天然產物通過抑制PI3K信號通路抗肝纖維化的研究進展

朱武嫦,莫孝成,蘇宏梅,韋錦斌

(廣西醫(yī)科大學藥學院藥理學教研室,廣西 南寧 530021)

肝纖維化是肝損傷到肝硬化甚至肝細胞癌(hepatocellular carcinoma,HCC)的重要過程,嚴重威脅著人類的身體健康。據(jù)估計,中國有多達700萬人患有肝硬化,而肝硬化可發(fā)展為HCC,目前HCC已成為最常見的癌癥之一,發(fā)病率為4.7%,死亡率為8.3%[1]。肝臟移植手術是終末期肝硬化最有效的治療手段,但手術費用高且存在諸多并發(fā)癥。而HCC雖然可以通過手術治療,但術后復發(fā)率高,預后不良。因此,在肝纖維化尚未發(fā)展致肝硬化甚至HCC之前采取有效措施預防和治療肝纖維化是一個重要的環(huán)節(jié)。

肝星狀細胞(hepatic stellate cells,HSCs)在肝纖維化發(fā)生發(fā)展中起著重要作用。在生理條件下,HSCs處于靜止狀態(tài),含有類維生素A脂滴。慢性病毒感染、酒精成癮和非酒精性脂肪性肝炎等反復損傷導致的炎癥反應和氧化應激,能夠使靜止的HSCs轉化為激活的HSCs,激活的HSCs轉化為肌成纖維細胞,產生大量的膠原蛋白并表達α-平滑肌肌動蛋白(α-smooth muscle actin,α-SMA),導致細胞外基質(extracellular matrix,ECM)進行性積累。此外,與靜止的HSCs相比,激活的HSCs具有更強的遷移能力,這在肝纖維形成中也發(fā)揮了關鍵作用[2]。因此,抑制炎癥反應和氧化應激,從而減少HSCs的激活是一種抗肝纖維化的有效策略。HSCs的激活對肝纖維化的影響一直是研究者關注的焦點,并且已經取得了一定的進展。此外,研究表明,激活的HSCs凋亡也是HSCs消退的機制之一,誘導激活的HSCs發(fā)生凋亡已成為抗肝纖維化治療的突破口[18]。磷脂酰肌醇-3-激酶(phosphatidylinositol-3-kinase,PI3K)是一種胞內脂質激酶家族的成員,廣泛表達于多種細胞和組織中,參與多種生物學功能的調控。研究表明,PI3K信號通路參與調節(jié)肝纖維化的炎癥反應、氧化應激和凋亡,其持續(xù)激活與肝纖維化密切相關。異常激活的PI3K信號通路可導致肝脂肪變性、肝腫大、纖維化和HCC。與之相反,抑制PI3K信號通路導致HSCs活化、增殖、遷移減少,ECM沉積減少[3]。由此可見,靶向抑制PI3K信號通路可能是抗肝纖維化的有效策略。然而,目前臨床上仍缺少通過抑制PI3K信號通路發(fā)揮抗肝纖維化的藥物,故針對靶向PI3K信號通路的化合物進行深入研究具有重要的意義。

天然產物一直是藥物研究和開發(fā)的重要來源。天然產物中提取的黃酮類和萜類化合物具有多種生物活性,包括抗炎、抗氧化、調節(jié)凋亡、抗纖維化,并能夠通過靶向PI3K信號通路發(fā)揮抗肝纖維化作用。本文就PI3K信號通路在改善肝纖維化中的作用進行綜述,并總結了近年來通過抑制PI3K信號通路改善肝纖維化的天然產物的研究,以期為抗肝纖維化天然藥物的開發(fā)提供參考。

