lincRNA Cox2通過miR-129-5p/AMPK調控BCG感染的巨噬細胞糖酵解進程

徐蕾，于嘉霖，劉莉，鄧光存，吳曉玲

lincRNA Cox2通過miR-129-5p/AMPK調控BCG感染的巨噬細胞糖酵解進程

徐蕾，于嘉霖，劉莉，鄧光存，吳曉玲

寧夏大學生命科學學院/西部特色生物資源保護與利用教育部重點實驗室，銀川 750021

【目的】探究lincRNA Cox2對BCG（Calmette-Guérin）感染的RAW264.7巨噬細胞糖酵解進程的調控作用，闡明Mtb與巨噬細胞之間的相互作用，為結核病的診斷和治療提供新的靶點?！痉椒ā坷眯「蓴_RNA敲減lincRNA Cox2的表達，以及使用miR-129-5p mimics過表達載體，結合BCG感染，通過實時熒光定量PCR檢測lincRNA Cox2、miR-129-5p和促炎因子IL-1β、TNF-α、IL-6的表達量；乳酸含量檢測試劑盒檢測乳酸（LD）的分泌情況；平板涂布法檢測巨噬細胞菌載量情況；雙熒光素酶報告基因系統驗證lincRNA Cox2與miR-129-5p以及miR-129-5p與AMPK的互作關系；蛋白免疫印跡檢測AMPK（AMP依賴蛋白激酶）及糖酵解途徑中關鍵基因HK1（己糖激酶1）、PKM2（丙酮酸激酶2）和LDHA（乳酸脫氫酶）的表達變化。【結果】 BCG感染12 h能夠極顯著上調RAW264.7巨噬細胞中lincRNA Cox2的表達（=0.000013），與BCG組相比，siRNA+BCG組中AMPK（=0.000771）、HK1（=0.00323）、PKM2（=0.000135）和LDHA（=0.002532）的表達量以及乳酸的分泌量（=0.020802）發生顯著上調，而促炎因子IL-1β（=0.000451）、TNF-α（=0.000147）、IL-6（=0.0001）的表達發生顯著下調，菌載量試驗表明siRNA+BCG組中的巨噬細胞菌載量顯著下調（=0.000127）。雙熒光素酶報告基因系統表明lincRNA Cox2和miR-129-5p存在相互作用關系并以AMPK為靶基因。BCG感染RAW264.7巨噬細胞12 h后極顯著下調miR-129-5p的表達（=0.000156），與BCG組相比，miR-129-5p mimics+BCG組中AMPK（=0.000262）、HK1（=0.019524）、PKM2（=0.001658）和LDHA（=0.000887）表達量以及乳酸分泌量（=0.044952）發生顯著下調。【結論】 lincRNA Cox2通過海綿吸附miR-129-5p并靶向AMPK，促進BCG感染的RAW264.7巨噬細胞糖酵解進程。

