不同生長(zhǎng)期香菇培養(yǎng)料中木質(zhì)纖維素的變化特征

劉麗娜，李順?lè)澹S方方，崔國(guó)梅，高帥平，王安建，田廣瑞，魏書信

（河南省農(nóng)業(yè)科學(xué)院 農(nóng)產(chǎn)品加工研究中心，河南 鄭州 450002）

香菇（Lentinus edodes）隸屬真菌門擔(dān)子菌亞門層菌綱傘菌目側(cè)耳科，是我國(guó)人工栽培最廣泛的大宗食用菌種類[1]。香菇是一種典型的木腐菌，其栽培主要以富含木質(zhì)纖維素的農(nóng)林業(yè)生物質(zhì)資源為原料，生長(zhǎng)過(guò)程中可分泌系列降解酶破壞木質(zhì)纖維素的結(jié)構(gòu)，轉(zhuǎn)化成可吸收利用的小分子物質(zhì)[2-3]。這種營(yíng)養(yǎng)模式通過(guò)菌類生長(zhǎng)達(dá)到對(duì)木質(zhì)纖維類生物質(zhì)的高效、溫和處理，在生產(chǎn)美味菌菇的同時(shí)，還發(fā)揮著重要的生態(tài)作用。

木質(zhì)纖維素類生物質(zhì)結(jié)構(gòu)復(fù)雜，其降解利用對(duì)香菇的生長(zhǎng)發(fā)育至關(guān)重要[4-6]。因此，探索木質(zhì)纖維素的生物降解規(guī)律具有十分重要的作用，已成為食用菌生產(chǎn)的熱點(diǎn)研究領(lǐng)域之一。目前，僅有少量有關(guān)食用菌降解木質(zhì)纖維素的研究報(bào)道，且主要集中在菌株篩選[3，7]、酶學(xué)特性[8-9]、營(yíng)養(yǎng)成分變化[10]、降解機(jī)制[11-12]等方面，并沒(méi)有香菇栽培過(guò)程中木質(zhì)纖維素成分的變化特征的詳細(xì)報(bào)道。鑒于此，以不同生長(zhǎng)期的香菇栽培料為研究對(duì)象，對(duì)香菇栽培過(guò)程中木質(zhì)纖維素含量、纖維素結(jié)晶度、傅里葉紅外光譜和纖維形態(tài)進(jìn)行研究，旨在闡明香菇栽培過(guò)程中培養(yǎng)料木質(zhì)纖維素的變化特征，為更好地研究香菇對(duì)培養(yǎng)料木質(zhì)纖維素降解利用機(jī)制提供科學(xué)依據(jù)。

1 材料和方法

1.1 試驗(yàn)材料

供試香菇菌株森源19、木屑、麩皮、石灰、石膏由洛陽(yáng)雙惠菌業(yè)有限公司提供，培養(yǎng)料配方為木屑78%、麩皮20%、石灰1%、石膏1%，含水量55%。

1.2 試劑與儀器

乙二胺四乙酸鈉、四硼酸鈉、十六烷基三甲基溴化銨、十二烷基硫酸鈉、無(wú)水磷酸氫二鈉、乙二醇乙醚、冰醋酸、硫酸等均為分析純，購(gòu)自國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司。

儀器主要包括：FA2004C 分析天平（上海越平科學(xué)儀器有限公司）、YP30002 電子天平（上海佑科儀器儀表有限公司）、XB-20B 多功能粉碎機(jī)（上海兆申科技有限公司）、DF-101S 集熱式恒溫加熱磁力攪拌器（河南省予華儀器有限公司）、Advanced-I艾柯超純水機(jī)（臺(tái)灣艾柯成都康寧實(shí)驗(yàn)專用純水設(shè)備廠）、X-射線衍射儀（荷蘭Panalytical Empyrean 公司）、Nicolet is5 型傅里葉變換紅外光譜儀（賽默飛世爾科技公司）、OlmpusBX51 光學(xué)顯微鏡（日本OLYMPUS公司）。

