冬凌草藥渣固體發酵工藝條件優化

陳 璐，周省委，徐可可，張高陽，劉汶澤，曹小鳳，楊林林，董誠明

（1.河南中醫藥大學 藥學院，河南 鄭州 450046；2.河南省道地藥材生態種植工程技術研究中心，河南 鄭州 450046）

冬凌草為唇形科植物碎米椏[Rabdosia rubescens（Hemsl.）Hara]的干燥地上部分。氣微香，味苦、甘，微寒，歸肺、胃、肝經，其主要活性成分有萜類、甾體、黃酮、揮發油、有機酸等成分，具有抗腫瘤、抗菌消炎、抗氧化、免疫增強等作用[1]。中藥藥渣是中藥制藥過程中產生的主要廢棄物，每年產量高達數千萬噸，其中殘留多種有效成分并且仍具有蛋白質、淀粉、多糖等營養物質[2]。前期調研發現，冬凌草藥材生產過程中主要提取了冬凌草甲素、冬凌草乙素等活性成分，產生大量以葉為主的藥渣，而藥渣中還含有未完全提取的齊墩果酸、熊果酸等有效成分及營養物質，但尚未有相關藥渣的綜合利用研究，這不僅造成了中藥資源的浪費，還對環境造成了危害，制約了中藥綠色產業經濟的健康發展。齊墩果酸又名土當歸酸，屬五環三萜類化合物，具有抗炎、抗腫瘤、抗糖尿病、抗動脈粥樣硬化、保肝、抗骨質疏松等作用[3]；熊果酸又名烏索酸，屬三萜類化合物，具有鎮靜、抗炎、抗病毒、抗腫瘤、抗氧化和保肝等多種藥理活性[4]。楊夕鳴等[5]通過研究齊墩果酸和熊果酸的關鍵分子機制，發現其對腫瘤既有直接抑制作用，也能以調控機體免疫力間接表現抗腫瘤效果。夏禹等[6]研究發現，溫莪術藥渣再提取后仍含有多種姜黃素類化合物、莪術二酮等活性成分，進行分離純化后可得到安全有效的抗氧化劑。付亮等[7]水提淫羊藿藥渣，發現藥渣中含有大量黃酮類物質和少量的多糖，仍具有一定的藥效和抗氧化活性。雷茜等[8]研究發現，苦豆子藥渣中富含粗蛋白、粗纖維及磷等微量元素，營養價值較高，可二次利用生產蛋白質飼料。酵母菌、乳酸菌、芽孢桿菌等是常用的益生菌[9-11]，諸多研究表明，飼料中添加酵母菌、乳酸菌可以讓動物消化吸收得到改善，機體免疫力明顯提高[12-16]。因此，酵母菌、乳酸菌經常作為天然的飼料添加劑應用于中藥藥渣再利用生產中[17]。嗜酸乳桿菌是人類和動物腸道中的一種重要的乳酸菌，具有維持腸道菌群平衡、提高動物生產性能和機體免疫功能等作用，且其耐酸性強，能夠利用葡萄糖、果糖、乳糖和蔗糖等進行發酵并產生乳酸等有機酸[18]。固體發酵具有生產成本相對較低、代謝物得到充分保留、儲存和運輸方便等優點，更適應于生產的要求[19]。向宇[20]采用益生菌組合固體發酵甘草藥渣，發現甘草黃酮析出量增多，纖維素酶和酸性蛋白酶活力增加。陳華[21]研究發現，混合菌固體發酵黃芪藥渣產生的纖維素酶可有效降解藥渣纖維素，促進藥渣中黃芪甲苷的析出。戴德慧等[22]的研究結果表明，酵母菌和乳酸菌發酵丹參藥渣，可溶性多糖和真蛋白含量增加。因此，探討中藥藥渣合理利用途徑是節約生態資源、推動畜牧業減抗增效的可行措施之一。

以冬凌草藥渣為主要原料，利用IBM SPSS Statistics 26.0 對測定指標進行相關性和主成分分析，綜合評價確定適合冬凌草藥渣固體發酵的條件，旨在通過酵母菌和乳酸菌固體發酵，降低其中的纖維素含量，促進殘留活性成分析出，增加粗蛋白、粗脂肪、鈣、粗灰分、賴氨酸含量，提高冬凌草藥渣利用率，解決廢棄冬凌草藥渣大量浪費的問題，為提升中藥生態產業，生產綠色、安全的冬凌草藥渣微生態添加劑提供參考。