lincRNA Cox2；miR-129-5p；AMPK；BCG；巨噬細胞；糖酵解進程

0 引言

【研究意義】結核?。╰uberculosis，TB）是由結核分枝桿菌（，Mtb）感染引起的人畜共患呼吸道傳染性疾病。根據世界衛生組織2022年全球結核病報告，2021年結核病死亡病例高達140萬例[1]。其中，由于耐多藥結核病、人類免疫缺陷病毒（human immunodeficiency virus，HIV）及新型冠狀病毒（SARS-CoV-2）的沖擊[2-3]，導致結核病的發病現狀不斷加劇，嚴重威脅人類身體健康。結核分枝桿菌屬于胞內寄生菌，對其感染機制及宿主抗感染機制的研究將為結核病的預防及治療提供重要幫助?！厩叭搜芯窟M展】巨噬細胞是Mtb的主要宿主細胞與靶細胞，當機體感染Mtb時，巨噬細胞識別、吞噬病原體，并在胞內發生一系列復雜的相互作用[4]。在這復雜的博弈過程中，細胞代謝扮演著重要角色，其通過改變胞內能量水平，從而增強細胞在惡劣環境中的生存能力，這一過程被稱為代謝重編程[5]。其中，最為常見的是糖酵解重編程，指巨噬細胞受到細菌感染時，葡萄糖被一系列酶，如己糖激酶（HK1）、丙酮酸激酶（PKM2）和乳酸脫氫酶（LDHA）等催化分解為乳酸并產能的過程[6]。有研究表明，巨噬細胞糖酵解重編程已成為宿主對Mtb感染的早期免疫反應的關鍵[7]。在使用糖酵解抑制劑2-DG處理Mtb感染后的巨噬細胞時，發現Mtb的存活率顯著上調，這表明糖酵解途徑可以抑制巨噬細胞中Mtb的生長[8]。但隨著感染的持續發展，Mtb也通過多種途徑拮抗糖酵解途徑。研究發現，Mtb不僅可以上調miR-21促進IL-4的產生，并且能夠抑制糖酵解限速酶—磷酸果糖激酶的產生，以降低糖酵解的進程，從而確保菌體的存活和復制[9]。miRNA對病原菌感染的巨噬細胞生物學功能的調控具有重要作用，但miRNA功能的行使與長鏈非編碼RNA（long noncoding RNA，LncRNA）密不可分，因此探究LncRNA與miRNA的相互作用從而調控糖酵解進程具有重要意義。LncRNA是一類長度超過200個核苷酸且缺乏蛋白質編碼能力的轉錄本，該RNA能夠重新編程基因表達并影響不同的細胞功能[10]，且其表達水平與結核分枝桿菌的感染機制及細胞命運的調控密切相關[11]。研究表明，Lnc- EST12能夠抑制巨噬細胞中炎癥和焦亡的活化，并且能夠通過FUBP3負調節巨噬細胞抗Mtb的先天免疫[12]。在一些情況下，LncRNA還可以充當microRNA誘餌，從而對抑制靶mRNA或靶蛋白的表達有重要作用。本團隊研究發現，LncRNA NR_003508能夠作為正調節劑，通過海綿吸附miR-346-3p以調節RIPK1的表達，進而抑制Mtb誘導的程序性壞死[13]。lincRNA Cox2屬于基因間非編碼RNA，是誘導度最高的lncRNA之一，其位于蛋白質基因前列腺素-過氧化物內切酶2（Cox2/Ptgs2）下游51 kb處，主要功能與調節巨噬細胞炎癥反應有關。如lincRNA Cox2在急性肺損傷期間高表達，通過降低促炎因子的表達進而調控肺泡巨噬細胞的炎癥反應，最終維持肺部穩態[14]?！颈狙芯壳腥朦c】本項目組在前期已經證明，BCG感染巨噬細胞后lincRNA Cox2會發生顯著上調，但有關其如何調控Mtb誘導巨噬細胞糖酵解的研究尚未見詳細報道。且生物信息學數據庫預測出lincRNA Cox2與miR-129-5p存在相互結合位點。研究發現，miR-129-5p在多種癌癥中表現出抗腫瘤的功能。如miR-129-5p能夠通過調節ADAM9抑制細胞增殖和侵襲能力[15]，以及削弱了SPN對細胞增殖、遷移、侵襲和細胞周期進程的促進作用，增強了細胞凋亡活性[16]。然而miR-129-5p在糖酵解進程中的作用并未見確切描述。在糖酵解進程中，AMP/ATP傳感器AMP依賴蛋白激酶（adenosine 5′- monophosphate-activated protein kinase，AMPK）能夠調控并維持細胞的代謝穩態，從而降低TCA循環產生的能量[17]。由此可見，探討lincRNA Cox2對Mtb與巨噬細胞相互作用過程中的糖酵解重編程調控的作用，為篩選治療與預防結核病的靶向藥物及探索增強宿主抗Mtb感染免疫手段至關重要。【擬解決的關鍵問題】采用牛分枝桿菌疫苗株卡介苗（Calmette-Guérin，BCG）誘導RAW264.7巨噬細胞引發糖酵解重編程，通過小干擾敲減lincRNA Cox2的表達并過表達miR-129-5p，同時利用蛋白免疫印跡技術檢測糖酵解關鍵酶的表達情況，進而明確lincRNA Cox2對BCG感染的RAW264.7巨噬細胞糖酵解的調控作用，并探討其中的分子機制。上述研究有助于闡明Mtb與巨噬細胞之間的相互作用，并為結核病的診斷或治療提供新的靶點。

