棘孢木霉PT-29 與枯草芽孢桿菌S-16 共培養(yǎng)對馬鈴薯枯萎病的防控作用

張尹強(qiáng)，郝建秀，趙遠(yuǎn)征，王 東，周洪友

（1.內(nèi)蒙古農(nóng)業(yè)大學(xué) 園藝與植物保護(hù)學(xué)院，內(nèi)蒙古 呼和浩特 010018；2.生物農(nóng)藥創(chuàng)制與資源利用自治區(qū)高等學(xué)校重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，內(nèi)蒙古 呼和浩特 010018；3.內(nèi)蒙古自治區(qū)農(nóng)牧業(yè)科學(xué)院 植物保護(hù)研究所，內(nèi)蒙古 呼和浩特 010031）

馬 鈴 薯（Solanum tuberosumL.）屬 茄 科（Solanaceae）茄屬（Solanum）1 年生草本植物，是世界上第四大糧食作物，可為人體提供多種維生素等營養(yǎng)成分[1]。作為我國主糧化戰(zhàn)略中的重要成員，馬鈴薯有著較高的消費(fèi)價(jià)值，在我國糧食產(chǎn)業(yè)體系中占據(jù)重要地位[2]。目前，中國是世界上馬鈴薯種植面積最大、產(chǎn)量和收獲量也最大的國家[3]。但種植技術(shù)單一、輪作周期縮短、耕作水平下降等問題導(dǎo)致土壤微生物群落失調(diào)，馬鈴薯發(fā)生多種病害，其中由鐮刀菌屬引起的枯萎病發(fā)生較為嚴(yán)重[4-6]。

目前，在馬鈴薯生產(chǎn)中，使用化學(xué)藥劑是防治馬鈴薯枯萎病的主要措施，而化學(xué)農(nóng)藥的頻繁使用已對環(huán)境及食品安全產(chǎn)生嚴(yán)重影響[7]。生物防治具有無害且長效的優(yōu)點(diǎn)，是防治病害的有效方法之一[8-10]。芽孢桿菌對多種病原真菌以及多種病原細(xì)菌具有拮抗作用[11-15]。木霉菌也是一種重要的生防真菌，可通過競爭作用、產(chǎn)生抑菌次生代謝產(chǎn)物、重寄生和誘導(dǎo)植物抗病性等機(jī)制實(shí)現(xiàn)防治植物病害的目的[16-18]。到目前為止，從木霉中分離到的次級代謝產(chǎn)物已超過300 種，其中已經(jīng)有超過45 種具有殺菌殺蟲作用的抗生性代謝產(chǎn)物被鑒定出來，它們與其生產(chǎn)菌株的生物防治有效性直接相關(guān)[19]。然而，單一菌株的使用通常存在定殖不穩(wěn)定等問題，多種菌株聯(lián)合使用不僅可以提高抑菌活性，還能增強(qiáng)其適應(yīng)環(huán)境的能力[20-22]。左瑞雨等[23]研究表明，選用乳酸菌（Lactobacillus）和枯草芽孢桿菌（Bacillus subtilis）共培養(yǎng)對黃曲霉菌絲有明顯抑制作用。魏滟潔[24]發(fā)現(xiàn)，枯草芽孢桿菌與球毛殼菌（Chaetomium globosum）聯(lián)合處理對黃瓜枯萎病的防效好于單一生防菌處理。盡管木霉菌與芽孢桿菌均在生物防治方面應(yīng)用較廣，然而目前并沒有將二者共培養(yǎng)用來防治植物病害的先例，為了探究木霉菌與芽孢桿菌共培養(yǎng)對馬鈴薯枯萎病的防治效果，利用棘孢木霉PT-29 與枯草芽孢桿菌S-16 共培養(yǎng)發(fā)酵液對馬鈴薯枯萎病主要致病菌進(jìn)行抑菌試驗(yàn)，并使用共培養(yǎng)發(fā)酵液進(jìn)行馬鈴薯枯萎病盆栽防效試驗(yàn)，此外對馬鈴薯防御酶活性的變化進(jìn)行檢測，初步解釋棘孢木霉PT-29 和枯草芽孢桿菌S-16 共培養(yǎng)的生防機(jī)制，為馬鈴薯枯萎病的防治提供新思路。