1 PI3K信號通路在減輕肝纖維化中的作用

1.1 PI3K信號通路PI3K信號通路由PI3K、絲/蘇氨酸蛋白激酶(serine/threonine specific protein kinase,AKT)和下游的效應分子組成。PI3K是一組與質膜相關的脂質激酶,能夠使質膜上磷脂酰肌醇的3-OH基團發(fā)生磷酸化。根據(jù)結構和特定底物的不同,PI3K分為3類:Ⅰ類、Ⅱ類、Ⅲ類。Ⅰ類PI3K的生物學功能最為廣泛,因而被研究得最徹底。I類PI3K由IA類(PI3Kα,PI3Kβ和PI3Kδ)和IB類(PI3Kγ)組成。IA類PI3K是一種具有p85調控亞基和p110(α,β和δ)催化亞基的異源二聚體。IB類PI3K由調控亞基p101和p87以及催化亞基p110γ組成。生理條件下,PI3K信號通路可被多種細胞外信號刺激,包括細胞因子、活性氧(reactive oxygen,ROS)、生長因子和激素等。以上細胞外信號主要通過激活受體酪氨酸激酶(receptor tyrosine kinase,RTK)和G蛋白偶聯(lián)受體(G protein-coupled receptors,GPCR)激活PI3K信號通路[4]。AKT亞型(AKT1,AKT2和AKT3)作為PI3K信號通路的下游關鍵分子,在PI3K介導的信號轉導中發(fā)揮重要作用。AKT包含3個結構域,PH結構域、中心絲氨酸/蘇氨酸催化區(qū)和羧基末端調控區(qū)。AKT通過PH結構域與磷脂酰肌醇-3,4,5-三磷酸結合,進而從細胞質轉移到細胞膜上,在磷酸肌醇依賴性蛋白激酶1(3-phosphoinositide-dependent protein kinase 1,PDK1)和雷帕霉素機械靶蛋白復合物2(mechanistic target of rapamycin complex 2,mTORC2)的催化下,其激酶結構域(蘇氨酸308)和羧基端調控結構域(絲氨酸473)磷酸化而被激活[5]。活化的AKT可以正或負調節(jié)下游蛋白,如核因子-kappa B(nuclear factor-kappa B,NF-κB)、還原型煙酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸氧化酶(nicotinamide adenine dinucleotide phosphate oxidases,NOXs)、B-細胞淋巴瘤因子-2(B-cell lymphoma-2,Bcl-2)、含半胱氨酸的天冬氨酸蛋白水解酶9(cysteinyl aspartate specific proteinase 9,caspase 9)和雷帕霉素機械靶蛋白(mechanistic target of rapamycin,mTOR)等。

PI3K/AKT通過調控下游效應分子參與炎癥反應、氧化應激、凋亡等細胞過程(Fig1)。近年研究表明,PI3K與肝纖維化的發(fā)生密切相關,孫芳芳等[6]采用免疫組化法對乙肝肝纖維化患者肝組織的PI3K蛋白表達量進行分析,發(fā)現(xiàn)隨著肝纖維化分期增大,PI3K蛋白的表達量增多。Huang等[7]對慢性丙肝患者肝臟組織進行免疫組化染色,發(fā)現(xiàn)AKT蛋白高表達與晚期肝纖維化相關,提示肝纖維化可能與PI3K信號通路的激活有關。因此,靶向PI3K信號通路可能是抗肝纖維化的有效策略。

Fig1 PI3K signaling pathway

1.2 抑制PI3K信號通路有利于降低肝纖維化炎癥反應炎癥細胞、炎癥細胞因子和趨化因子在肝纖維化的發(fā)病機制中起著至關重要的作用。損傷誘導的炎癥反應可觸發(fā)炎癥細胞向肝臟募集,產生細胞因子和趨化因子激活HSCs。例如,在受損的肝臟中,Kupffer細胞和HSCs分泌C-C基序趨化因子配體2,招募單核細胞來源的巨噬細胞到肝臟并釋放炎癥細胞因子驅動HSCs活化,從而促進膠原形成[8]。另有研究報道,炎癥因子白介素6(interleukin-6,IL-6)或IL-1β基因缺失可減輕肝纖維化的進展[9],這提示炎癥因子與肝纖維化密切相關。此外,C-C基序趨化因子受體2/5拮抗劑cenicriviroc治療也可改善肝纖維化[8]。以上研究表明,減輕纖維化肝臟的炎癥反應可能是治療肝纖維化的有效策略。