1 材料與方法

1.1 菌株與細胞系

牛結核分枝桿菌卡介苗，購自上海生物制品研究所并保存于西部特色生物資源保護與利用教育部重點實驗室（寧夏大學）。使用DifcoTMMiddlebrook 7H10培養基（BD公司）對BCG進行平板涂布并置于37 ℃培養箱中培養，于對數期挑取單菌落轉接至DifcoTMMiddlebrook 7H9液體培養基（BD公司）中，37 ℃培養箱中培養，待BCG培養至合適濃度時（OD600 nm=1.5）進行傳代。小鼠肺泡巨噬細胞（RAW264.7）和人腎上皮細胞（HEK293T），購自中國科學院上海生命科學研究院細胞資源中心并保存于西部特色生物資源保護與利用教育部重點實驗室（寧夏大學）。使用含體積分數10%胎牛血清的DMEM（賽默飛）培養液，于37 ℃、飽和濕度、5% CO2的細胞培養箱中培養，當細胞培養密度達到90%時傳代一次。以上細胞感染試驗均在西部特色生物資源保護與利用教育部重點實驗室的P2級實驗室中進行。

1.2 構建si-lincRNA Cox2和miR-129-5p-mimics載體

根據lincRNA Cox2的mRNA全長序列，設計并合成小干擾。干擾序列如下：

si-lincRNA Cox2：5′-AAGAGUAAGAUUCUGAA GAUCUU-3′。

根據miR-129-5p的全長序列，設計并合成miR-129-5p mimics，序列如下：

miR-129-5p mimics: sense 5′-CUUUUUGCGGUC UGGGCUUGC-3′

antisense 5′-AAGCCCAGACCGCAAAAAGUU-3′

Negative control: sense 5′- UUCUCCGAACGUGU CACGUTT-3′

antisense 5′-ACG UGACACGUUCGGAGAATT-3′。

以上序列交由上海吉瑪制藥技術有限公司合成。

1.3 載體的轉染

將生長于對數期的RAW264.7巨噬細胞接種于6孔細胞培養皿中，使每孔細胞數量為1×106，恒溫培養5 h待細胞貼壁后，取轉染試劑（ZETA LIFE）與載體等比例混合于200 μL EP管中，并室溫靜置15 min。將混合物加入細胞培養液中，混勻后放入細胞培養箱中培養24 h。

1.4 熒光定量PCR檢測

1.4.1 總RNA提取及cDNA合成 總RNA提取方法按照TRIZOL法，使用TRIZOL、氯仿、異丙醇、75%乙醇和無核酶水等試劑進行提取。以提取出的RNA為模板，使用Prime Script RT Master Mix（TAKARA）說明書配制RT反應液20 μL，反應結束后將cDNA放置在-20 ℃或-80 ℃保存。

1.4.2 熒光定量PCR反應 根據Universal SYBR Green Fsat qpcr Mix（愛博泰克）說明書，配制qPCR體系20 μL，渦旋混勻后，上機進行熒光信號定量檢測。qPCR反應程序：預變性95 ℃ 3 min，95 ℃ 5 s、60 ℃ 32 s循環40次。熒光定量PCR反應的具體條件詳見Universal SYBR Green Fsat qPCR Mix試劑說明書。相關引物序列如表1。

1.5 乳酸含量檢測

將生長于對數期的RAW264.7巨噬細胞接種于6孔細胞培養皿中，使每孔細胞數量為1×106。待細胞貼壁，并根據試驗條件處理不同時間后收集細胞培養液，使用乳酸（LD）測試盒（南京建成生物工程研究所）檢測乳酸，然后酶標儀中波長530 nm進行OD值讀取，并根據試劑盒說明書進行含量計算。

表1 實時熒光定量PCR引物序列

1.6 平板涂布法檢測巨噬細胞菌載量

將生長于對數期的RAW264.7巨噬細胞接種于6孔細胞培養皿中，使每孔細胞數量為1×106。待細胞貼壁，根據試驗條件處理后收集細胞，并用0.1% TritonX-100裂解，離心收集沉淀后用PBS重懸沉淀，將重懸后的沉淀梯度稀釋涂布于7H10平板上，37℃恒溫培養兩周后計數。

1.7 雙熒光素酶報告基因檢測

利用網站（https://bibiserv.cebitec.uni-bielefeld.de/）預測lincRNA Cox2和miR-129-5p、miR-129-5p和AMPK的相互作用位點，將該兩個結合位點的野生型及突變型目的片段分別構建并整合進pmirGLO Vector載體中。將生長于對數期的293T細胞接種于12孔細胞培養皿中，使每孔細胞數量為3×105，將質粒載體轉染入293T細胞后，使用dual-luciferase reporter assay system（Promega）試劑盒進行雙熒光素酶報告基因檢測。上述質粒載體交由上海吉瑪制藥技術有限公司設計合成。

