外周血CD8+效應記憶T細胞對膿毒癥診斷的價值評估

陳國昇,文大林,種慧敏,張 鵬,杜 娟,楊 堃,張可珺,鄧 進,張安強

1.安順市人民醫院泌尿外科,貴州 安順 561000; 2.陸軍軍醫大學大坪醫院,創傷與化學中毒全國重點實驗室,重慶 400042; 3.貴州醫科大學附屬醫院急診科,貴陽 550004; 4.陸軍軍醫大學大坪醫院檢驗科,重慶 400042; 5.重慶市渝北區中醫院重癥醫學科,重慶 401121

膿毒癥被定義為因宿主對感染反應失調導致的危及生命器官功能障礙[1]。最近的一份全球疾病負擔報告強調,全球每年有將近5 000萬人發生膿毒癥[2]。目前認為在膿毒癥的發生及發展過程中同時存在不平衡的過度炎癥和免疫抑制,而大多數患者的預后不良與嚴重的免疫抑制有關[3]。膿毒癥患者的免疫抑制涉及不同的細胞類型和特征,與免疫細胞凋亡增強、T細胞衰竭、通過表觀遺傳變化使細胞重編程、激活細胞表面分子的表達減少等有關[4]。Pauken和Wherry[5]研究表明T淋巴細胞耗竭是膿毒癥患者發生免疫抑制的主要特征。因此早期動態檢測膿毒癥患者T細胞亞群的變化,監測和評估膿毒癥患者的免疫功能狀態,及時診斷和評估患者病情嚴重程度,對患者進行風險分層,有利于及時采取措施以改善膿毒癥的預后。

CD8+T淋巴細胞具有細胞毒性作用,可殺滅靶細胞及帶有特異性抗原的細胞,促進抗體合成及T淋巴細胞增殖過程,是人體體液免疫與細胞免疫的重要調節者,對于保持內環境穩態具有重要作用[6],并且CD8+記憶T細胞亞群在對抗膿毒癥患者二次感染中發揮重要作用[7]。雖然在膿毒癥的臨床與基礎研究中對CD8+T細胞的研究較多,但是對CD8+T細胞亞群在膿毒癥中的作用研究較少。因為從膿毒癥發生開始,便同時存在免疫功能亢進及免疫抑制[3],因此本研究的觀察時間點選擇在患者因膿毒癥入ICU第1、3、5天,并通過檢測危重癥患者外周血CD8+T細胞亞群的變化,評估其用于膿毒癥診斷的價值。

資料與方法

1 一般資料

納入標準:(1)年齡≥18歲入住ICU;(2)膿毒癥的診斷基于Sepsis-3標準[1]。排除標準:(1)患有自身免疫性疾病、腫瘤或免疫缺陷;(2)患有艾滋病毒、肝炎和梅毒等傳染病;(3)孕婦和哺乳期。

前瞻性選擇2021年3月—2022年3月陸軍軍醫大學大坪醫院ICU收治的符合納入排除標準的膿毒癥和非膿毒癥各30例患者作為研究對象。其中男性40例,女性20例;年齡29～70歲,平均55.4歲。其中創傷患者16例(道路交通傷7例,高處墜落傷5例,擠壓傷3例,銳器傷1例)。膿毒癥患者感染來源:肺部感染7例、腹部感染11例、血液感染3例、泌尿系感染6例、其他感染3例。患者分類見表1。本研究已通過陸軍軍醫大學大坪醫院醫學倫理委員會批準(2019-137)。

表1 兩組患者疾病分類(n)

2 研究方法

本研究樣本采集自陸軍軍醫大學大坪醫院ICU,由安順市人民醫院、貴州醫科大學和陸軍軍醫大學大坪醫院的研究人員完成指標檢測、數據收集和分析。從臨床電子醫療系統收集患者臨床資料,包括患者原發疾病以及基本信息、感染部位、常規實驗室檢測指標以及現有臨床狀態和疾病嚴重程度并進行分析。患者疾病嚴重程度由APACHE Ⅱ評分和序貫器官衰竭評分(sequential organ failure assessment,SOFA)進行評估。使用流式細胞儀檢測患者入ICU第1、3、5天CD8+T細胞各亞群比例,收集血漿降鈣素原(procalcitonin,PCT)、CRP及IL-6的臨床化驗結果,并分析上述指標在各組間的差異、與膿毒癥發生的關系、各指標對膿毒癥的診斷效能以及與膿毒癥嚴重程度的相關性。