1 材料和方法

1.1 供試菌株與培養(yǎng)基

供試病原菌為馬鈴薯枯萎病病原菌尖孢鐮刀菌（Fusarium oxysporum，F(xiàn)O）；供試生防真菌為棘孢木霉（Trichoderma asperellum）PT-29，供試生防細(xì)菌為枯草芽孢桿菌S-16。以上菌種均由內(nèi)蒙古農(nóng)業(yè)大學(xué)生物農(nóng)藥實(shí)驗(yàn)室分離、保存。

PDB 培養(yǎng)基：馬鈴薯200 g、葡萄糖20 g、蒸餾水1 L。PDA 培養(yǎng)基：馬鈴薯200 g、葡萄糖20 g、瓊脂20 g、蒸餾水1 L。LB培養(yǎng)基：胰蛋白胨10 g、酵母提取物10 g、氯化鈉5 g、瓊脂20 g。

1.2 供試種薯與試劑

馬鈴薯品種：費(fèi)烏瑞它。過氧化氫酶（CAT）活性、超氧化物歧化酶（SOD）活性、苯丙氨酸解氨酶（PAL）活性、過氧化物酶（POD）活性測定試劑盒購自Sinobestbio公司。

1.3 棘孢木霉PT-29與枯草芽孢桿菌S-16單培養(yǎng)及共培養(yǎng)發(fā)酵液的制備

打取菌株P(guān)T-29 菌餅置于PDA 平板中心，于28 ℃恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)3 d后，用無菌水洗滌孢子，用滅菌脫脂棉過濾，接種到PDB 培養(yǎng)基中，并將孢子最終濃度調(diào)為106cfu/mL。在180 r/min、28 ℃振蕩培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h，直至OD600值為1。將菌株S-16 在LB 培養(yǎng)基上培養(yǎng)2 d，挑單菌落接種到PDB培養(yǎng)基中，同樣在180 r/min、28 ℃振蕩培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h，直至OD600值為1。

將3 mL S-16 菌液單獨(dú)接種到100 mL PDB 培養(yǎng)基中，在180 r/min、28 ℃條件下發(fā)酵3 d，所得發(fā)酵液命名為B。同理，將3 mL PT-29 菌液單獨(dú)接種到100 mL PDB 培養(yǎng)基中，在180 r/min、28 ℃條件下發(fā)酵3 d，所得發(fā)酵液命名為T。將1 mL S-16 菌液與2 mL PT-29 菌液共同接種到100 mL PDB 培養(yǎng)基中，在180 r/min、28 ℃條件下發(fā)酵3 d，所得發(fā)酵液命名為B1T2；將2 mL S-16 與1 mL PT-29 共同接種到100 mL PDB 培養(yǎng)基中，在180 r/min、28 ℃條件下發(fā)酵3 d，所得發(fā)酵液命名為B2T1；將1.5 mL PT-29與1.5 mL S-16 共同接種到100 mL PDB 培養(yǎng)基中，在180 r/min、28 ℃條件下發(fā)酵3 d，所得發(fā)酵液命名為B1T1；將3 mL PDB 培養(yǎng)基接種到100 mL PDB 培養(yǎng)基中，在180 r/min、28 ℃條件下發(fā)酵3 d，所得發(fā)酵液為對照（CK）。

1.4 發(fā)酵濾液對病原菌的抑制試驗(yàn)

將尖孢鐮刀菌純化后備用。將1.3 中所得的各組發(fā)酵液通過0.22 μm 無菌過濾器過濾，獲得無菌發(fā)酵濾液。將各組發(fā)酵濾液10 mL 分別加至40 mL冷卻到55 ℃的PDA 培養(yǎng)基中，混勻后倒板，將尖孢鐮刀菌的菌餅倒置在平板中心，在25 ℃恒溫箱中培養(yǎng)3 d，測量其菌落直徑。