1.8 Western blot 檢測

將生長于對數期的RAW264.7巨噬細胞接種于6孔細胞培養皿中，使每孔細胞數量為1×106。待細胞貼壁，并根據實驗條件處理不同時間后，使用全蛋白提取試劑盒（凱基生物）提取細胞全蛋白，使用BCA蛋白含量檢測試劑盒（賽默飛）檢測蛋白濃度，將蛋白調整至同一濃度后，進行SDS-PAGE凝膠電泳并轉膜，隨后進行Western blot，使用AMPK（CST）、HK1、PKM2、LDHA和β-actin抗體（ABclonal），檢測蛋白的相對表達變化。

1.9 免疫熒光檢測

將生長于對數期的RAW264.7巨噬細胞接種于鋪有無菌蓋玻片的12孔細胞培養皿中，使每孔細胞數量為3×105。待細胞貼壁后對細胞按照不同試驗組進行處理。處理完成后將培養液吸棄，用4%多聚甲醛固定細胞25 min，0.5% TritonX-100在室溫條件下通透30 min，5% BSA室溫條件下封閉1 h。后在37 ℃培養箱中孵育一抗3 h（使用5% BSA以1﹕200稀釋AMPK抗體），后同樣條件下避光孵育二抗（使用PBS以1﹕200稀釋熒光抗體）。最后將含DAPI的封片劑滴在載玻片上，將鋪有細胞的蓋玻片倒扣在封片劑上。待片子避光自然風干后，使用激光共聚焦顯微鏡觀察AMPK的熒光表達并拍照。

1.10 統計學分析

所有數據均經過3次獨立試驗，并采用GraphPad Prism 7軟件中的One Way ANOVA進行統計學分析，數據均使用平均值±標準誤差（M±SEM）表示。圖中標注ns代表無顯著差異，*代表顯著差異（＜0.05），**代表差異極顯著（＜0.01），***代表差異極顯著（＜0.001）。

2 結果

2.1 BCG感染RAW264.7巨噬細胞后上調lincRNA Cox2的表達

lincRNA Cox2是巨噬細胞中重要的免疫調節因子，為探究BCG感染對RAW264.7巨噬細胞中lincRNA Cox2的影響，本研究使用熒光定量PCR檢測lincRNA Cox2的表達變化。結果表明（圖1），與感染0 h相比，BCG感染RAW264.7巨噬細胞后，lincRNA Cox2的表達在感染前期呈顯著上調的趨勢，且在感染時間為12 h（=0.000013）和18h（=0.000019）時表達量最高。當BCG持續感染RAW264.7巨噬細胞24 h后，lincRNA Cox2的表達趨于下調，但仍顯著高于感染0 h（=0.00047）。由此可知，BCG感染RAW264.7巨噬細胞可誘導lincRNA Cox2的表達發生上調，并在12 h時表達量最高。

ns 無顯著差異 No significant difference ; *P＜0.05; ***P＜0.001 下同 The same as below

2.2 BCG感染RAW264.7巨噬細胞后上調糖酵解關鍵酶的表達

糖酵解進程受到多種酶的調控，其中HK1作為己糖激酶中的一種亞型，可與線粒體外膜結合，通過調節GAPDH改變葡萄糖代謝[18]；丙酮酸激酶PK亞型中的PKM2在免疫細胞中高表達，從而調控丙酮酸的產生[19]；乳酸脫氫酶LDHA是催化糖酵解最后一步的關鍵酶，可催化丙酮酸轉化為乳酸[20]。為探究BCG感染RAW264.7巨噬細胞后糖酵解的變化，本研究檢測了不同感染時間下3種酶的表達變化。結果顯示（圖2），HK1（=0.0031）、PKM2（=0.0155）和LDHA（=0.0021）的表達量均在感染12 h時顯著上調且達到最高；隨著感染時間的延長，3種蛋白的表達量逐漸下調。因此，本研究后續實驗選用12 h為最佳感染時間，從而探究lincRNA Cox2對糖酵解進程的調控作用。