1.3 試驗(yàn)方法

將培養(yǎng)料拌勻裝袋，塑料袋規(guī)格15 cm×55 cm×0.007 cm，袋裝料質(zhì)量（2.2±0.1）kg，裝好的料袋放入滅菌鍋中100 ℃常壓滅菌12 h，當(dāng)袋溫降至28 ℃以下時(shí)，按常規(guī)無(wú)菌操作進(jìn)行接種。按照河南省地方標(biāo)準(zhǔn)《春栽香菇代料栽培技術(shù)規(guī)程》[13]（DB41/T 2048—2020）進(jìn)行香菇的栽培管理。分別在香菇接種前原料（S0）、菌絲滿袋（S1）、菌袋轉(zhuǎn)色（S2）、收獲一茬菇（S3）、收獲二茬菇（S4）5 個(gè)時(shí)期進(jìn)行取樣。在每個(gè)生長(zhǎng)期各隨機(jī)選取6 個(gè)不同的栽培袋，將培養(yǎng)料揉碎混勻后作為該時(shí)期的代表樣品，凍干后粉碎，過(guò)0.30 mm篩用于測(cè)定。

1.4 測(cè)定方法

1.4.1 木質(zhì)纖維素含量的測(cè)定 木質(zhì)纖維素主要由纖維素、半纖維素和木質(zhì)素三部分組成。根據(jù)VAN SOEST 等[14-15]的方法測(cè)定纖維素、半纖維素和木質(zhì)素含量，其中纖維素和半纖維素含量之和為綜纖維素含量。

1.4.2 X-射線衍射分析 取少量干燥后的培養(yǎng)料粉末樣品進(jìn)行X-射線衍射分析[16]，以銅靶為測(cè)試靶材，掃描范圍為5～50°，掃描速度為5°/min，獲得X-射線衍射圖。采用Segal 法計(jì)算樣品纖維素結(jié)晶度（Cellulose crystallinity index，CrI），計(jì)算公式如下：

式中：CrI表示纖維素結(jié)晶度（%）；I002表示纖維素結(jié)晶區(qū)部分的衍射峰強(qiáng)度；Iam表示纖維素?zé)o定形區(qū)部分的衍射峰強(qiáng)度。

1.4.3 紅外光譜分析 采用李順?lè)宓萚17]的方法取培養(yǎng)料粉末樣品，壓片后用傅立葉變換紅外光譜儀（Fourier transform infrared spectroscopy，F(xiàn)TIR）掃描，所得結(jié)果用Omnic 8.0軟件進(jìn)行分析。

1.4.4 光學(xué)顯微成像分析 采用黃慧等[18]的方法使用未粉碎的香菇培養(yǎng)料對(duì)其纖維形態(tài)進(jìn)行測(cè)定。使用雙氧水和冰醋酸（體積比1∶1）混合液制作觀察玻片，利用光學(xué)顯微鏡和數(shù)碼顯微成像系統(tǒng)（Mshot digital imaging system V9.0）測(cè)量纖維各形態(tài)尺寸，在40 倍顯微鏡下測(cè)量纖維長(zhǎng)度，在100 倍顯微鏡下測(cè)量纖維寬度。

1.5 數(shù)據(jù)分析

采用SPSS 22.0 統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析，LSD方差分析法（P＜0.05）進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 不同生長(zhǎng)期香菇培養(yǎng)料的木質(zhì)纖維素含量