1.5 棘孢木霉PT-29與枯草芽孢桿菌S-16在共培養(yǎng)條件下的相互影響試驗(yàn)

將1.3 中制得的棘孢木霉PT-29 與枯草芽孢桿菌S-16 共培養(yǎng)及單一培養(yǎng)棘孢木霉PT-29 各處理發(fā)酵液中的菌絲收集，烘干后稱質(zhì)量；將棘孢木霉PT-29 與枯草芽孢桿菌S-16 共培養(yǎng)及單一培養(yǎng)枯草芽孢桿菌S-16 各處理發(fā)酵液收集后，使用LB 培養(yǎng)基進(jìn)行稀釋涂布計(jì)菌落數(shù)。評價(jià)棘孢木霉PT-29與枯草芽孢桿菌S-16對彼此生長的影響。

1.6 發(fā)酵液對馬鈴薯枯萎病的盆栽防效試驗(yàn)

設(shè)置5 個(gè)處理，分別為單一的棘孢木霉菌發(fā)酵液+尖孢鐮刀菌處理（T+FO），枯草芽孢桿菌發(fā)酵液+尖孢鐮刀菌處理（B+FO），以及接種比例為1∶1的棘孢木霉菌、枯草芽孢桿菌共培養(yǎng)發(fā)酵液＋尖孢鐮刀菌處理（B1T1+FO），單獨(dú)尖孢鐮刀菌處理（FO）和空白對照（CK）。具體方法為，先將各處理的發(fā)酵液稀釋20倍后備用。挑選表皮色澤光鮮、無龜裂及病斑的費(fèi)烏瑞它種薯播種于育苗盆中，每盆1株，在18 ℃溫室條件下培養(yǎng)。將尖孢鐮刀菌菌餅接種于PDB 培養(yǎng)基中，28 ℃、150 r/min 振蕩培養(yǎng)7 d，除去菌絲后制成107個(gè)/mL 的孢子懸浮液備用。待馬鈴薯植株長到第5～6片復(fù)葉時(shí)，將根部周圍的土掘起，用針在莖基部刺6下后將配制好的尖孢鐮刀菌懸浮液倒入，30 min 后再將各處理發(fā)酵液倒入并覆土，每個(gè)處理3次重復(fù)。以上所用馬鈴薯枯萎病菌孢子懸浮液和各處理發(fā)酵液的用量均為50 mL/盆。待單獨(dú)尖孢鐮刀菌處理表現(xiàn)出明顯枯萎癥狀時(shí)，參考馬鈴薯枯萎病病情分級標(biāo)準(zhǔn)[25]進(jìn)行調(diào)查，統(tǒng)計(jì)馬鈴薯植株發(fā)病情況并計(jì)算病情指數(shù)與防效。病情指數(shù)=100×∑（各級病株數(shù)×相對級數(shù)值）/（調(diào)查總株數(shù)×最高級數(shù)值），防效=（對照病情指數(shù)-處理病情指數(shù)）/對照病情指數(shù)×100%[26]。

1.7 馬鈴薯防御酶活性測定

待馬鈴薯長到第5～6 片復(fù)葉時(shí)，選取長勢一致的植株按照1.6 方法處理，于1、3、5、7、9 d 采集各處理馬鈴薯葉片3 g，分別裝于錫箔紙中液氮速凍后放入-80 ℃下保存，供酶活性測定使用。按照酶活性測定試劑盒說明書要求，提取馬鈴薯葉片組織粗酶液，使用酶活性測定試劑盒測定PAL、SOD、POD、CAT的活性。

1.8 數(shù)據(jù)處理與分析

使用SPSS 25.0 軟件進(jìn)行單因素方差分析，Duncan’s法進(jìn)行多重比較。使用Graphpad 8.0軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)分析并作圖。