1 材料和方法

1.1 材料與試劑

冬凌草藥渣：河南濟世藥業有限公司；酵母菌：釀酒酵母，安琪酵母股份有限公司；嗜酸乳桿菌：北京北納創聯生物技術研究院；齊墩果酸標準品、熊果酸標準品均購于上海源葉生物科技有限公司，其他常用化學試劑均為市售分析純。

1.2 儀器與設備

RTOP-430D智能人工氣候培養箱：浙江托普儀器有限公司；HY-8 調速振蕩器：國華電器有限公司；LDZM-80KCS 型立式壓力蒸汽滅菌器：上海申安醫療器械廠；Agilent 1260 型高效液相色譜儀：美國安捷倫公司。

1.3 方法

1.3.1 樣品前處理 將冬凌草藥渣打成粉末，過篩，粒度為0.425 mm，保存于干燥器中。

1.3.2 試驗方法 酵母菌接種液制備：將轉接復活的酵母菌接種在YPD平板培養基上，28 ℃溫度條件下培養2 d，挑取單一菌落制備1×108cfu/mL菌懸液，將菌懸液按1%接種量接種在YPD 液體培養基中，28 ℃、160 r/min 培養24 h，得酵母菌接種液。乳酸菌接種液制備：將轉接復活的酵母菌接種在MRS平板培養基上，37 ℃溫度條件下培養3 d，挑取單一菌落制備1×108cfu/mL 菌懸液，將菌懸液按1%接種量接種在MRS 液體培養基中，37 ℃、100 r/min 培養48 h，得乳酸菌接種液。

取上述接種液1 mL，離心后棄去上清液，將沉淀稀釋至1 mL，振蕩混勻后使用酶標儀測其OD600值，根據測得OD600值將酵母菌接種液稀釋或濃縮至OD600=0.6，乳酸菌接種液稀釋或濃縮至OD600=0.5，用于之后接種。

固體發酵方法：稱取1.3.1 中冬凌草藥渣粉末100 g 置于600 mL 蘭花瓶中，加去離子水調整料液比為1∶1.2，滅菌，冷卻后接種9%酵母菌或乳酸菌接種液，攪拌均勻，置于28 ℃恒溫恒濕條件下靜置培養6 d，隔24 h翻料一次，每組設置3個重復。

1.3.3 冬凌草藥渣固體發酵培養條件優化

1.3.3.1 接種量對固體發酵的影響 將1.3.2 中的接種液以3%、6%、9%、12%、15%的接種量接種于料液比為1∶1.2 的固體發酵培養基中，在28 ℃溫度條件下培養6 d。

1.3.3.2 料液比對固體發酵的影響 將1.3.2 中的接種液以9%的接種量接種在固體發酵培養基中，分別選擇1∶0.8、1∶1.0、1∶1.2、1∶1.4、1∶1.6 的料液比，在28 ℃溫度條件下培養6 d。

1.3.3.3 時間對固體發酵的影響 將1.3.2 中的接種液以9%的接種量接種于料液比為1∶1.2 的固體發酵培養基中，在28 ℃溫度條件下分別培養1、3、6、9、12 d。

1.3.3.4 溫度對固體發酵的影響 將1.3.2 中的接種液以9%的接種量接種于料液比為1:1.2的固體發酵培養基中，酵母菌分別在25、28、31、34、37 ℃的溫度條件下發酵6 d，乳酸菌分別在23、28、33、38、42 ℃的溫度條件下發酵6 d。

1.3.4 測定方法 粗蛋白含量測定方法：采用凱氏法，參照《飼料中粗蛋白的測定凱氏定氮法》（GB/T 6432—2018）；粗纖維含量測定方法：采用過濾法，參照《飼料中粗纖維的含量測定方法》（GB/T 6434—2006）；粗脂肪含量測定方法：參照《飼料中粗脂肪的測定》（GB/T 6433—2006）；鈣含量的測定方法：采用乙二胺四乙酸二鈉絡合滴定法，參照《飼料中鈣的測定》（GB/T 6436—2018）；粗灰分含量的測定方法：參照《飼料中粗灰分的測定》（GB/T 6438—2007）；賴氨酸含量的測定方法：采用常規酸水解法，參照《飼料中氨基酸的測定》（GB/T 18246—2019）。冬凌草藥渣齊墩果酸、熊果酸含量的測定參考崔田[23]的方法略有改動，色譜柱:安捷倫ZORBAX SB-Cl8 色譜柱（4.6 mm×250 mm，5 μm）；柱溫:30 ℃；流動相:甲醇-0.2% 醋酸溶液（88∶12）；流速:1.0 mL/min；檢測波長:210 nm；進樣量10 μL；采用外標法進行定量。