PI3K是與炎癥反應相關信號級聯(lián)的重要介質。PI3K/AKT信號通路的激活可增加炎性細胞因子腫瘤壞死因子α(tumor necrosis factor-α,TNF-α)、IL-1β和IL-6的分泌,引起組織基質金屬蛋白酶抑制劑-1(tissue inhibitor of metalloproteinases-1,TIMP-1)、基質金屬蛋白酶-2(matrix metalloproteinase-2,MMP-2)、MMP-9、α-SMA、I型膠原蛋白(collagen type-I,COL-1)、COL-3表達失衡并與肝纖維化的程度密切相關[10]。與之相反,siRNA介導的AKT2沉默顯著抑制了細胞炎癥標志物TNF-α和IL-1β的mRNA水平,抑制了HSCs增殖、遷移和HSCs中α-SMA,COL-1的生成[11]。類似的,HSCs能夠自分泌CXC基序趨化因子配體1,從而促進其激活,而抑制PI3K/AKT信號通路可以減少CXC基序趨化因子配體1的自分泌,從而減少HSCs的激活,減輕肝纖維化[12]。因此,PI3K/AKT通路可能是改善肝纖維化炎癥的潛在靶點。

1.3 抑制PI3K信號通路能夠降低肝纖維化氧化應激反應氧化應激是指體內氧化與抗氧化作用失衡的一種狀態(tài),是導致肝損傷和啟動肝纖維化的關鍵環(huán)節(jié)之一。當機體受到內、外不良刺激作用時,ROS產生過多,超過機體的抗氧化能力,氧化與抗氧化系統(tǒng)之間嚴重失衡從而導致細胞和組織出現(xiàn)損傷。肝臟易受到ROS的攻擊,從而引起氧化應激介導的肝損傷。線粒體和NOXs是細胞ROS的主要來源。在膽管結扎術小鼠模型中,敲除NOX1能夠降低氧化應激水平從而減輕肝臟損傷和纖維化[13]。實驗表明,ROS可參與HSCs的激活,誘導HSCs增殖和膠原蛋白合成。ROS介導的氧化應激小鼠模型中,TIMP-1表達明顯增加,肝臟形態(tài)學改變顯示膠原沉積增加。此外,體外HSCs和使用砷刺激的氧化應激肝細胞(ROS水平升高)共培養(yǎng)模型表明,氧化應激的肝細胞能夠促進HSCs的激活[14]。

PI3K信號通路與細胞的氧化應激水平密切相關。研究發(fā)現(xiàn),損傷啟動PI3K/AKT信號通路和蛋白激酶C的激活,導致NOXs的激活和ROS的產生,而抑制PI3K信號通路能夠降低氧化應激水平。例如,Jee等[15]研究發(fā)現(xiàn)與野生型小鼠成纖維細胞相比,沉默了AKT基因的AKT1-/-細胞中ROS生成減少。當暴露于氧化應激時,PI3K信號通路抑制劑可上調多種細胞抗氧化因子的表達,如使用BYL-719選擇性抑制 PI3K的p110α亞型可增加抗氧化基因的表達,如核因子E2相關因子2、過氧化氫酶、超氧化物歧化酶1和超氧化物歧化酶2[16]。這表明抑制PI3K信號通路降低氧化應激水平可能是抗肝纖維化的作用機制之一,然而目前尚缺乏直接表明抑制PI3K信號通路降低氧化應激水平進而改善肝纖維化的研究。

