細胞凋亡抵抗細胞凋亡是一種自主有序的死亡,在維持體內平衡方面具有重要作用。細胞凋亡抵抗是細胞衰老的重要特征。在IPF衰老成纖維細胞中發現抗凋亡蛋白B淋巴細胞瘤-2(b-cell lymphoma-2, BCL-2)家族蛋白表達增加,而促凋亡蛋白Bak和Bax則表達水平顯著降低[17]。低表達的PTEN通過PTEN/AKT依賴途徑導致轉錄激活因子FoxO3a失活,然后下調Cav-1和Fas基因的表達,從而抑制IPF成纖維細胞凋亡[18]。

5 基于細胞衰老的IPF治療研究進展

5.1 上市藥物抗細胞衰老吡非尼酮和尼達尼布作為抗纖維化靶向藥物,在治療IPF疾病中發揮重要作用,已經廣泛應用于臨床,但是由于它只能治療IPF,但不能逆轉疾病,具有一定局限性。有研究發現,吡非尼酮可以抑制TGF-β誘導的肺上皮細胞和成纖維細胞的增殖和衰老,Wnt/β-catenin TGF-β非經典途徑作為IPF疾病中細胞衰老的驅動因子[19],通過抑制下游信號分子SBE激活,增加了衰老標志物p21和p16的表達,從而促進細胞衰老。而吡非尼酮通過抑制β-連環蛋白激活來延緩細胞衰老,從而治療IPF。而尼達尼布可以通過促進自噬來治療IPF疾病,但是關于其通過抗衰老途徑治療IPF疾病尚未見報道。

5.2 治療IPF的潛在抗衰老化合物

5.2.1促進自噬抗衰老藥物 有研究發現,在博來霉素誘導的IPF中,使用亞精胺處理的肺泡上皮細胞衰老相關的SA-β-gal染色和p16和p21的表達降低,表明亞精胺改善博來霉素誘導的細胞過早衰老和IPF。為了進一步探究表亞精胺防止細胞衰老和IPF的具體機制,研究進一步發現在IPF誘導的纖維化肺組織中通過激活關鍵自噬分子表達形成自噬體,導致自噬水平增高,同時,亞精胺也抑制PI3K/AKT信號的下游介質mTOR,這些數據證實亞精胺通過激活IPF成纖維細胞中的自噬改善IPF[20]。

5.2.2促進細胞凋亡抗衰老藥物 ABT-263是抗凋亡蛋白BCL-2和BCL-xL的特異性抑制劑,該藥物被證明具有抗衰老和抗纖維化的特性,具有逆轉與年齡相關的纖維化疾病的潛力[21]。ABT-263能夠殺死衰老的成纖維細胞和衰老的上皮細胞,并且在體外能有效抑制SASP的表達。

SSK1是一種清除衰老細胞的特異性化合物,在博來霉素誘導的肺損傷中SSK1被β-gal特異性激活,并通過活化p38 MAPK信號通路誘導細胞凋亡從而有效清除衰老細胞,減少了衰老和年齡相關的基因特征,減弱了局部和全身炎癥,改善了IPF[22]。

槲皮素屬于黃酮類化合物,具有抗衰老作用。有研究發現,槲皮素通過上調IPF成纖維細胞中FasL受體和caveolin-1的表達并抑AKT的激活,下調肺衰老標志物p21和p19-ARF的表達,逆轉了博來霉素誘導的IPF、降低了老年小鼠的致死率,該研究說明槲皮素可能通過調節細胞凋亡受體來促進細胞凋亡,從而清除衰老細胞和改善IPF[23]。槲皮素療法最近已被證明可以消除衰老肺泡上皮細胞和成纖維細胞細胞,并減少IPF。鑒于IPF肺部的AEC2細胞數量較少,消除衰老的AEC2細胞可能阻止肺組織修復。因此,具體靶向衰老肌成纖維細胞可能是一種更具選擇性治療IPF的策略。

5.2.3抑制SASP抗衰老藥物 抑制SASP的化學物質或藥物可以調節衰老細胞的活性和功能而不誘導其凋亡。STAT3的特異性抑制劑STA-21可減弱IL-6的產生,降低p21水平,減少與衰老相關的β-gal積累,并恢復正常的線粒體功能[24]。間接抑制SASP的途徑也成為治療IPF的潛在靶點。例如,雷帕霉素通過直接抑制mTOR途徑導致SASP產生減少,炎性細胞因子分泌降低,從而延緩細胞衰老進程,已經被證明在IPF疾病中具有治療作用[25]。

5.3 間質干細胞抗衰老近年來,越來越多臨床研究發現,異體注射間充質干細胞可能逆轉肺纖維化和細胞衰老,在與衰老相關的呼吸系統疾病慢性肺病、IPF等年齡相關性疾病中發揮重要作用。目前間充質干細胞來源廣泛,可以從多種結締組織(骨髓、脂肪和肌肉等)中分離獲取。間充質干細胞抗衰老的機制主要是具有自我分化與不斷更新的能力,可以源源不斷的補充新細胞,另外還能夠在衰老部位分泌多種生長因子,將新產生的細胞轉移到受損組織處,代替衰老細胞,發揮抗纖維化、抗炎、抗凋亡等作用。Huang等[26]發現,注射間充質干細胞的博來霉素誘導的大鼠肺纖維化模型組織中超氧化物歧化酶活性和抗氧化能力顯著增加,AEC2細胞標志物的表面活性蛋白C表達升高,IPF程度明顯減輕,該研究說明間充質干細胞可以分化為正常功能的肺泡上皮細胞,代替衰老的細胞,通過阻斷氧化應激發揮抗IPF作用。

6 總結

IPF是一種嚴重危及生命的疾病,死亡率和致殘率高,細胞衰老相關的誘發因素端粒縮短、線粒體功能障礙、自噬不足、抗細胞凋亡等在IPF發生發展中發揮重要作用,清除衰老細胞、阻斷SASP是治療IPF的新手段,目前針對IPF開展的抗衰老藥物和間質干細胞冶療多處于臨床前階段,這些研究為防治IPF帶來了新的希望。