對(duì)木質(zhì)纖維素的生物降解作用，不同香菇菌株間存在著一定差異，香菇降解木質(zhì)纖維素（纖維素、半纖維素和木質(zhì)素）的能力比草腐菌強(qiáng)[19]。由表1可知，香菇培養(yǎng)料原料中木質(zhì)纖維素含量高達(dá)85.266%，木質(zhì)纖維素各組分含量在香菇不同生長(zhǎng)期之間均存在顯著差異。在香菇栽培過(guò)程中木質(zhì)纖維素各組分含量的變化趨勢(shì)大體類似，總體上呈現(xiàn)一直下降的趨勢(shì)。半纖維素與木質(zhì)素含量在菌絲生長(zhǎng)階段（S1）降解較慢，半纖維素在菌絲滿袋（S1）時(shí)，比原料（S0）略有增加，這可能是因?yàn)榘肜w維素、木質(zhì)素的降解速率小于因菌絲呼吸而引起的培養(yǎng)料失重速率。纖維素在菌絲生長(zhǎng)階段（S1）降解了12.92%，生殖生長(zhǎng)階段（S2、S3 和S4）降解了21.81%，說(shuō)明纖維素生殖生長(zhǎng)階段降解較多。半纖維素、木質(zhì)素、綜纖維素的降解具有明顯的階段性，前期菌絲生長(zhǎng)階段（S1）降解速度較慢，進(jìn)入轉(zhuǎn)色（S2）后降解速度加快。半纖維素、木質(zhì)素、綜纖維素及纖維素最快降解時(shí)期均在一茬菇（S3），該階段各指標(biāo)降解百分比達(dá)到最大值，分別為30.09%、31.00%、19.10% 和14.76%。二茬菇（S4）與原料（S0）相比，纖維素降解34.73%，半纖維素降解61.58%、木質(zhì)素降解57.15%、綜纖維素降解42.33%；纖維素、半纖維素、木質(zhì)素、綜纖維素含量此時(shí)均降到最低，但仍處于較高水平，說(shuō)明香菇對(duì)培養(yǎng)料的降解并不徹底，有必要進(jìn)一步增加出菇茬數(shù)以提高香菇對(duì)培養(yǎng)料的利用效率。此外，香菇對(duì)半纖維素、木質(zhì)素的降解率均在55%以上，顯著高于纖維素，具有一定的降解優(yōu)勢(shì)和選擇性，這可能與植物細(xì)胞壁的構(gòu)成有關(guān)[20]。

表1 不同生長(zhǎng)期香菇培養(yǎng)料的木質(zhì)纖維素含量Tab.1 Lignocellulosic content in Lentinus edodes culture material during different growth periods %

2.2 不同生長(zhǎng)期香菇培養(yǎng)料的纖維素結(jié)晶度

纖維素結(jié)晶度是指纖維素結(jié)晶區(qū)占纖維素整體（包括結(jié)晶區(qū)和無(wú)定形區(qū)）的百分率，結(jié)晶度高則纖維的彈性模量、抗拉強(qiáng)度及尺寸穩(wěn)定性也高[21]。采用X 射線衍射研究了不同生長(zhǎng)期香菇培養(yǎng)料纖維素的結(jié)晶特性（圖1和表2）。從圖1可以看出，原料S0在2θ為14.915°、22.740°、24.392°、38.184°處的衍射峰顯示出典型的木質(zhì)纖維素結(jié)晶圖譜；經(jīng)過(guò)香菇生長(zhǎng)后，14.915°及22.740°處的衍射峰強(qiáng)度明顯地持續(xù)降低，說(shuō)明香菇生長(zhǎng)對(duì)培養(yǎng)料的結(jié)晶度影響較大，其結(jié)晶區(qū)在一定程度上被破壞。其中，纖維素X 射線衍射典型特征002 晶面的結(jié)晶度如表2 所示，002 晶面衍射峰的位置介于22.287°～22.857°，香菇生長(zhǎng)后無(wú)明顯改變；菌絲滿袋（S1）、菌袋轉(zhuǎn)色（S2）、一茬菇（S3）、二茬菇（S4）的結(jié)晶度與原料（S0）相比，其結(jié)晶度分別降低22.39%、29.02%、46.91%、61.86%，呈現(xiàn)出原料S0 的纖維素結(jié)晶度持續(xù)不同程度地減少的變化趨勢(shì)，說(shuō)明香菇在生長(zhǎng)過(guò)程中一直存在對(duì)培養(yǎng)料中纖維素晶胞的持續(xù)降解作用，該結(jié)果與表1中纖維素含量的變化結(jié)果一致。此外，不同生長(zhǎng)期香菇培養(yǎng)料的衍射曲線均出現(xiàn)一些其余衍射峰，估計(jì)跟香菇生長(zhǎng)后生成了其他物質(zhì)如菌絲多糖等有關(guān)。

圖1 不同生長(zhǎng)期香菇培養(yǎng)料的X射線衍射Fig.1 X-ray diffraction of Lentinus edodes culture material during different growth periods