1.4 抑制PI3K信號通路能夠誘導HSCs凋亡HSCs的凋亡是一個復雜的過程,涉及多種分子機制和多種因素,包括死亡受體介導途徑(FAS或TRAIL)的激活、Caspase-3、Caspase-8和Bcl-2關聯(lián)X蛋白(Bcl-2 associated X,Bax)的激活以及抗凋亡蛋白Bcl-2 xL(Bcl-2 extra large,Bcl-xL)、Bcl-2的下調等。HSCs的凋亡被認為是緩解肝纖維化的機制之一,誘導活化的HSCs發(fā)生凋亡有助于肝纖維化的自發(fā)消退。PI3K/AKT通路主要通過影響B(tài)cl-2家族等凋亡相關因子參與凋亡的調控過程。PI3K/AKT信號通路激活可直接磷酸化Bcl-2相關死亡啟動子(Bcl-2 associated death promoter,Bad)的Ser136位點介導Bad和Bcl-xL之間的相互作用,維持了線粒體的完整性并阻止細胞色素C外流從而抑制細胞凋亡。PI3K/AKT信號通路還可以激活Bcl-2和抑制Bax從而促進細胞存活,故抑制PI3K通路則可誘導HSCs凋亡。例如,研究者在激活的HSCs中加入PI3K/AKT通路抑制劑,結果顯示阻斷PI3K/AKT通路可上調cleaved caspase-9、cleaved caspase-3水平,增加HSCs線粒體中細胞色素C的釋放,提示抑制PI3K信號通路可誘導HSCs凋亡[17]。另有研究報道,在人HSCs(LX-2細胞)中,眼鏡蛇毒可以抑制PI3K/AKT信號通路,促進LX-2細胞凋亡,改善肝纖維化[18]。以上結果表明,抑制PI3K信號通路可以誘導HSCs凋亡,具有此作用的化合物可能成為抗肝纖維化的潛在藥物。

2 天然產物靶向抑制PI3K信號通路有利于改善肝纖維化

近年來,對天然產物的研究取得了顯著的進展。據(jù)報道,多種天然產物可以調節(jié)肝纖維化。黃酮類和萜類化合物廣泛存在于天然產物中,許多研究表明黃酮類和萜類化合物具有通過抑制PI3K信號通路抗纖維化的特性。因此,本文將對黃酮類和萜類化合物的抗肝纖維化作用及與PI3K信號通路相關的潛在機制進行總結(Tab1)。

Tab1 The therapeutic effect of flavonoids and terpenoids against liver fibrosis

2.1 黃酮類化合物黃酮類化合物廣泛存在于天然來源的植物中,且存在多種藥理學活性,如抗炎、抗氧化、調節(jié)細胞異常凋亡、調節(jié)脂質代謝等。研究發(fā)現(xiàn),黃酮類化合物能夠有效改善肝臟疾病,包括急性肝損傷,脂肪肝等。臨床上使用的水飛薊賓就是一種黃酮類化合物,可用于肝纖維化的治療,說明黃酮類化合物具有開發(fā)成抗肝纖維化藥物的潛力。本文總結了通過抑制PI3K信號通路改善肝纖維化的黃酮類化合物,主要包括千層紙素A、柚皮苷、漢黃芩苷和高良姜素等。

2.1.1千層紙素A 千層紙素A(oroxylin A,OA)主要來源于黃芩的根,是一種天然黃酮類化合物。OA在大鼠體內代謝為千層紙素A-7-O-葡萄糖醛酸苷(oroxylin A-7-O-glucuronide,OG)和千層紙素A磺酸鈉。除胃和腸外,OA及其兩種代謝物在大鼠體內主要分布于肝、腎。而與代謝產物相比,OA在組織中的分布更為廣泛。Shen等[19]發(fā)現(xiàn),在四氯化碳誘導的小鼠中毒性肝纖維化模型中,OA能夠下調肝纖維化炎癥標志物,包括IL-1β、IL-6、IL-18、TNF-α和干擾素γ(interferon,IFN-γ)等的表達,降低肝臟炎癥反應進而抑制肝纖維化。此外,OA還可降低從四氯化碳誘導的小鼠中毒性肝纖維化模型中分離出的HSCs中ROS和升高谷胱甘肽的含量抑制氧化應激。進一步機制研究發(fā)現(xiàn),OA可顯著抑制PI3K、AKT和mTOR磷酸化蛋白的表達,但不抑制其mRNA水平,表明OA可能是通過轉錄后調控的方式下調PI3K/AKT /mTOR信號通路進而抑制炎癥反應和氧化應激。

