高原寒冷環境豬腹部腸管火器貫通傷后彈道細菌變化及藥敏分析

屈金權,李佳佳,楊欣悅,孫 赳,梁飛行,宋來陽,靳向輝,劉江偉

1.石河子大學醫學院,新疆 石河子 832000; 2.新疆軍區總醫院新疆特殊環境醫學重點實驗室,烏魯木齊 830000; 3.新疆公安廳特警總隊訓練基地,烏魯木齊 830000

高原是指海拔高于2500 m的地區,多位于我國西部,其具有低壓、低氧、寒冷等特點。高原地區發生火器傷后較平原地區對機體的損傷更加嚴重[1]。腹部在火器傷受傷部位中占比高[2-3],易發生腹腔出血以及嚴重感染導致死亡[4]。高原地區環境惡劣,救治相關設施落后及運輸不便,均會導致高原寒冷地區腹部火器傷的救治更加困難[5]。目前高原地區火器傷的研究較少,且多集中于四肢及顱腦損傷,其傷道細菌學研究表明高原地區細菌生長緩慢,感染發生時間較平原地區晚[6]。但對于高原寒冷環境腹部腸管火器貫通傷后彈道細菌學的研究尚未見報道。高原寒冷環境腹部腸管火器貫通傷后大量腸道細菌隨腸液涌入彈道,此時彈道入口及出口的感染時限是否較平原地區晚,細菌繁殖情況以及造成感染的細菌種類和藥敏情況均是此類創傷救治時所需參考的重要內容。本研究在高原寒冷環境腹部腸管火器貫通傷豬模型建立的基礎上通過觀察實驗豬的彈道情況,采集彈道組織細菌培養計數,分離純化細菌進行藥敏實驗,為高原寒冷環境腹部腸管火器貫通傷的清創救治時限、抗生素的應用提供理論基礎。

材料與方法

1 實驗動物

普通清潔級雄性長白仔豬20只,2～3個月齡,體重30～35 kg,購于新疆泰昆農牧科技有限責任公司,檢疫合格證明(NO.9001068323);實驗豬送達后將其預飼于新疆軍區總醫院動物實驗科大型動物飼養間[SYXK(軍)2017-0049],環境溫度(26.3±3.6)℃,相對濕度(46±18)%。本實驗經新疆軍區總醫院醫學倫理委員會批準(IACUC-DWLL20190314),實驗過程符合動物福利3R原則。

2 主要試劑與儀器

硫酸阿托品(天津金耀,批號:2205101);鹽酸氯胺酮注射液(江蘇恒瑞,批號:11020BL);質譜樣品處理機制溶液[梅里埃診斷產品(上海)有限公司,法國;批號1009574160];哥倫比亞血瓊脂平板(常德比克曼生物科技有限公司,批號20230115);MH(Mueller-Hinton)瓊脂培養基(江門市凱林貿易有限公司,中國;批號230204);藥敏試紙直徑為6 mm,規格為:氨芐西林(10 μg/片)、青霉素(10 μg/片)、亞胺培南(10 μg/片)、四環素(30 μg/片)、頭孢他啶(30 μg/片)、氧氟沙星(5 μg/片)、阿奇霉素(15 μg/片)、慶大霉素(120 μg/片),上述產品均購自于常德比克曼生物科技有限公司(批號20221216);全自動微生物質譜檢測系統(VITEK MS,bioMerieux,法國);恒溫培養箱(寧波江南儀器廠);西北特殊環境人工實驗艙(貴州風雷)。