2 結(jié)果與分析

2.1 PT-29與S-16單獨(dú)培養(yǎng)及共培養(yǎng)發(fā)酵液形態(tài)及對尖孢鐮刀菌的抑制作用

本試驗(yàn)首次嘗試了枯草芽孢桿菌S-16 和棘孢木霉PT-29 的液體共培養(yǎng)。觀察到其各自單獨(dú)培養(yǎng)3 d 后，S-16 的發(fā)酵液（B）呈乳白色懸液，而PT-29的發(fā)酵液（T）顏色相對較淺且呈米黃色，菌絲較為密集。PT-29 與S-16 接種比例為1∶1 時(shí)，共培養(yǎng)3 d 后發(fā)酵液B1T1 呈亮黃色，可以明顯看到菌絲體，但較為稀薄。此外，當(dāng)S-16 與PT-29 的接種比例為2∶1時(shí)，共培養(yǎng)3 d后發(fā)酵液B2T1為微黃色，此時(shí)芽孢桿菌占優(yōu)勢，有少量的PT-29 菌絲體聚集在一起（表1）。

表1 PT-29與S-16單培養(yǎng)及共培養(yǎng)發(fā)酵液的形態(tài)Tab.1 Morphology of single culture and co-culture fermentation broth of PT-29 and S-16

在觀測發(fā)酵液對尖孢鐮刀菌的抑制效果時(shí)，發(fā)現(xiàn)共培養(yǎng)發(fā)酵液B2T1和B1T2對尖孢鐮刀菌的抑制效果高于單獨(dú)培養(yǎng)的發(fā)酵液T，但低于單獨(dú)培養(yǎng)的發(fā)酵液B。共培養(yǎng)發(fā)酵液B1T1 的抑制效果好于單獨(dú)培養(yǎng)的發(fā)酵液B 和單獨(dú)培養(yǎng)的發(fā)酵液T，且好于共培養(yǎng)發(fā)酵液B2T1 和B1T2。相比于對照，共培養(yǎng)發(fā)酵液B1T1 處理后尖孢鐮刀菌的菌落直徑最小，抑制率最高（圖1、2，表2）。由此可見，共培養(yǎng)發(fā)酵液B1T1 對尖孢鐮刀菌的抑制效果最好，顯著高于其他發(fā)酵液組合。

圖1 不同處理發(fā)酵液對尖孢鐮刀菌的抑制效果Fig.1 Inhibitory effect of fermentation broth on Fusarium oxysporum

圖2 尖孢鐮刀菌在各處理發(fā)酵液抑制下的菌落直徑Fig.2 Colony diameter of Fusarium oxysporum inhibited by fermentation solution of each treatment

表2 PT-29與S-16單培養(yǎng)及共培養(yǎng)發(fā)酵濾液對尖孢鐮刀菌的抑制率Tab.2 Inhibition rates of PT-29 and S-16 single culture and co-culture fermentation filtrate against Fusarium oxysporum

2.2 PT-29與S-16在共培養(yǎng)條件下的相互影響

由圖3A 可知，單獨(dú)培養(yǎng)的發(fā)酵液B 中S-16 菌量顯著多于共培養(yǎng)B2T1、B1T2 中S-16 的菌量，但共培養(yǎng)發(fā)酵液B1T1 中S-16 菌量顯著多于單培養(yǎng)B發(fā)酵液，可能是由于共培養(yǎng)比例為1∶1 時(shí)，木霉菌PT-29 會促進(jìn)芽孢桿菌S-16 的生長。由圖3B 可知，單獨(dú)培養(yǎng)的發(fā)酵液T中木霉菌菌絲干質(zhì)量最大，顯著高于發(fā)酵液B1T1、B2T1、B1T2 處理，所以單獨(dú)培養(yǎng)的發(fā)酵液T 中PT-29 數(shù)量最多，發(fā)酵液B1T2 中的菌絲干質(zhì)量也顯著高于發(fā)酵液B1T1、B2T1，但發(fā)酵液B1T1 的菌絲干質(zhì)量與發(fā)酵液B2T1 沒有顯著差異。