2.1.2柚皮苷 柚皮苷(naringin)是一種黃酮苷,存在于柑橘類水果和葡萄果實中。柚皮苷主要分布于胃腸道、肝、腎、肺和氣管。El-Mihi等[20]使用硫代乙酰胺誘導大鼠中毒性肝纖維化模型,發(fā)現(xiàn)柚皮苷能夠抑制PI3K信號通路,增加抗氧化因子表達并減少炎癥細胞因子產生。同時柚皮苷可降低肝組織中膠原沉積及α-SMA和纖維連接蛋白的表達。此外,柚皮苷還可誘導HSCs凋亡。由此可見,柚皮苷能夠抑制硫代乙酰胺引起的肝纖維化,其作用機制可能是抑制PI3K信號通路。

2.1.3漢黃芩苷 漢黃芩苷(wogonoside)是從黃芩根中提取的一類黃酮類化合物。Wang等[21]發(fā)現(xiàn),漢黃芩苷能夠降低四氯化碳誘導的大鼠中毒性肝纖維化模型中門冬氨酸氨基轉移酶、丙氨酸氨基轉移酶的水平,減輕肝損傷。除了保護肝臟的特性,漢黃芩苷具有明確的抗炎和抗肝纖維化的特性。例如,漢黃芩苷可降低纖維化肝臟中TGF-β、MMP-2、MMP-9的表達,逆轉四氯化碳誘導的膠原沉積,表明漢黃芩苷能夠緩解肝纖維化。另有研究發(fā)現(xiàn),漢黃芩苷可降低PI3K、AKT、mTOR和p65蛋白的磷酸化水平,證實了其對PI3K/AKT/mTOR和NF-κB通路有抑制作用。

2.1.4高良姜素 高良姜素(galangin)是一種從高良姜根莖中分離得到的3,5,7-三羥基黃酮,研究表明高良姜素能逆轉TGF-β1誘導的COL-1和ɑ-SMA的表達,誘導LX-2細胞凋亡。進一步研究發(fā)現(xiàn),高良姜素可通過抑制PI3K/AKT信號通路、Wnt/β-catenin信號通路和誘導Bax/Bcl-2信號通路改善肝纖維化[22]。因此,作為一種來自食物來源的有益化合物,高良姜素有望成為一種有效的抗肝纖維化藥物。

2.2 萜類化合物萜類化合物是以異戊二烯單元為基本結構單元的化合物。有文獻報道,部分萜類化合物具有抗肝纖維化的作用,其中積雪草酸,黃芪甲苷,吉馬酮,葫蘆素E,莪術醇能夠抑制PI3K信號通路,發(fā)揮抗炎,抗氧化應激和調節(jié)細胞凋亡的作用。

2.2.1積雪草酸 積雪草酸(asiatic acid)從積雪草中分離得到,具有五環(huán)三萜結構。研究顯示其具有抗炎、抗氧化和保護肝臟的作用。積雪草酸對四氯化碳誘導的大鼠慢性肝損傷有保護作用。研究發(fā)現(xiàn),積雪草酸能提高超氧化物歧化酶、谷胱甘肽過氧化物酶等抗氧化酶活性,降低丙二醛水平。此外,積雪草酸可以通過降低血清中透明質酸酶、層粘連蛋白、III型前膠原和COL-IV的含量和降低TIMP-1、TIMP-2 mRNA表達水平從而減輕肝纖維化。進一步機制研究發(fā)現(xiàn),積雪草酸通過抑制PI3K/AKT/mTOR信號通路抑制肝纖維化的發(fā)展[23]。由于積雪草酸溶解性差、代謝速度快,故其生物利用度低。另據(jù)報道,納米脂質載體修飾的積雪草酸也具有抗肝纖維化的作用,其生物利用度較原型積雪草酸而言較高[24]。