表2 不同生長(zhǎng)期香菇培養(yǎng)料的纖維素結(jié)晶度Tab.2 Cellulose crystallinity in Lentinus edodes culture material during different growth periods

2.3 不同生長(zhǎng)期香菇培養(yǎng)料的木質(zhì)纖維素紅外光譜

利用傅里葉紅外光譜分析儀對(duì)不同生長(zhǎng)期香菇培養(yǎng)料中纖維結(jié)構(gòu)和化學(xué)組分進(jìn)行表征，F(xiàn)TIR 圖譜結(jié)果見圖2。通過(guò)參照相關(guān)文獻(xiàn)[22-26]，確定該圖譜中特征峰及歸屬，分析結(jié)果見表3。圖2、表3結(jié)果表明，香菇不同生長(zhǎng)期培養(yǎng)料的傅里葉紅外光譜類似，主要吸收峰的位置未發(fā)生改變，在波數(shù)為1 800～800 cm-1范圍內(nèi)均可以觀察到木質(zhì)纖維素各組分的特征官能團(tuán)的振動(dòng)，說(shuō)明香菇不同生長(zhǎng)期培養(yǎng)料中均含有大量的木質(zhì)纖維素，但特征吸收峰在1 723、1 640、1 510、1 459、1 423、1 383、1 319、1 263、1 157、1 105、1 055、897 cm-1處的振動(dòng)強(qiáng)度總體呈現(xiàn)減弱趨勢(shì)，表明隨著香菇生長(zhǎng)進(jìn)程的推進(jìn)，培養(yǎng)料中木質(zhì)纖維素各組分被降解，對(duì)應(yīng)的紅外光譜吸收峰強(qiáng)度隨之改變。這與表1中香菇栽培過(guò)程對(duì)木質(zhì)纖維素的降解利用規(guī)律一致。本研究中，1 510 cm-1處苯環(huán)芳香骨架振動(dòng)是木質(zhì)素的特征吸收峰；1 723 cm-1處乙酰基和羧基C=O 伸縮振動(dòng)是半纖維素區(qū)別于其他組分的特異吸收峰；1 383、1 157 cm-1處是纖維素和半纖維素特定官能團(tuán)振動(dòng)引起；897 cm-1處C-H變形振動(dòng)是纖維素的特征吸收峰。

圖2 不同生長(zhǎng)期香菇培養(yǎng)料的FTIR圖譜Fig.2 FTIR spectra of Lentinus edodes culture material during different growth periods

表3 不同生長(zhǎng)期香菇培養(yǎng)料的紅外圖譜特征峰Tab.3 FTIR absorption peak location and assignment of Lentinus edodes culture material during different growth periods

纖維素、半纖維素與木質(zhì)素的特征峰相對(duì)強(qiáng)度值可用來(lái)判定木質(zhì)纖維素相對(duì)含量的高低[22]。為了進(jìn)一步明確香菇栽培過(guò)程中培養(yǎng)料木質(zhì)纖維素相對(duì)含量的變化，表4列出了纖維素、半纖維素與木質(zhì)素的特征峰相對(duì)強(qiáng)度值。由表4可知，I1723/I1510、I1383/I1510、I1157/I1510、I897/I1510 特征峰比值在香菇不同生長(zhǎng)期間存在顯著差異。總體來(lái)看，隨著香菇生長(zhǎng)進(jìn)程的推進(jìn)，I1723/I1510、I1383/I1510、I1157/I1510 呈現(xiàn)不斷減少的趨勢(shì)，這與纖維素、半纖維素含量的減少有關(guān)；而比值I897/I1510 在轉(zhuǎn)色（S2）和一茬菇（S3）呈增大趨勢(shì)，同時(shí)纖維素特征峰峰高卻呈降低趨勢(shì)，表明該生長(zhǎng)期香菇木質(zhì)素相比纖維素有著更快的降解速率。這一結(jié)果說(shuō)明香菇對(duì)木質(zhì)纖維素各組分的降解程度不同，與表1 中不同生長(zhǎng)期香菇培養(yǎng)料中木質(zhì)纖維素各組分的降解利用規(guī)律一致。