1.4 數據與處理

用Excel 2022 整理數據，利用IBM SPSS Statistics 26.0 軟件進行Pearson 相關性分析和主成分分析，利用GraphPad Prism 9 軟件處理數據并作圖，利用ChiPlot 工具在https://www.chiplot.online 作組間相關性分析熱圖。

2 結果與分析

2.1 接種量對固體發酵的影響

2.1.1 酵母菌接種量對固體發酵的影響 從圖1可以看出，加入不同接種量酵母菌接種液后，粗蛋白含量整體呈緩慢上升趨勢，15%接種量時粗蛋白含量最高，比原藥渣增加0.62%；粗纖維含量變化呈W形，12%接種量時粗纖維含量最低，比原藥渣減少21.70%；粗脂肪含量先下降后升高再呈下降趨勢，3% 接種量時粗脂肪含量最高，比原藥渣減少30.77%；鈣含量先升高后下降再升高，15%接種量時鈣含量最高，比原藥渣增加5.56%；粗灰分含量先下降后呈緩慢上升趨勢，3%接種量時粗灰分含量最高，比原藥渣增加10.53%；賴氨酸含量整體呈緩慢上升趨勢，15%接種量時賴氨酸含量最高。從表1 可以看出，酵母菌6%接種量時，熊果酸含量最高，為0.38 mg/g，比原藥渣增加2.70%，此時齊墩果酸含量為0.20 mg/g；酵母菌15%接種量時，齊墩果酸含量最高為0.21 mg/g，比原藥渣增加5.00%，此時熊果酸含量為0.36 mg/g。

表1 酵母菌接種量對冬凌草藥渣中齊墩果酸及熊果酸含量的影響Tab.1 Effect of inoculation amount of yeast on the content of oleanolic acid and ursolic acid in residue of Rabdosia rubescens（Hemsl.）Hara

圖1 不同接種量對冬凌草藥渣各產物的影響Fig.1 Effect of different inoculation amount on the products in residue of Rabdosia rubescens（Hemsl.）Hara

2.1.2 乳酸菌接種量對固體發酵的影響 從圖1可以看出，加入不同接種量乳酸菌接種液后，粗蛋白含量先下降后緩慢升高，3%接種量時粗蛋白含量最高，比原藥渣增加14.14%；粗纖維含量先下降后升高，6%接種量時粗纖維含量最低，比原藥渣減少17.22%；粗脂肪含量先下降后升高，12%接種量時粗脂肪含量最高，比原藥渣減少15.38%；鈣含量變化呈M 形降低，6%接種量時鈣含量最高，比原藥渣增加44.44%；粗灰分含量先下降后趨于穩定，9%接種量時粗灰分含量最高，比原藥渣增加25.00%；賴氨酸含量先下降后升高再下降，3%接種量時賴氨酸含量最高，比原藥渣增加6.06%。從表2 可以看出，乳酸菌接種量的改變對齊墩果酸和熊果酸含量的提升沒有太大效果。

表2 乳酸菌接種量對冬凌草藥渣中齊墩果酸及熊果酸含量的影響Tab.2 Effect of inoculation amount of lactic acid bacteria on the content of oleanolic acid and ursolic acid in residue of Rabdosia rubescens（Hemsl.）Hara

2.2 料液比對固體發酵的影響

2.2.1 酵母菌料液比對固體發酵的影響 從圖2可以看出，酵母菌料液比變化對冬凌草藥渣固體發酵檢測產物鈣含量、粗灰分含量、賴氨酸含量的影響不大。酵母菌發酵，料液比變化時，粗蛋白含量緩慢降低，料液比1∶0.8 時粗蛋白含量最高，比原藥渣增加23.32%；粗纖維含量先下降后緩慢升高，料液比1∶1 時粗纖維含量最低，比原藥渣減少26.65%；粗脂肪含量隨著發酵中含水量的增加緩慢降低，料液比1∶0.8 時粗脂肪含量最高，比原藥渣減少15.38%。從表3 可以看出，酵母菌發酵，料液比1∶1.0 時間時熊果酸含量最高，為0.45 mg/g，比原藥渣增加21.62%，此時齊墩果酸含量為0.22 mg/g；料液比1∶1.2 時齊墩果酸含量最高，比原藥渣增加20.00%，此時熊果酸含量為0.42 mg/g。