2.2.2黃芪甲苷 黃芪甲苷(astragaloside IV)是從黃芪中分離得到的環(huán)馬烷型三萜苷。Wei等[25]發(fā)現(xiàn)黃芪甲苷具有抗氧化和抗炎進而改善肝纖維化的特性。機制研究表明,黃芪甲苷可下調四氯化碳誘導的小鼠中毒性肝纖維化模型肝臟組織中p-PI3K/PI3K、p-AKT/AKT和p-mTOR/mTOR的比例。因此,黃芪甲苷的抗纖維化活性可能與抑制PI3K/AKT/mTOR信號通路有關。也有報道稱黃芪甲苷主要通過抑制HSCs增殖和膠原合成來減輕豬血清誘導的大鼠免疫性肝纖維化[26]。

2.2.3吉馬酮 吉馬酮(germacrone,GM)是一種從姜黃中分離得到的倍半萜,對蛋氨酸和膽堿缺乏飲食誘導的代謝性肝纖維化具有治療潛力[27]。Ji等[28]研究表明,吉馬酮能改善四氯化碳介導的中毒性肝纖維化。此外,在轉化生長因子(transforming growth factor β,TGF-β)誘導的LX-2細胞中,吉馬酮可抑制HSCs的活化、增殖和誘導凋亡。機制研究表明,吉馬酮通過PI3K/AKT/mTOR信號通路改善肝纖維化。

2.2.4葫蘆素E 葫蘆素E(cucurbitacin E)是一種存在于葫蘆科植物中的三萜化合物。在血漿和人肝微粒體中,葫蘆素E水解為葫蘆素I。該化合物對活化的大鼠HSCs(T-6細胞)的存活和增殖有負向調節(jié)作用。Wu等[29]發(fā)現(xiàn),葫蘆素E可誘導活化的T-6細胞凋亡,抑制α-SMA、TIMP-1和COL-1的表達,改善肝纖維化。進一步的研究證明,葫蘆素E的作用機制與抑制PI3K/AKT/mTOR/p70S6K信號通路和激活AMPK信號通路有關,此作用在硫代乙酰胺誘導的小鼠中毒性肝纖維化模型中也得到了驗證。

2.2.5莪術醇 莪術醇(curcumol)是一種愈創(chuàng)木烷型倍半萜。已有文獻表明,莪術醇具有抗炎、抗肝纖維化等特性。研究表明,在活化的T-6細胞中,莪術醇能夠增加Caspase-3活性,提高cleaved Caspase-3和PARP裂解片段表達,抑制Bcl-2和Bcl-xL表達,具有促凋亡活性。有趣的是,莪術醇對細胞凋亡的影響與抑制PI3K和NF-κB通路有關[30]。這些數(shù)據(jù)表明,莪術醇具有治療肝纖維化的潛力。

3 展望

肝纖維化是一個多環(huán)節(jié)、多因素共同作用的復雜病理過程。越來越多的研究證實,抑制PI3K信號通路,進而改善炎癥反應、氧化應激和誘導HSCs凋亡能夠減輕肝纖維化。這表明靶向PI3K信號通路可能是對抗肝纖維化的一種有效策略。天然產物活性成分因其具有安全性高,有效性良好等獨特優(yōu)勢被廣泛地用于肝臟疾病的防治,其中對黃酮類和萜類化合物的開發(fā)研究更是成為當前抗肝纖維化領域的熱點。這些天然產物活性成分可通過抑制PI3K信號通路降低炎癥反應、氧化應激水平和誘導HSCs凋亡,進而減輕肝纖維化。然而,盡管這些天然產物中提取的黃酮類化合物和萜類化合物在體內和體外模型中顯示出明顯的抗肝纖維化優(yōu)勢,但仍存在一些不足。例如,生物利用度低、缺乏藥代動力學參數(shù)等。此外,由于基礎實驗研究與臨床療效之間存在差距,仍需要進一步的臨床試驗來確定PI3K抑制劑治療肝纖維化的安全性和有效性。總之,基于天然產物活性成分抗肝纖維化藥物的開發(fā)和應用充滿了希望和挑戰(zhàn),進行更廣泛和深入的研究對確定這些化合物治療肝纖維化的潛力具有重要意義。