3 實驗方法

3.1模型建立 實驗豬送達后,平原常溫環境適應性飼養3～5 d,按照隨機數字法將20只實驗豬分為高原寒冷組(HC組)及平原常溫組(LN組),每組10只。HC組模型:將實驗豬放置于西北特殊環境人工實驗艙內,調節實驗艙海拔高度6 000 m[7](大氣壓47.33 kPa,空氣氧分壓為9.87 kPa),溫度10 ℃,相對空氣濕度20%～25 %,達到6 000 m海拔高度后飼養48 h,致傷前12 h禁食,6 h禁水,其余時間自由食水。暴露完成后立即將實驗豬置于靶場。使用0.05 %硫酸阿托品注射液0.04 mg/kg+5%鹽酸氯胺酮注射液20 mg/kg對豬耳后頸部肌肉注射麻醉,將豬呈肢體下垂的“懸空站立位”懸吊于靶場鐵架上,暴露右側腹部,于髂前上棘前方3 cm,腹中線靠背側3 cm交界處標記射擊點,用手槍距離實驗豬約2 m處瞄準射擊標記點,完成造模。LN組將實驗豬放置于海拔800 m[8](實驗室所在地烏魯木齊海拔,大氣壓89.87 kPa,空氣氧分壓為18.8 kPa),溫度25 ℃,相對空氣濕度20%～25 %的環境中48 h,按上訴相同方法建模。模型建立成功后取下實驗豬簡單包扎后由救護車轉運回實驗室,HC組與LN組均放置于常溫環境(海拔800 m,溫度25 ℃,相對空氣濕度20%～25 %)中觀察。體溫采集使用水銀溫度計插入豬肛門深度約5 cm測肛溫5 min讀數。

3.2細菌培養及鑒定 分別在2、4、8、12、24 h時間點使用無菌組織剪剪取距皮膚約1 cm的彈道內部組織約0.1 g,稱重后置于研缽中加入無菌生理鹽水1 mL充分研磨后制成原液,再將原液使用無菌生理鹽水定比稀釋為10-1、10-2、10-3、10-4、10-5的接種液。將原液及各濃度接種液取0.1 mL均勻涂布于血瓊脂平板上,將平板倒置于37 ℃恒溫培養箱培養24 h,取出培養皿選擇菌落數在30～300的平板計數,菌落表現一致的為相同細菌,組織細菌含量計算方法為:(培養皿細菌計數×10×稀釋倍數)/組織重量。選擇不同菌落使用三線法純化細菌后,選用單個菌落使用VITEK MS全自動微生物質譜檢測系統鑒定細菌種類,校準菌株為大腸埃希菌ATCC 8739,上述實驗步驟均為無菌操作。

3.3藥敏實驗 HC組實驗豬檢出及鑒別后的菌種,取純化后的單個細菌菌落,使用無菌生理鹽水制備濃度為0.5麥氏的細菌懸濁液,將細菌懸濁液取0.1 mL接種于MH瓊脂平板上,待平板風干后,取抗生素藥敏試紙以及空白藥敏試紙輕貼于MH平板上,將MH平板倒置于37 ℃恒溫箱培養24 h后取出測量藥敏環直徑。藥敏結果根據美國臨床實驗室標準化研究所(clinical and laboratory standards institute,CLSI)2022年制定的藥敏實驗指南M100-S32進行判讀,使用大腸埃希菌ATCC 25922進行藥敏質控,結果以敏感(sensitivity,S)和耐藥(resistance,R)表示。同一只實驗豬彈道入口和彈道出口檢出的同一種細菌分別做藥敏。

4 統計學分析

結 果

1 一般情況

HC組與LN組所有實驗豬在死亡時間點或24 h解剖時均觀察到有腸管貫通傷。兩組實驗豬在傷后出現不同程度的戰栗,毛發豎立。HC組實驗豬傷后立即出現彈道周圍皮膚紅腫發熱,紅腫范圍隨時間延長而增大,入口傷道有少量淡紅色血樣液體滲出,傷道直徑隨時間逐漸縮小,24 h時存活的7只實驗豬中有5只出現傷口閉合結痂;出口有淡棕色液體流出,4～8 h間開始觀察到膿液分泌并出現惡臭,傷口觀察至24 h未見閉合。LN組實驗豬也出現上述表現但其24 h存活的9只實驗豬中有3只出現彈孔入口閉合結痂的情況;2～4 h間出口開始出現分泌膿液和聞及惡臭,截止到24 h也未見閉合。