圖3 PT-29與S-16在共培養(yǎng)條件下的相互影響Fig.3 Interaction between PT-29 and S-16 under co-culture conditions

2.3 不同處理發(fā)酵液對馬鈴薯枯萎病的盆栽防治效果

由表3 可知，B+FO 處理和T+FO 處理的防效分別為60.09%和54.85%。B1T1+FO 處理的植株病情指數(shù)顯著小于FO 處理，且防治效果達(dá)到73.44%，顯 著高于B+FO處理及T+FO處理。

表3 不同處理發(fā)酵液對馬鈴薯枯萎病的盆栽防治效果Tab.3 Effect of different treatment of fermentation broth on potted potato Fusarium wilt

2.4 不同處理發(fā)酵液對馬鈴薯防御酶活性的影響

由圖4A 可以看出，B1T1+FO、T+FO 和B+FO 處理馬鈴薯CAT活性峰值均出現(xiàn)在處理后第3天和第7 天，且上述處理均在第3 天達(dá)到最高峰值，以B1T1+FO 處理最高峰值最大，較FO 處理提高56.44%，較B+FO 和T+FO 處理分別提高21.13%和4.90%，B+FO 和T+FO 處 理 較FO 處 理 分 別 提 高31.15%和51.51%。雖然B1T1+FO 處理CAT 活性峰值在處理第3 天之后迅速下降，但此后仍高于其他處理。CK 的CAT 活性無明顯變化，一直保持在較低水平。

圖4 不同發(fā)酵液處理對馬鈴薯防御酶活性的影響Fig.4 Effects of different fermentation broth treatments on defense enzyme activities of potato

由圖4B 可以出，不同處理馬鈴薯SOD 活性水平存在顯著差異，活性達(dá)峰的時(shí)間也不同。其中，B1T1+FO 處理在第5 天出現(xiàn)峰值，此時(shí)，B1T1+FO處理較FO 處理提高766.89%，較T+FO 和B+FO 處理分別提高54.91%和332.96%，B+FO 和T+FO 處理較FO 處理分別提高100.22%和459.62%。總體來看，B1T1+FO 處理的馬鈴薯SOD 活性整體上均高于B+FO、T+FO、FO及CK處理。

從圖4C可以看出，B+FO、B1T1+FO處理馬鈴薯POD 活性在第3～5 天快速升高，B+FO 處理在第5 天達(dá)到峰值，B1T1+FO處理POD活性持續(xù)升高，但第9天時(shí)活性仍低于B+FO 處理的最大峰值。T+FO 處理馬鈴薯POD 活性在第3 達(dá)到峰值，F(xiàn)O 處理POD活性在第1～3天迅速升高后開始回落，CK的POD活性一直變化較小。在所有處理中，B+FO 的平均POD 活性最高，B1T1+FO 處理POD 活性最高峰值相比于FO 處理提高111.84%，相較于B+FO 和T+FO處理則分別提高26.77%和138.95%，而此時(shí)的B+FO 處理較FO 處理提高67.11%，T+FO 處理較FO 處理則降低11.34%。

由圖4D 可知，B1T1+FO 處理馬鈴薯PAL 活性在處理后第3 天達(dá)到第1 個(gè)峰值。B+FO 處理PAL活性在處理后第5～7天保持較高水平。B1T1+FO處理PAL活性在第7天達(dá)到最高峰值，相比于FO處理提高179.34%，較B+FO 和T+FO 處理分別提高10.47%和18.75%，此時(shí)的B+FO 和T+FO 處理較FO處理分別提高152.88%和135.24%。總體來看，B1T1+FO處理PAL平均活性最高。