表3 酵母菌料液比對冬凌草藥渣中齊墩果酸及熊果酸含量的影響Tab.3 Effect of yeast material-liquid ratio on the content of oleanolic acid and ursolic acid in residue of Rabdosia rubescens（Hemsl.）Hara

圖2 不同料液比對冬凌草藥渣各產物的影響Fig.2 Effect of different ratio of material to liquid on the products in residue of Rabdosia rubescens（Hemsl.）Hara

2.2.2 乳酸菌料液比對固體發酵的影響 從圖2可以看出，乳酸菌發酵料液比變化時，粗蛋白含量整體呈下降趨勢，料液比1∶0.8 時粗蛋白含量最高，比原藥渣增加36.22%；粗纖維含量先下降后緩慢升高，料液比1∶1.0 時粗纖維含量最低，比原藥渣減少26.65%；粗脂肪含量先升高后下降，料液比1∶1.4 時粗脂肪含量最高，比原藥渣增加46.15%。從表4 可以看出，乳酸菌發酵，料液比1∶0.8 時齊墩果酸和熊果酸含量最高，比原藥渣增加10.00%、18.92%。

表4 乳酸菌料液比對冬凌草藥渣中齊墩果酸及熊果酸含量的影響Tab.4 Effect of material-liquid ratio of lactic acid bacteria on the content of oleanolic acid and ursolic acid in residue of Rabdosia rubescens（Hemsl.）Hara

2.3 發酵時間對固體發酵的影響

2.3.1 酵母菌發酵時間對固體發酵的影響 從圖3

圖3 不同固體發酵時間對冬凌草藥渣各產物的影響Fig.3 Effect of different solid fermentation time on the products in residue of Rabdosia rubescens（Hemsl.）Hara

可以看出，酵母菌發酵后，粗蛋白含量先下降后呈上升趨勢，在發酵1 d 時含量最高，比原藥渣增加9.39%；粗纖維含量變化呈N 形，在發酵9 d 時含量最低，比原藥渣減少12.26%；粗脂肪含量先升高并在發酵3 d 后趨于穩定，在發酵3 d 時含量最高，比原藥渣增加23.07%；鈣含量先下降后升高，在發酵9 d 時含量最高，比原藥渣增加31.48%；粗灰分含量先升高后下降，在發酵3 d 時含量最高，比原藥渣增加19.74%；賴氨酸含量隨著發酵時間逐步升高，在發酵9 d 時含量最高，比原藥渣增加6.06%。從表5可以看出，酵母菌發酵3 d，齊墩果酸及熊果酸含量最高，比原藥渣增加15.00%、16.22%。

表5 酵母菌固體發酵時間對冬凌草藥渣中齊墩果酸及熊果酸含量的影響Tab.5 Effect of solid fermentation time of yeast on the content of oleanolic acid and ursolic acid in residue of Rabdosia rubescens（Hemsl.）Hara

2.3.2 乳酸菌發酵時間對固體發酵的影響 從圖3可以看出，乳酸菌發酵后，粗蛋白含量先下降后升高，在發酵9 d時含量最高，比原藥渣增加9.39%；粗纖維含量先下降后緩慢升高，在發酵3 d 時含量最低，比原藥渣減少7.78%；粗脂肪含量隨著發酵時間緩慢升高，在發酵9 d 時含量最高，比原藥渣增加38.46%；鈣含量先下降后升高，在發酵12 d 時含量最高，比原藥渣增加37.04%；粗灰分含量先降低后呈上升趨勢，在發酵12 d 時含量最高，比原藥渣增加15.79%；賴氨酸含量先下降后緩慢上升，在發酵12 d時含量最高，比原藥渣增加3.03%。從表6可以看出，乳酸菌發酵1 d，齊墩果酸及熊果酸含量最高，比原藥渣增加15.00%、18.92%。

表6 乳酸菌固體發酵時間對冬凌草藥渣中齊墩果酸及熊果酸含量的影響Tab.6 Effect of solid fermentation time of lactic acid bacteria on the content of oleanolic acid and ursolic acid in residue of Rabdosia rubescens（Hemsl.）Hara