2.1樣本采集 對符合納入標準的危重癥患者,以連續采血的方式,分別于入ICU后第1、3、5天用乙二胺四乙酸二鈉(ethylenediaminetetraacetic acid disodium salt,EDTA-2Na)抗凝真空管采集外周全血2 mL,混勻后室溫放置待用。

2.2CD8+T細胞亞群比例的檢測 各細胞免疫指標選擇不同熒光直接標記的抗體(美國Beckman Coulter公司)與對應指標分子特異性結合,通過Navios多通道流式細胞分析儀(美國Beckman Coulter公司)檢測患者外周血細胞CD45、CD3、CD4、CD8、CD45RA、CD197表達水平,所有血液樣本在采集后2 h內完成檢測。使用Kaluza流式分析軟件分析 CD3+T淋巴細胞、CD4+T細胞、CD8+T細胞及其亞群的比例,主要有初始CD8+T細胞、效應記憶CD8+T淋巴細胞、中央記憶CD8+T淋巴細胞。比較上述各細胞亞群在患者入ICU第1、3、5天的變化規律,分析其在膿毒癥與非膿毒癥患者中的表達差異,研究其與膿毒癥嚴重程度的相關性。

3 統計學分析

結 果

1 危重癥患者基線資料以及膿毒癥患者與非膿毒癥患者PCT、CRP及IL-6水平比較

膿毒癥患者入ICU第3天的SOFA顯著高于非膿毒癥患者(P=0.048),第1天及第5天比較差異均無統計學意義(P>0.05)。APACHE Ⅱ評分在第1、3、5天比較差異均無統計學意義(P>0.05),組別、時間主效應以及組別與時間交互效應均不顯著(P>0.05)。膿毒癥患者入ICU第1、3、5天的PCT及第1天CRP水平明顯高于非膿毒癥患者(P均<0.05),第3天及第5天CRP差異無統計學意義(P>0.05)。第1、3、5天IL-6比較差異均無統計學意義(P>0.05),其中CRP組別主效應顯著(P=0.034),PCT組別、時間主效應以及組別與時間交互效應均顯著(P<0.05)。見表2。

表2 兩組患者基線資料比較

2 膿毒癥患者與非膿毒癥患者T細胞及CD8+T細胞亞群的變化

入ICU第1、3、5天膿毒癥患者的CD3+T細胞比例、CD8+效應記憶T細胞(TEM)比例顯著低于非膿毒癥患者(P均<0.05);第3天CD4+T細胞亞群比例以及CD8+Naive T細胞比例顯著高于非膿毒癥患者(P均<0.05),余指標在兩組間差異均無統計學意義(P均>0.05)。其中CD3+T細胞比例組別主效應顯著(P<0.001),CD4+T細胞比例時間主效應顯著(P=0.022),CD8+TEM細胞比例組別主效應顯著(P<0.001),CD8+Naive T細胞比例組別主效應顯著(P=0.020)。見表3。

表3 膿毒癥患者CD8T細胞亞群表達變化

3 危重癥患者發生膿毒癥的危險因素分析

建立Logistic回歸模型,以發生膿毒癥為因變量,以性別和年齡作為校正因素,進行單因素Logistic回歸分析,結果顯示,入ICU第1天CD3+T細胞亞群比例、CD8+TEM比例、PCT以及CRP均與膿毒癥發生顯著相關(P均<0.05)。見表4。將上述4個指標納入多因素邏輯回歸分析,結果顯示CD8+TEM比例以及CRP為膿毒癥發生的獨立危險因素(P均<0.05)。見表5。

表4 單因素Logisitic 回歸分析患者入ICU第1天發生膿毒癥的危險因素

表5 多因素Logisitic 回歸分析患者入ICU第1天發生膿毒癥的危險因素

4 膿毒癥診斷效能分析

在膿毒癥診斷中CRP、CD3+T細胞、CD8+TEM及PCT的AUC(95%CI)分別為:0.772(0.646～0.871)、0.737(0.608～0.842)、0.795(0.665～0.892)、0.851(0.736～0.930),后兩者聯合診斷膿毒癥的AUC為0.890(0.775～0.959)。見圖1。