圖2 BCG感染RAW264.7巨噬細胞后糖酵解關鍵酶的表達變化

2.3 si-lincRNA Cox2后上調AMPK的表達

糖酵解受多種因子的協同調控，而AMPK是一種綜合代謝傳感器，可在細胞水平上維持能量平衡，并在協調組織間代謝信號傳導中發揮重要作用[21]。因此，為探究BCG感染RAW264.7巨噬細胞后AMPK的表達變化，本研究使用Western Blot檢測了在不同感染時間下AMPK的相對表達量。結果表明，與對照組相比，BCG感染RAW264.7巨噬細胞至12 h時，AMPK的表達量達到最高（=0.0031，圖3-A）。為明確lincRNA Cox2在BCG感染RAW264.7巨噬細胞后對AMPK的作用，本研究設計并合成了lincRNA Cox2的小干擾RNA。通過qPCR檢測結果可以觀察到，與對照組相比，小干擾RNA的干擾效率極為顯著（=0.000013，圖3-B）。之后本研究將該條小干擾RNA或NC轉染進RAW264.7巨噬細胞24 h并感染BCG 12 h后，檢測了AMPK的相對表達量，發現與BCG組相比，siRNA+BCG組中AMPK的相對表達量發生級顯著的上調（=0.000771，圖3-C）。之后，進一步通過免疫熒光檢測AMPK的表達，發現相對于對照組中的綠色熒光斑點，siRNA+BCG組中綠色熒光斑點顯著增多（圖3-D）。由此可知，干擾lincRNA Cox2可以促進BCG感染的RAW264.7巨噬細胞中AMPK的表達。

A：Western blot檢測BCG感染RAW264.7巨噬細胞不同時間下AMPK的表達量；B：qPCR檢測lincRNA Cox2的干擾效率；C：對RAW264.7巨噬細胞轉染NC或lincRNA Cox2的小干擾RNA 24 h并且感染BCG 12 h后，Western blot檢測AMPK的表達量；D：免疫熒光檢測AMPK的表達水平，綠色光點表示AMPK蛋白表達，藍色光點表示細胞核

2.4 si-lincRNA Cox2后促進糖酵解進程

為明確lincRNA Cox2在BCG感染RAW264.7巨噬細胞后對糖酵解進程的調控作用，本研究選用糖酵解途徑中3種關鍵酶進行實驗，分別為HK1、PKM2和LDHA，使用Western Blot檢測了BCG感染RAW264.7巨噬細胞并且干擾lincRNA Cox2后，3種關鍵酶的表達變化。結果表明（圖4-A），相對于BCG組，siRNA+BCG組中HK1（=0.00323，圖4-B）、PKM2（=0.000135，圖4-C）和LDHA（=0.002532，圖4-D）的表達都顯著上調。因此，本研究進一步檢測了糖酵解下游乳酸的分泌情況，結果表明（圖4-E），siRNA+BCG組中的乳酸含量顯著高于BCG組（=0.020802）。與此同時，qPCR檢測促炎因子的表達發現，相較于BCG組，siRNA+BCG組中IL-1β（=0.000451，圖4-F）、TNF-α（=0.000147，圖4-G）和IL-6（=0.0001，圖4-H）的表達發生顯著下調。由此可知，si-lincRNA Cox2能夠促進糖酵解的進程并抑制炎癥因子的表達。

2.5 si-lincRNA Cox2后下調RAW264.7巨噬細胞中細菌載量

將BCG感染后的RAW264.7巨噬細胞裂解后，通過涂布平板法將裂解液稀釋涂布于7H10平板上，37℃恒溫培養14 d后檢測干擾lincRNA Cox2后對RAW264.7巨噬細胞中細菌載量的影響。結果發現（如圖5），與BCG組相比，si+BCG組中菌載量發生顯著下調（=0.000127）。

2.6 lincRNA Cox2在RAW264.7巨噬細胞中海綿吸附miR-129-5p

lncRNAs可通過堿基對互補性隔離miRNA，使其遠離靶mRNA，從而起到miRNA海綿吸附的作用[22]。因此，為探究lincRNA Cox2對糖酵解重編程的作用機制，本研究利用網站BiBiServ預測lincRNACox2與miR-129-5p的結合位點（圖6-A），將野生型與突變型的序列整合進pmirGLO Vector載體中，將其轉染進293T細胞中37℃培養24h，最后使用雙熒光素酶報告基因試劑盒檢測熒光素酶活性。如圖6-B中雙熒光素酶報告基因檢測結果顯示，相較于NC組，轉染miR-129-5p mimics能夠顯著下調lincRNACox2- WT質粒的熒光素酶活性（=0.001161），證明lincRNACox2與miR-129-5p能夠發生相互作用。為進一步證明lincRNACox2與miR-129-5p的相互作用關系，本研究使用qPCR檢測在BCG感染RAW264.7巨噬細胞不同時間條件下miR-129-5p的表達情況（圖6-C）。結果表明，miR-129-5p在12 h時表達量顯著下調（=0.000156），與BCG感染RAW264.7巨噬細胞不同時間條件下lincRNACox2的表達量相比，miR-129-5p的表達呈相反趨勢。而干擾lincRNACox2后miR-129-5p發生了極顯著的上調（=0.000198，圖6-D）。由此可知，當BCG感染RAW264.7巨噬細胞后，lincRNACox2與miR-129-5p特異性結合，從而進行海綿吸附作用。