2 體溫變化

HC組出艙時體溫顯著高于LN組(P<0.001),在觀察的24 h內HC組實驗豬體溫一直處于高位,HC組實驗豬體溫在8 h后緩慢降低,在2、4、8 h時間點HC組體溫均顯著高于LN組(P<0.001)。LN組傷后體溫隨時間逐漸升高,在傷后2 h內和8～12 h階段體溫升高最為明顯,對比前一時間點差異有統計學意義(P<0.01),LN組24 h體溫超過HC組但差異無統計學意義(P>0.05)。見圖1及表1。

表1 不同組別不同時間實驗豬傷后體溫變化重復測量方差分析結果

圖1 不同組別不同時間實驗豬傷后體溫變化情況。與同組前一時間點相比,##P<0.01,###P<0.001;與相同時間LN組相比,*P<0.05,***P<0.001

3 彈道細菌增殖情況

兩組實驗豬在傷后無論是彈道入口還是彈道出口組織細菌均隨時間大量增殖。除HC組彈道出口12 h與24 h之間的差異無統計學意義(P>0.05)外,其余彈道入口和彈道出口對比前一時間點差異均有統計學意義(P<0.05、P<0.01或P<0.001)。兩組各自組內的彈道出口對比彈道入口,所有時間點幾乎均相差2～3個數量級且差異顯著(P<0.01或P<0.001)。LN組除24 h彈道入口與HC組差異無統計學意義(P>0.05)外;其余無論是彈道入口還是出口,在相同時間點LN組的細菌計數均顯著高于HC組(P<0.001)。見表2。

表2 HC與LN組實驗豬傷后不同時間點彈道組織細菌計數組:n=9;HC組:n=7)

4 彈道細菌分類占比

LN組傷后早期彈道入口檢出的細菌大多是腸道細菌混合著表皮細菌,腸道細菌以大腸埃希菌為主,表皮細菌以各類葡萄球菌為主,隨時間發展入口檢出的細菌逐漸被腸道細菌替代,到12 h后無表皮細菌檢出;出口早期以大腸埃希菌和屎腸球菌等腸道細菌為主,僅有少量表皮細菌被檢出,4 h后無表皮細菌檢出。HC組傷后早期彈道入口檢出的細菌也為腸道細菌混合著表皮細菌,但以大腸埃希菌、屎腸球菌和糞腸球菌為主的腸道細菌多見,后期入口檢出的細菌逐漸被腸道細菌替代,24 h無表皮細菌檢出;其出口早期和入口相同,以大腸埃希菌和屎腸球菌等腸道細菌檢出為主,僅有少量表皮細菌被檢出,8 h后無表皮細菌檢出。見表3。

表3 HC組與LN組實驗豬傷后不同時間點彈道組織細菌檢出情況(檢出/標本數,標本數為該時間點存活實驗豬數量)

5 高原寒冷環境彈道細菌藥敏結果

HC組實驗豬共檢出不同種類細菌14種,各類抗生素耐藥率在50%以上的細菌種類為氨芐西林7種,青霉素9種,亞胺培南1種,四環素11種,頭孢他啶2種,氧氟沙星6種,阿奇霉素9種,慶大霉素3種。檢出數量最多的5類細菌中,大腸埃希菌除了對亞胺培南和阿奇霉素敏感外,對其余的6種抗生素均有較高的耐藥性;屎腸球菌僅對阿奇霉素的耐藥性稍低,但對包括亞胺培南在內的其余7種抗生素均有很高的耐藥性;糞腸球菌對氨芐西林及亞胺培南敏感,對余下6種均耐藥;不解乳糖鏈球菌對氨芐西林、青霉素、亞胺培南及頭孢他啶敏感,余下耐藥性均較高;金黃色葡萄球菌對亞胺培南、阿奇霉素及慶大霉素較敏感,對余下抗生素耐藥性較高。見表4。

表4 HC組檢出細菌不同抗生素藥敏敏感與耐藥情況(%)