2.4 溫度對固體發酵的影響

2.4.1 酵母菌發酵溫度對固體發酵的影響 從圖4可以看出，酵母菌發酵溫度變化時，粗蛋白含量整體呈上升趨勢，發酵溫度37 ℃粗蛋白含量最高，比原藥渣增加9.60%；粗纖維含量先下降后上升再下降，發酵溫度27 ℃粗纖維含量最低，比原藥渣減少13.68%；粗脂肪含量先下降后升高，發酵溫度37 ℃粗脂肪含量最高為1.30%；鈣含量先下降后升高，發酵溫度37 ℃鈣含量最高，比原藥渣增加29.63%；粗灰分含量整體呈上升趨勢，發酵溫度37 ℃粗灰分含量最高，比原藥渣增加17.11%；賴氨酸含量整體呈上升趨勢，發酵溫度37 ℃賴氨酸含量最高，比原藥渣增加12.12%。從表7 可以看出，酵母菌發酵溫度25 ℃時，齊墩果酸和熊果酸含量最高，比原藥渣增加10.00%、8.10%。

表7 酵母菌固體發酵溫度對冬凌草藥渣中齊墩果酸及熊果酸含量的影響Tab.7 Effect of solid fermentation temperature of yeast on the content of oleanolic acid and ursolic acid in residue of Rabdosia rubescens（Hemsl.）Hara

圖4 不同固體發酵溫度對冬凌草藥渣中各產物的影響Fig.4 Effects of different solid fermentation temperatures on the products in residue of Rabdosia rubescens（Hemsl.）Hara

2.4.2 乳酸菌發酵溫度對固體發酵的影響 從圖4可以看出，乳酸菌發酵溫度變化時，粗蛋白含量、粗纖維含量、鈣含量、粗灰分含量變化不大，粗脂肪含量先升高后降低，發酵溫度28 ℃粗脂肪含量最高，比原藥渣增加46.15%；賴氨酸含量先下降后趨于穩定，發酵溫度23 ℃賴氨酸含量最高，比原藥渣增加21.21%。從表8 可以看出，乳酸菌發酵溫度變化對齊墩果酸和熊果酸含量增加沒有顯著效果。

表8 乳酸菌固體發酵溫度對冬凌草藥渣中齊墩果酸及熊果酸含量的影響Tab.8 Effect of solid fermentation temperature of lactic acid bacteria on the content of oleanolic acid and ursolic acid in residue of Rabdosia rubescens（Hemsl.）Hara

2.5 酵母菌和乳酸菌固體發酵冬凌草藥渣產物相關性分析

2.5.1 酵母菌固體發酵冬凌草藥渣產物相關性分析 采用IBM SPSS Statistics 26.0 對酵母菌發酵冬凌草藥渣不同檢測產物進行組內Pearson 相關性分析，結果如圖5所示，齊墩果酸與粗脂肪相關性達到0.45 呈顯著正相關，與熊果酸相關性達到0.86 極顯著正相關；粗蛋白與鈣、粗灰分、賴氨酸相關性分別達到0.95、0.97、0.90 呈極顯著正相關，與粗纖維相關性達到-0.87 呈極顯著負相關；粗纖維與鈣、粗灰分、賴氨酸相關性分別達到-0.90、-0.91、-0.76 呈極顯著負相關；鈣與粗灰分、賴氨酸相關性分別達到0.96、0.84 呈極顯著正相關；粗灰分與賴氨酸相關性達到0.87呈極顯著正相關。

圖5 酵母菌發酵冬凌草藥渣各產物的相關性Fig.5 Correlation of yeast fermentation products in residue of Rabdosia rubescens（Hemsl.）Hara

2.5.2 乳酸菌固體發酵冬凌草藥渣產物相關性分析 采用IBM SPSS Statistics 26.0 對乳酸菌發酵冬凌草藥渣不同檢測產物進行組內Pearson 相關性分析，結果如圖6所示，齊墩果酸與熊果酸相關性達到0.89，呈極顯著正相關；熊果酸與粗蛋白相關性達到0.53，呈顯著正相關；粗蛋白與鈣相關性達到0.46，呈顯著正相關，與賴氨酸相關性達到0.77，呈極顯著正相關；粗脂肪與鈣、粗灰分相關性分別達到0.56、0.57，呈極顯著正相關；鈣與粗灰分相關性達到0.46，呈顯著正相關，與賴氨酸相關性達到0.68，呈極顯著正相關。