2.7 miR-129-5p負調控AMPK的表達及糖酵解進程

為探究miR-129-5p能否靶向AMPK，本研究利用網站BiBiServ預測了miR-129-5p 與AMPK的相互作用位點（圖7-A），設計并合成了由AMPK的野生型3'-UTR序列驅動的熒光素酶報告基因，該序列包含潛在的miR-129-5p結合位點（AMPK-WT）或含有miR-129-5p結合位點（AMPK-MUT）的突變，將AMPK-WT質粒和AMPK-MUT質粒與NC或miR-129-5p mimics共轉染進293T細胞中。結果顯示（圖7-B），相較于NC組，轉染miR-129-5p mimics能夠顯著下調AMPK-WT質粒的熒光素酶活性（=0.000035），證明miR-129-5p與AMPK能夠發生相互作用。為進一步探究miR-129-5p與AMPK的表達關系，將miR-129-5p過表達載體轉染進RAW264.7巨噬細胞中從而檢測AMPK的表達量。Western blot結果表明（圖7-C, D），與BCG組相比，miR-129-5p mimics+BCG組中AMPK的表達量發生極顯著的下調（=0.000262）。由此可知miR-129-5p能夠負調控AMPK的表達。

為證明miR-129-5p是否能夠調控BCG感染的糖酵解進程，利用Western blot檢測糖酵解關鍵酶的表達變化。結果顯示（圖7-C），與BCG組相比，miR-129-5p mimics+BCG組中HK1（=0.019524，圖7-E）、PKM2（=0.001658，圖7-F）和LDHA（=0.000887，圖7-G）均發生顯著下調。因此，本研究進一步檢測了糖酵解下游乳酸的分泌情況，結果表明（圖7-H），miR-129-5p mimics+BCG組中的乳酸含量顯著低于BCG組（=0.044952）。由此可知，過表達miR-129-5p可以抑制BCG感染的RAW264.7巨噬細胞糖酵解進程。

因此，通過以上數據能夠證明，lincRNA Cox2能夠通過海綿吸附miR-129-5p對AMPK進行調控，進而對糖酵解關鍵酶己糖激酶（HK1）、丙酮酸激酶（PKM2）和乳酸脫氫酶（LDHA）的表達產生影響，最終調控乳酸的產量（圖8）。

A：在RAW264.7巨噬細胞中轉染小干擾RNA 24 h并感染BCG 12 h后，Western blot檢測糖酵解關鍵酶的表達情況；B：定量分析RAW264.7巨噬細胞中HK1的表達情況；C：定量分析RAW264.7巨噬細胞中PKM2的表達情況；D：定量分析RAW264.7巨噬細胞中LDHA的表達情況；E：si-lincRNA Cox2對乳酸分泌情況的影響；F：qPCR檢測IL-1β的表達情況；G：qPCR檢測TNF-α的表達情況；H：qPCR檢測IL-6的表達情況

*** P＜0.001

A：lincRNA Cox2和miR-129-5p的結合位點；B：雙熒光素酶報告基因證明lincRNA Cox2和miR-129-5p能夠發生相互作用；C：BCG感染RAW264.7巨噬細胞不同時間下miR-129-5p的表達；D：qPCR檢測干擾lincRNA Cox2后miR-129-5p的表達

3 討論

3.1 結核分枝桿菌感染巨噬細胞后激活糖酵解進程重編程

結核分枝桿菌作為結核病的致病菌，能夠通過氣溶膠從活動性肺部感染的個體傳播[23]。巨噬細胞作為首先被感染的免疫細胞，是一種研究結核分枝桿菌與宿主之間博弈過程的極佳介質。當巨噬細胞吞噬Mtb后，巨噬細胞啟動信號級聯反應，將其他免疫細胞募集到肺部，這種免疫細胞的募集會在感染部位周圍形成結核肉芽腫。而Mtb和巨噬細胞相互作用的平衡能夠影響肉芽腫的結局，進而抑制Mtb的感染進程或者促進Mtb的生長、增殖和全身擴散[24]。巨噬細胞被感染后會極化為兩種活化形式，其中M1型巨噬細胞的特征是依靠糖酵解產生能量，并積累產生促炎細胞因子、活性氧、一氧化氮和前列腺素所需的代謝中間體。因此，糖酵解進程重編程的發生以及病原體的存活是眾多調控因子相互作用的結果，其中的代謝機制并未完全闡明。