討 論

腸道在腹腔中分布范圍廣,在腹部火器傷中損傷的概率最高,可達50%左右[9]。腸道是人體最大的微生物庫[10],損傷時其內容物流出后不僅會導致嚴重的腹膜刺激癥狀,而且細菌將在腹腔內大量繁殖,形成化膿性腹膜炎,導致膿毒血癥、感染性休克、多器官功能衰竭而死亡,這也是腹部火器傷后期死亡的主要原因[11]。即使經過緊急處理以及后續手術治療,手術部位感染的概率仍很高,其中腸液流入彈道深部組織是感染不易控制的重要原因之一[12]。高原地區由于低溫、低氧及干燥的特點使得該環境中菌落數及細菌毒力均低于平原地區,這可能是造成高原地區腹部以外部位火器傷后傷道細菌含量低,傷道感染表現輕以及出現時間晚的主要原因[13]。殷作明等[14]發現高原可降低實驗豬后腿彈道細菌繁殖速度、毒力及感染時間,而且感染均由外界細菌進入無菌內部繁殖造成。但高原腹部腸管火器貫通傷,子彈會貫穿腸道組織,尤其是子彈穿透結腸時會使得大量腸道內細菌進入彈道,同時腸內容物溢出后也會逐漸蔓延到彈道組織內。腸道為人體最大的細菌庫,其含有的細菌不僅致病力強,且數量大,使得腹部彈道組織感染加速,而且細菌含量也比其他部位的彈道多。本實驗中HC組腹部火器傷后,彈道入口組織內的細菌隨時間的延長進行大量繁殖,12 h即到達了感染的標準,和LN組彈道入口8 h達到感染標準以及劉江偉等[15]得出的平原地區8 h為腹部彈道感染時限相比延遲了約4 h;但和殷作明等[14]所建立的高原后腿部軟組織火器傷后24～48 h細菌才繁殖到105cfu/g相比還是大有提前。HC組彈道出口從2 h起,組織細菌含量就達到了105cfu/g,高于彈道入口,但還是遠低于LN組彈道出口2 h的細菌含量。HC組彈道入口細菌含量一方面提示了相比于平原地區,高原暴露降低了彈道細菌的繁殖速度,延長達到感染的時間;但由于腸道細菌進入彈道,導致細菌含量、繁殖速度均快于其他部位的高原火器傷,與其他部位的高原火器傷可以延遲清創相比,高原腹部火器傷應盡快清創及應用抗生素救治。另一方面彈道出入口細菌含量并不一致,彈道出口細菌含量更多及繁殖速度更快,提示了清創時間應該以彈道出口的感染時限為主要參考,除了腸道破裂后腸液流入彈道外,子彈引起的組織空腔效應對含菌腸液的吮吸作用可能是彈道出入口細菌含量不一致以及彈道出口一開始細菌就大量存在的原因[16]。

腹部槍彈傷后感染加重以及疼痛應激導致體溫會隨著時間不斷升高[17]。LN組傷后體溫不斷升高,在8～12 h內大幅升高,這可能與其腹腔感染加重有關。高原環境中,無論是實驗老鼠還是人員都觀察到核心體溫下降,有研究表明高原寒冷環境下基礎代謝抑制以及體溫調定點下降,使得機體進入高原環境短時間內體溫會降低,而后體溫調定點適應性上移,體溫將稍回升但仍低于正常體溫[18],同時在人體中可觀察到在高原環境中皮膚溫度升高,這可能與高原環境中臟器中的血液因低氧進行全身重新分布有關[19]。有研究者觀察到豬的核心體溫在10～25 ℃的環境中較常溫環境無明顯變化,但本實驗中HC組實驗豬的體溫傷前及傷后一直都偏高,隨時間幾乎沒有變化,而且在2～12 h時間點均高于LN組。而LN組實驗豬在上述時間點里,無論是彈道細菌檢出,還是一般情況觀察均提示LN組比HC組感染時間更早,感染程度更重,所以對于早期HC組實驗豬體溫高于LN組,可能是高原的應激反應使得HC組實驗豬體溫升高。后期脫離高原環境后,HC組體溫仍處于高位,可能感染在其中起著主導因素。但其機制仍有待進一步研究。雖然高原寒冷環境創傷后低體溫多見,但醫護人員對患者低體溫的認識不足以及重視程度不高,這也提示在高原環境發生戰創傷時,體溫變化需要高度重視,高溫或低體溫都有可能出現,需要及時對癥處理。