表4 不同生長(zhǎng)期香菇培養(yǎng)料的紅外圖譜特征峰相對(duì)強(qiáng)度Tab.4 Relative intensity of FTIR spectra characteristic peak in Lentinus edodes culture material during different growth periods

2.4 不同生長(zhǎng)期香菇培養(yǎng)料的纖維形態(tài)

形態(tài)特征（纖維長(zhǎng)度、纖維寬度等）與培養(yǎng)料中木屑的物理力學(xué)性能關(guān)系密切[27]，纖維寬度大，纖維間的接觸面積就大，木質(zhì)強(qiáng)度就高。香菇不同生長(zhǎng)期的纖維形態(tài)如表5 所示，隨著香菇生長(zhǎng)進(jìn)程的推進(jìn)，纖維長(zhǎng)度及寬度總體上呈現(xiàn)降低趨勢(shì)，二茬菇（S4）纖維長(zhǎng)度和纖維寬度最小，與其他生長(zhǎng)期存在顯著性差異；滿袋（S1）、轉(zhuǎn)色（S2）的纖維長(zhǎng)度與原料（S0）無(wú)顯著差異，滿袋（S1）、轉(zhuǎn)色（S2）、一茬菇（S3）的纖維寬度與原料（S0）無(wú)顯著差異。這表明香菇栽培過(guò)程中對(duì)纖維的降解利用是緩慢推進(jìn)的，栽培料中木質(zhì)的強(qiáng)度、力學(xué)性能隨著纖維的降解逐漸下降，最終逐漸失去其固有的形態(tài)支撐。

表5 不同生長(zhǎng)期香菇培養(yǎng)料的纖維形態(tài)特征Tab.5 Fiber morphological characteristics of Lentinus edodes culture material during different growth periods μm

為進(jìn)一步呈現(xiàn)纖維形態(tài)變化，將具有顯著差異的二茬菇（S4）與原料（S0）進(jìn)行光學(xué)顯微成像分析（×10），結(jié)果見圖3。經(jīng)顯微鏡觀察，原料（S0）的纖維壁及內(nèi)腔表面較為光滑平整，結(jié)構(gòu)致密規(guī)整，呈直線形狀態(tài)；二茬菇（S4）經(jīng)過(guò)香菇生長(zhǎng)后纖維壁及內(nèi)腔遭到破壞，出現(xiàn)較多孔洞、裂紋、粗糙、斷裂的現(xiàn)象，及少量膨松狀態(tài)片狀結(jié)構(gòu)。這進(jìn)一步表明了纖維的降解使得其結(jié)構(gòu)形態(tài)發(fā)生了變化，與前人[28-29]對(duì)秸稈類木質(zhì)纖維素降解研究的結(jié)果相一致。

圖3 2種培養(yǎng)料纖維的顯微形態(tài)Fig.3 Fiber microscopic morphology of two kinds of culture materials

3 結(jié)論與討論

香菇是典型的木腐菌代表，木質(zhì)纖維素是香菇生長(zhǎng)過(guò)程中大部分營(yíng)養(yǎng)的提供源，因此，本研究以不同生長(zhǎng)期香菇培養(yǎng)料中木質(zhì)纖維素的變化特征為切入點(diǎn)，闡明香菇利用基質(zhì)中木質(zhì)纖維素的生物降解規(guī)律。結(jié)果表明，香菇培養(yǎng)料中木質(zhì)纖維素的含量在不同生長(zhǎng)期之間存在顯著差異，總體上呈現(xiàn)一直下降的趨勢(shì)；纖維素在生殖生長(zhǎng)階段（S2、S3和S4）降解較多，半纖維素、木質(zhì)素、綜纖維素的降解具有明顯的階段性，進(jìn)入轉(zhuǎn)色階段（S2）后降解速度加快，潘迎捷等[30]、倪新江等[31]的研究中也有相似的結(jié)果。木質(zhì)素很難被直接降解利用，LEATHAM[32]的研究認(rèn)為，香菇分解木質(zhì)素的能力較低，其分解木質(zhì)素需要外源較易利用的碳源；本試驗(yàn)中木質(zhì)素在菌絲生長(zhǎng)階段降解速度較慢，也佐證了這一點(diǎn)，并與吳學(xué)謙等[33]香菇節(jié)木栽培基質(zhì)木質(zhì)素發(fā)菌階段的降解率較低這一結(jié)果相同。有研究報(bào)道[34]，纖維素和半纖維素降解最快的時(shí)期出現(xiàn)在出菇階段，而木質(zhì)素在降解過(guò)程中會(huì)被優(yōu)先利用，可能是由于木質(zhì)素包裹著纖維素同時(shí)與半纖維素具有共價(jià)關(guān)系的結(jié)構(gòu)特點(diǎn)。本試驗(yàn)中，木質(zhì)素在轉(zhuǎn)色階段（S2）降解百分比達(dá)到23.77%，之后纖維素、半纖維素、綜纖維素最快降解時(shí)期出現(xiàn)在一茬菇（S3），與前人報(bào)道[34]基本一致。二茬菇（S4）與原料（S0）相比，纖維素降解34.73%，半纖維素降解61.58%、木質(zhì)素降解57.15%、綜纖維素降解42.33%，說(shuō)明半纖維素、木質(zhì)素在香菇碳素利用中居主要地位，且木質(zhì)纖維素各組分降解程度高于前人[35]對(duì)相同培養(yǎng)料配方及茬數(shù)下的F 型菌株的研究報(bào)道，這估計(jì)是由不同香菇菌株的木質(zhì)纖維素降解酶體系存在一定差異引起的。