3 結(jié)論與討論

本試驗(yàn)首次將棘孢木霉PT-29 與枯草芽孢桿菌S-16 共培養(yǎng)，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，共培養(yǎng)接種比例為1∶2、2∶1時(shí)，其抑菌效果均好于單培養(yǎng)棘孢木霉，但不如單培養(yǎng)枯草芽孢桿菌，而當(dāng)2 株菌共培養(yǎng)接種比例為1∶1 時(shí)，其抑菌效果與盆栽防效均優(yōu)于其他所有處理。將不同組合生防菌株進(jìn)行共培養(yǎng)誘導(dǎo)其產(chǎn)生某些次生代謝產(chǎn)物能夠達(dá)到抑制病原菌生長的作用[27-28]。當(dāng)2 株菌共培養(yǎng)接種比例為1∶1 時(shí)，棘孢木霉PT-29會促進(jìn)枯草芽孢桿菌S-16的生長，所以共培養(yǎng)的抑菌物質(zhì)可能主要是由枯草芽孢桿菌提供的。與單培養(yǎng)棘孢木霉相比，接種枯草芽孢桿菌進(jìn)行共培養(yǎng)后，棘孢木霉的菌絲干質(zhì)量下降，生長受到了抑制。KARUPPIAH 等[29]通過不同接種方式評價(jià)了棘孢木霉與解淀粉芽孢桿菌在共培養(yǎng)體系中的生長情況，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，在共培養(yǎng)體系中解淀粉芽孢桿菌會導(dǎo)致棘孢木霉生長速率下降，這與本研究的結(jié)果基本一致。

與單一培養(yǎng)相比，2 種或多種菌株的共培養(yǎng)能夠促進(jìn)菌株分泌更多種類和更高產(chǎn)量的次級代謝產(chǎn)物，而菌株的次生代謝產(chǎn)物通常與其抑菌活性有關(guān)[30]。SUN 等[31]優(yōu)化了曲霉和枯草芽孢桿菌共培養(yǎng)的發(fā)酵條件，提高了枯草芽孢桿菌活性代謝產(chǎn)物的產(chǎn)生，優(yōu)化后，共培養(yǎng)提取物對金黃色葡萄球菌的抑制率為74.62%，比初始條件提高了29.20%。LIU等[32]研究綠色木霉SG3403 和枯草芽孢桿菌22 對小麥赤霉病的防治效果時(shí)發(fā)現(xiàn)，共培養(yǎng)制得的種衣劑通過觸發(fā)寄主植物防御基因PR1、PR3、PR4、PR5、ACS和SOD的表達(dá)，對小麥赤霉病有顯著的抗感染作用。病原菌侵染寄主后，會導(dǎo)致植株體內(nèi)活性氧含量失調(diào)，使植物細(xì)胞膜系統(tǒng)遭受損傷，影響植物抗病能力[33]。CAT、SOD、POD、PAL是與植物抗病相關(guān)的防御酶。本研究發(fā)現(xiàn)，經(jīng)過共培養(yǎng)發(fā)酵液處理后的馬鈴薯，以上防御酶活性相比FO 處理均有不同程度的提高。除POD外，相比于PT-29或S-16單培養(yǎng)發(fā)酵液處理而言，這2 株菌共培養(yǎng)后處理的馬鈴薯防御酶平均活性更高，說明棘孢木霉PT-29 與枯草芽孢桿菌S-16 在病原菌侵染馬鈴薯植株過程中激發(fā)了馬鈴薯更高水平的抗病能力。周林等[34]發(fā)現(xiàn)，枯草芽孢桿菌接種于香蕉葉片后，各防御酶活性均有不同程度的提高，與本研究結(jié)果基本一致。

鑒于不同生防菌以及不同病害的作用方式不同，生防菌相互之間的作用機(jī)制也十分復(fù)雜，生防菌的聯(lián)合使用會涉及一系列復(fù)雜的反應(yīng)。今后，將進(jìn)一步探索共培養(yǎng)發(fā)酵體系中抗菌活性成分的分離提取、代謝途徑差異等機(jī)制研究，為生防菌劑產(chǎn)業(yè)化提供理論支持。