高原獨特的地理環境不僅會降低細菌的繁殖速度,而且會減少環境中的細菌種類,以及改變腸道菌群的構成[20]。本研究實驗中共檢出不同種類細菌20種,其中革蘭氏陽性菌(G+)15種,革蘭氏陰性菌(G-)5種。HC組與LN組均檢出的細菌有不解乳糖鏈球菌、產氣腸桿菌、大腸埃希菌、糞腸球菌、解沒食子酸鏈球菌、金黃色葡萄球菌、溶血葡萄球菌、屎腸球菌、豬表皮葡萄球菌、豬鏈球菌和豬葡萄球菌共11種,僅在HC組被檢測出的細菌有非脫羧勒克菌、科氏葡萄球菌、類少動鞘氨醇單胞菌共3種,僅在LN組中檢測出的有產氣巴斯德菌、產色葡萄球菌、解淀粉酶芽孢桿菌、蠟樣芽胞桿菌、豬腸鏈球菌和無害李斯特菌共6種。HC組彈道入口檢測出的細菌是以大腸埃希菌和屎腸球菌為代表的腸道細菌為主,其次才是金葡菌等表皮細菌,出口僅有少量的豬表皮葡萄球菌被檢出,其余全是腸道細菌,而且對比LN組所檢測出的細菌種類偏少,這也反映了高原低壓、低氧、寒冷環境對某些皮膚定植菌具有抑制作用,對腸道菌群構成有一定的影響。兩個實驗組無論是彈道出口還是彈道入口,隨著時間的發展,彈道檢出的細菌最后僅剩下了腸道細菌,而且其8 h后細菌的增殖速度減緩,這可能與細菌之間的資源競爭性抑制有關[21-22]。

腸道細菌和表皮細菌是耐藥的高發菌種[23-24],而且有研究表明高原寒冷環境會改變細菌的藥敏情況[6]。對于平原低海拔地區的腹部火器傷和傷及腸管的貫通傷,關于腸道細菌、外界皮膚和環境細菌以及特殊細菌感染用藥的相關研究,國內外已有相關報道以及相對應的救治策略[25-26]。因此本實驗僅針對HC組實驗豬彈道檢出細菌做藥敏實驗。本研究選用不同作用機制的8種最常用的抗生素對從HC組檢測出的細菌進行藥敏實驗。耐藥性最嚴重的是屎腸球菌,其對阿奇霉素耐藥性低,但敏感性也不高,對包括亞胺培南在內的其余抗生素均耐藥;其余的細菌也是對1種或者多種抗生素耐藥。HC組檢測出的14種細菌中,對青霉素、四環素、阿奇霉素、氨芐西林耐藥率在50%以上的細菌分別有9、11、9、7種,可見高原環境暴露后細菌耐藥性仍很嚴重。耐藥率50%以上就不建議經驗性用藥,而需根據藥敏結果選用抗生素[27],但在高原特殊環境下,并不具備該條件,而且感染時間早而且速度快,所以無論在損傷發生的任何時間點,均需及時聯合足量使用抗生素,并需包含如亞胺培南等高級抗生素以控制感染。

綜上所述,本研究通過培養、分離及鑒定高原寒冷復合環境豬腹部腸管火器貫通傷后不同時間點彈道細菌,以及對分離的細菌進行藥敏實驗,結果提示高原寒冷環境會降低腹部火器傷彈道細菌的繁殖速度,減少彈道內部表皮細菌含量及種類,以及改變腸道菌群結構;但腹部腸管火器貫通傷后彈道的細菌含量高且繁殖速度快,導致其達到感染時間早,提示傷后仍需盡早清創,及時足量聯合使用抗生素,以期控制感染,提高救治效果。

作者貢獻聲明：屈金權:實驗設計及操作、數據收集分析、論文撰寫;李佳佳:實驗設計與指導、數據分析;楊欣悅、孫赳、梁飛行、宋來陽:實驗操作、文獻檢索、資料收集整理;靳向輝:實驗研究指導及操作;劉江偉:課題及實驗設計、指導,論文修改及審校