3.2 結核分枝桿菌感染巨噬細胞后LncRNA的作用機制

隨著高通量測序技術的發展及研究的深入，研究人員發現了大量的LncRNA。LncRNA是一類長度超過200個核苷酸的RNA，它們不會被翻譯成蛋白質產物，而是作為RNA分子發揮作用。LncRNA與大多數mRNA相似，在5′端有特殊帽子結構，3′端有聚腺苷酸。近來有研究表明，一些LncRNA具有小的開放閱讀框，能夠編碼有關鍵生物學功能的短肽，這說明LncRNA可以同時在RNA和肽中發揮雙重作用[25]。如LncRNA-EPS作為一種炎癥反應抑制劑，能在巨噬細胞中精確調控免疫反應基因（IRGs）的表達；LincRNA 00948可編碼一種跨膜α螺旋微肽—肌調蛋白，且僅在骨骼肌中表達，能夠直接與SERCA膜泵相互作用進而抑制肌質網中的鈣攝取[26-27]。此外，LncFAM200B還可能通過影響脂肪分化標志基因C/EBPα和AP2，及脂肪合成相關基因SIRT1和PTEN的表達進而影響牦牛肌內脂肪沉積[28]。LncRNA的研究多聚焦在microRNA上，進而對下游靶基因進行調控作用。其中，gga-miR-107-3p吸附LNC_003828影響MINPP1基因在靜原雞肌肉組織的相對表達，進而對IMP的含量產生影響，最終推測三者可能是影響肌肉肌苷酸特異性沉積的關鍵候選基因[29]。目前，LncRNA和miRNA用于宿主導向療法以及作為結核病的生物標志物的研究逐漸增多。據報道，LncRNA MIAT在BCG感染巨噬細胞后發生顯著上調，并能夠通過操縱miR-665/ULK1軸在自噬和抗菌作用中發揮負調節作用[30]。而lincRNA Cox2可以介導不同免疫基因的激活和抑制，并且在H37Rv感染的患者血液中發生高表達，能夠作為結核病診斷和治療靶點的新型生物標志物[31]。本研究發現lincRNA Cox2與miR-129-5p存在結合位點，經雙熒光素酶報告基因試驗證明lincRNA Cox2與miR-129-5p能夠發生特異性結合。并且當BCG感染RAW264.7巨噬細胞12 h后上調lincRNA Cox2的表達，下調miR-129-5p的表達。當干擾lincRNA Cox2后miR-129-5p的表達會上調，證明二者的表達存在負相關性。

A：miR-129-5p和AMPK的結合位點；B：雙熒光素酶報告基因證明miR-129-5p和AMPK能夠發生相互作用；C：在RAW264.7巨噬細胞中轉染miR-129-5p過表達載體24 h并感染BCG 12 h后，Western blot檢測AMPK及糖酵解關鍵酶的表達情況；D：定量分析RAW264.7巨噬細胞中AMPK的表達情況；E：定量分析RAW264.7巨噬細胞中HK1的表達情況；F：定量分析RAW264.7巨噬細胞中PKM2的表達情況；G：定量分析RAW264.7巨噬細胞中LDHA的表達情況；H：過表達miR-129-5p對乳酸分泌情況的影響