圖6 乳酸菌發酵冬凌草藥渣各產物的相關性Fig.6 Correlation of lactic acid bacteria fermentation products in residue of Rabdosia rubescens（Hemsl.）Hara

2.6 酵母菌和乳酸菌固體發酵冬凌草藥渣產物主成分分析

2.6.1 酵母菌固體發酵冬凌草藥渣產物主成分分析 由表9 可知，8 個理化指標因子可形成3 個主成分，3 個主成分的累計方差貢獻率為82.624%，涵蓋了大于總體信息的80%，符合分析要求，可依次進行主成分分析，綜合評價冬凌草藥渣產物。將各指標變量的主成分載荷除以主成分相對應的特征值平方根得到標準化變量的系數向量，依此列出主成分解析表達式：

表9 酵母菌固體發酵冬凌草藥渣產物的載荷矩陣Tab.9 Load matrix of products of residue of Rabdosia rubescens（Hemsl.）Hara by solid fermentation of yeast

F3=0.616X1+0.489X2-0.214X3+0.190X4+0.142X5-0.185X6-0.182X7-0.460X8。

根據各指標成分在每個主成分中的提取貢獻度進行標準化處理，計算每個主成分的得分。根據主成分F1、F2、F3在累計值中的占比，計算各處理的總得分F，排序比較。

從表10 可以看出，酵母菌固體發酵各處理中，處理12 得分最高。處理12（接種量6%、料液比1∶1.2、發酵時間3 d、發酵溫度28 ℃）粗蛋白含量相較于發酵前提高0.93%，粗纖維含量相較于發酵前減少1.19%，粗脂肪含量相較于發酵前提高23.08%，鈣含量相較于發酵前提高13.89%，齊墩果酸含量相較于發酵前提高15.00%，熊果酸含量較發酵前提高16.22%。

表10 酵母菌固體發酵冬凌草藥渣各處理的評價分值Tab.10 Evaluation score of each treatment of residue of Rabdosia rubescens（Hemsl.）Hara by solid fermentation of yeast

2.6.2 乳酸菌固體發酵冬凌草藥渣產物主成分分析 由表11 可知，8 個理化指標因子可形成2 個主成分，2 個主成分的累計方差貢獻率為84.582%，涵蓋了大于總體信息的80%，符合分析要求，可依次進行主成分分析，綜合評價冬凌草藥渣產物。將各指標變量的主成分載荷除以主成分相對應的特征值平方根得到標準化變量的系數向量，依此列出主成分解析表達式：

表11 乳酸菌固體發酵冬凌草藥渣檢測產物的載荷矩陣Tab.11 Load matrix of products of residue of（Rabdosia rubescens（Hemsl.）Hara by solid fermentation of lactic acid bacteria

F1=0.115X1+0.033X2+0.456X3-0.425X4+0.121X5+0.447X6+0.454X7+0.420X8；

F2=0.643X1+0.650X2+0.015X3+0.089X4+0.422X5-0.100X6-0.082X7-0.083X8。

根據各指標成分在每個主成分中的提取貢獻度進行標準化處理，計算每個主成分的得分。根據主成分F1、F2在累計值中的占比，計算各處理的總得分F，排序比較。

從表12 可以看出，乳酸菌固體發酵各處理中，處理8得分最高。處理8（接種量6%、料液比1∶1.2、發酵時間6 d、發酵溫度28 ℃）粗蛋白含量較發酵前提高33.02%，粗纖維含量相較于發酵前減少24.76%，粗脂肪含量相較于發酵前提高23.08%，鈣含量相較于發酵前提高了74.07%，賴氨酸含量相較于發酵前提高21.21%。

表12 乳酸菌發酵冬凌草藥渣各處理的評價分值Tab.12 Evaluation score of each treatment of residue of Rabdosia rubescens（Hemsl.）Hara by solid fermentation of lactic acid bacteria