PCT:降鈣素原;CD8+TEM:CD8效應記憶T細胞

討 論

膿毒癥的特征是對全身感染的過度免疫反應,導致炎癥失控、血管功能障礙、急性淋巴細胞減少和長期免疫麻痹。因此早期監測膿毒癥患者免疫功能,判斷患者免疫抑制狀態,準確評估患者病情,及時做出診斷,以指導臨床治療,對改善膿毒癥患者預后至關重要。而生物標志物的應用有效增加了膿毒癥診斷及預測的準確性。為此筆者檢測了膿毒癥發生發展過程中免疫細胞亞群的改變,尤其是T細胞亞群的動態變化,來探尋對膿毒癥的診斷以及患者病情評估的新的高敏感性及特異性指標。

研究證實,膿毒癥患者免疫抑制的主要特征是T細胞耗竭,其表現為T細胞增殖降低、細胞因子分泌能力下降且易于凋亡[5,8]。在膿毒癥患者中,由于發生免疫穩態失衡,尤其是淋巴細胞持續減少的患者,其病死率顯著高于其他患者,使得淋巴細胞絕對值減少成為評估持續免疫抑制及不良預后的重要指標[9]。在本研究中,膿毒癥患者在入ICU第1、3、5天的T細胞比例均顯著低于非膿毒癥患者(P均<0.05),提示膿毒癥患者處于嚴重的免疫抑制狀態。Logistic回歸分析顯示T細胞的降低與膿毒癥的發生顯著相關,其對膿毒癥的診斷的AUC為0.737(0.608～0.842),有較好的效能。所以了解T細胞在患者發生膿毒癥之后的變化,可以更加全面地了解膿毒癥患者的免疫狀態,更有效地指導臨床特異性的治療。

在感染發生后,抗原被免疫系統識別,初始T細胞迅速分化為效應T細胞,大多數效應T細胞遷移至感染部位來對抗病原體[10]。而在感染清除后大部分效應T細胞發生死亡,有一部分分化為記憶T細胞[11]。記憶T細胞被分為兩群即TCM和TEM,前者在宿主體內存活的時間較長,但在病原體再次感染時,后者能更迅速地發揮作用[12]。記憶性CD8+T細胞群一旦形成,就可以維持到宿主的整個生命周期,這些細胞提供了對細胞內感染的保護,并介導抗腫瘤免疫[13],并且其部分亞群與膿毒癥的嚴重程度顯著相關[14]。在本研究中,筆者主要發現CD8+TEM在第1、3、5天的比例顯著低于非膿毒癥患者(P均<0.05)。Logistic回歸分析顯示CD8+TEM細胞比例降低與膿毒癥發生顯著相關,其對膿毒癥診斷的AUC為0.795(0.665～0.892),有較好的效能,因此CD8+TEM細胞亞群的比例可以作為膿毒癥診斷的一個新指標,以期為膿毒癥患者的診療提供有用的幫助。

CRP和PCT均是機體應對感染和損傷時產生的蛋白質,后者在臨床上被用作最常用的感染診斷指標,尤其是在患者發生膿毒癥后迅速升高,對膿毒癥的診斷及預后預測有一定的價值[15]。在本研究中,PCT在膿毒癥患者中的表達顯著升高,其對膿毒癥的診斷效能為0.851(0.736～0.930),其與CD8+TEM細胞亞群聯合后,對膿毒癥的診斷效能顯著提高,AUC為0.890(0.775～0.959),明顯高于其他單個指標。

綜上所述,本研究發現CD8+TEM細胞亞群可以作為膿毒癥診斷、評估患者免疫功能以及判斷疾病嚴重程度的新指標。但是本研究也存在幾點不足之處:(1)單中心小樣本量研究,限制了普遍性;(2)雖然動態地研究了T細胞亞群,但是沒有繼續進行遠期監測。希望本次研究結果能在更大的隊列研究中進行驗證,以期為膿毒癥的臨床診療提供支持。

作者貢獻聲明：陳國昇:論文撰寫、數據分析、資料采集;文大林、種慧敏:實施研究、資料采集;張鵬、杜娟:分析數據;楊堃、張可珺:技術支持;鄧進:設計實驗;張安強:設計實驗、獲取研究經費、文章修改