圖8 lincRNA Cox2通過miR-129-5p/AMPK調控BCG感染的巨噬細胞糖酵解的機制圖

3.3 lincRNA Cox2通過miR-129-5p/AMPK軸調控巨噬細胞糖酵解進程

AMPK已被證明能夠參與巨噬細胞糖酵解進程。研究表明，糖酵解能夠通過AMPK/SIRT1/NF-κB信號通路調控巨噬細胞焦亡[32]；腺苷酸激酶4（Ak4）能夠抑制AMPK的活化，使糖酵解重編程產生大量ROS，提高巨噬細胞的殺菌能力[33]。本研究發現，干擾lincRNA Cox2后上調了BCG感染的巨噬細胞中糖酵解進程的關鍵酶的活性，促進了乳酸的分泌，下調了促炎因子IL-1β、TNF-α和IL-6的表達，并降低了巨噬細胞菌載量。通常糖酵解的活性與促炎因子的分泌以及細胞對菌的清除能力呈正相關關系。但在敗血癥研究中發現，TGF-β可增強巨噬細胞的糖酵解水平，但下調炎癥因子的表達[34]。ó MAOLDOMHNAIGH等[35]研究也表明，Mtb感染會上調乳酸的分泌，而累積的乳酸會通過負反饋的形式，降低促炎細胞因子的表達。這與本研究的結果一致。此外，課題組前期研究發現，lincRNA Cox2對巨噬細胞的程序性死亡具有重要作用。方舒等人研究表明，干擾lincRNA Cox2可通過促進自噬體的形成，增強細胞自噬反應[36]；XU等[37]報道表明，干擾lincRNA Cox2可促進巨噬細胞凋亡的發生。亦有研究表明，乳酸可促進自噬并增強巨噬細胞對Mtb的清除作用[35]。最終胞內菌的存活，是眾多免疫通路轉歸的結果。結合他人研究，本研究認為干擾lincRNA-Cox2通過啟動細胞的程序性死亡進程，提高乳酸分泌，增強了細胞的殺菌能力。同時抑制了炎性因子的分泌，降低了因過度炎癥而損傷機體的風險，有助于組織的修復，提示其在結核病藥物治療靶點研發中的重要價值。

4 結論

BCG感染RAW264.7巨噬細胞后，干擾lincRNA Cox2通過miR-129-5p/AMPK軸上調巨噬細胞糖酵解關鍵酶的活性以及乳酸的分泌，并抑制炎癥因子的表達，最終抑制胞內菌的存活。

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lincRNA Cox2 Regulates BCG-infected Macrophages Glycolysis by miR-129-5p/AMPK

XU Lei, YU JiaLin, LIU Li, DENG GuangCun, WU XiaoLing

School of Life Sciences, Ningxia University/Key Lab of Ministry of Education for Protection and Utilization of Special Biological Resources in Western China, Yinchuan 750021

【Objective】 The aim of this study was to investigate the regulatory role of lincRNA Cox2 in the glycolysis of RAW264.7 macrophages infected byCalmette-Guerin (BCG), and to elucidate the interaction between Mtb and macrophages, so as to provide a new target for the diagnosis and treatment of tuberculosis.【Method】 RNA interference technique was used to knock down the expression of lincRNA Cox2, and miR-129-5p mimics were used to overexpress miR-129-5p. QPCR was performed to measure the lincRNA Cox2, miR-129-5p and proinflammatory cytokine ( IL-1β, TNF-α, and IL-6 ) expression after BCG infection. The expression of Lactic Acid was detected by Lactic Acid assay kit. The bacterial load was measured bacterial load in BCG-infected macrophages. Dual luciferase reporter gene system validation experiments were carried out on lincRNA Cox2 and miR-129-5p, or miR-129-5p and AMPK relationships. The expression of AMPK (AMP activated protein kinase), HK1 (Hexokinase 1), PKM2 (pyruvate kinase M2), and LDHA (Lactate dehydrogenase A) were detected by Western blotting. 【Result】 The expression of lincRNA Cox2 was significantly upregulated (=0.000013) after BCG infection in RAW264.7 macrophages for 12 h. Compared with the BCG group, the siRNA+BCG group had significantly upregulated the expression of AMPK (=0.000771), HK1 (=0.00323), PKM2 (=0.000135), LDHA (=0.002532), and the secretion of LD (=0.020802), but the expression of IL-1β (=0.000451), TNF-α (=0.000147), IL-6 (=0.0001) was significantly reduced. The lincRNA Cox2 knockdown caused a significant reduce of bacterial load in BCG-infected macrophages (=0.000127). Dual luciferase reporter gene system were performed to the co-localized of lincRNA Cox2 and miR-129-5p, and targeting AMPK. The expression of miR-129-5p was significantly reduced (=0.000156) after BCG infection in RAW264.7 macrophages for 12 h. Compared with the BCG group, the miR-129-5p mimics+BCG group had significantly reduced the expression of AMPK (=0.000262), HK1 (=0.019524), PKM2 (=0.001658), LDHA (=0.000887), and the secretion of LD (=0.044952). 【Conclusion】 lincRNA Cox2 promoted BCG-infected RAW264.7 macrophages glycolysis process by sponging miR-129-5p and targeting AMPK.

lincRNA Cox2; miR-129-5p; AMPK; BCG; macrophages; glycolysis

10.3864/j.issn.0578-1752.2024.08.014

2023-10-27；

2024-01-31

國家自然科學基金（32060160，32160162）、寧夏自然科學基金重點項目（2023AAC02015）

徐蕾，E-mail：xvleilearning@163.com。通信作者吳曉玲，E-mail：wuxiaol@nxu.edu.cn

（責任編輯 林鑒非）