3 結論與討論

冬凌草藥渣為工業生產提取冬凌草甲素、冬凌草乙素后剩余的殘渣，目前工業生產提取方式較為單一，經提取后的藥渣中仍含有大量的有效成分。齊墩果酸和熊果酸作為冬凌草藥渣中的兩種重要藥用活性成分，是其發揮藥效的物質基礎[1]，可以幫助禽畜動物增強抵抗力，提高抗炎能力，預防腫瘤的形成[24]。粗蛋白、粗纖維、粗脂肪、鈣、粗灰分、賴氨酸等是評價飼料營養價值常用的指標[25]。冬凌草藥渣中的粗纖維可能是一種抗營養因子，因此，要降低其含量[26]。酵母菌作為酶、優質蛋白質、游離核苷酸、B族維生素和氨基酸的豐富來源，廣泛應用于飼料生產中，同時作為生長刺激劑取代抗生素，有效克服了使用抗生素所產生的耐藥性、藥物殘留等一系列問題，具有巨大的益生潛力[27]。乳酸菌具有抗菌、維持腸道菌群平衡、促進營養物質消化吸收、刺激或誘導機體免疫系統、提高動物免疫力等生理功能[28]。因此，本研究分別用酵母菌、乳酸菌作為單一發酵菌株，對冬凌草藥渣進行固體發酵，并優化發酵工藝，將藥渣中動物不能直接利用的纖維素降解，提高冬凌草藥渣中齊墩果酸和熊果酸等活性物質的含量。發酵后的冬凌草藥渣可用作一種具有高價值的飼料資源，不僅能緩解畜牧飼料資源緊張的問題，也能解決廢棄冬凌草藥渣對周圍環境造成污染的問題，為生產天然、安全的冬凌草微生態添加劑提供技術支撐。本研究通過單因素條件優化，對數據進行相關性和主成分分析，最終篩選出適合酵母菌固體發酵冬凌草藥渣的最優條件為接種量6%、料液比1∶1.2、發酵天數3 d、發酵溫度28 ℃，以此方法發酵冬凌草藥渣后齊墩果酸、熊果酸含量均較發酵前顯著提高，這可能是由于酵母菌可以有效提高合成齊墩果酸和熊果酸的前體α-香樹脂醇和β-香樹脂醇[29]，其確切機制還需要進一步研究。粗脂肪較發酵前顯著提高，這與王雪濤[30]和裴麗鵬[31]的研究結果相似，粗蛋白含量較發酵前提高，但沒有顯著性差異，粗纖維含量較發酵前減少，但沒有顯著性差異，關于延長酵母菌發酵時間和增加酵母菌接種量是否能繼續提高粗蛋白含量或減少粗纖維含量，有待進一步探討。適合乳酸菌固體發酵冬凌草藥渣的最優條件為接種量6%、料液比1∶1.2、發酵天數6 d、發酵溫度28 ℃，以此方法發酵冬凌草藥渣后齊墩果酸、熊果酸含量沒有顯著變化。甘奕[32]研究發現，乳酸菌發酵山楂液后游離氨基酸顯著增加，齊墩果酸含量顯著降低，本試驗與上述研究結果一致，這表明乳酸菌可能抑制了齊墩果酸和熊果酸的析出。但乳酸菌發酵后粗蛋白、粗脂肪、賴氨酸含量均較發酵前顯著提高，粗纖維含量較發酵前顯著降低，這與吳鵬濤等[33]的研究結果相似，表明乳酸菌可以有效降解冬凌草藥渣中的纖維素，并在一定程度上增加了粗蛋白、粗脂肪等活性成分的含量。本研究中，酵母菌和乳酸菌固體發酵后的冬凌草藥渣，其鈣、粗灰分含量均有所提高，這可能是發酵過程中冬凌草藥渣中的有機物被酵母菌和乳酸菌消耗，導致這些無機物含量的增加[34]，乳酸菌發酵后鈣含量的顯著增加可能是由于乳酸菌促進冬凌草藥渣中的大分子轉化為小分子，富集鈣離子[35]。綜上所述，冬凌草藥渣經酵母菌或乳酸菌發酵后，營養價值得到提高，可以添加到動物日糧中，提高動物的免疫力和生長性能。

本研究僅對冬凌草藥渣進行了酵母菌或乳酸菌單一菌種發酵，下一步可以考慮酵母菌和乳酸菌或其他菌種混合以不同比例發酵，進一步探究混合菌固體發酵對冬凌草藥渣的影響，解決乳酸菌發酵對冬凌草藥渣中齊墩果酸、熊果酸含量提升不明顯的問題，為冬凌草藥渣制備飼料添加劑的研究與開發提供技術支撐。