X-射線衍射、紅外光譜和纖維形態(tài)變化是木質(zhì)纖維素成分變化的良好反映，可以進(jìn)一步多角度地反映出木質(zhì)纖維素的結(jié)構(gòu)變化特征，香菇的栽培過(guò)程還缺乏這樣的研究。本研究結(jié)果顯示，不同生長(zhǎng)期的香菇培養(yǎng)料均具有典型的纖維素X 射線衍射典型特征及木質(zhì)纖維素的紅外光譜特征官能團(tuán)的振動(dòng)。隨著香菇生長(zhǎng)進(jìn)程的推進(jìn)，纖維素典型衍射峰的結(jié)晶度持續(xù)減少，說(shuō)明香菇在生長(zhǎng)過(guò)程中一直存在對(duì)培養(yǎng)料中纖維素晶胞的持續(xù)降解作用；紅外光譜主要吸收峰的位置未發(fā)生改變，木質(zhì)纖維素各組分的特征官能團(tuán)的振動(dòng)強(qiáng)度總體呈現(xiàn)減弱趨勢(shì)，與木質(zhì)纖維素各組分的降解利用規(guī)律一致；特征峰比值I1723/I1510、I1383/I1510、I1157/I1510 不斷減少，而I897/I1510 在轉(zhuǎn)色（S2）和一茬菇（S3）呈增大趨勢(shì)，同時(shí)纖維素特征峰峰高卻呈降低趨勢(shì)，表明該生長(zhǎng)期香菇木質(zhì)素相比纖維素有著更快的降解速率。纖維長(zhǎng)度及寬度總體上呈現(xiàn)降低趨勢(shì)，二茬菇（S4）纖維長(zhǎng)度及寬度最小，與其他生長(zhǎng)期存在顯著性差異。經(jīng)顯微鏡觀察，二茬菇（S4）時(shí)，經(jīng)過(guò)香菇生長(zhǎng)后，培養(yǎng)料纖維壁及內(nèi)腔遭到破壞，出現(xiàn)較多孔洞、裂紋、粗糙、斷裂的現(xiàn)象，及少量膨松狀態(tài)片狀結(jié)構(gòu)，明顯區(qū)別于原料（S0）的光滑平整、結(jié)構(gòu)致密規(guī)整，這進(jìn)一步表明了纖維的降解使得其結(jié)構(gòu)發(fā)生變化。經(jīng)過(guò)二茬菇生長(zhǎng)后香菇培養(yǎng)料中木質(zhì)纖維素仍處于較高水平，生物質(zhì)資源利用并不徹底，對(duì)其更高程度的轉(zhuǎn)化利用方式還有待于進(jìn)一步深入研究。

綜上，栽培過(guò)程中香菇對(duì)培養(yǎng)料木質(zhì)纖維素具有較強(qiáng)的持續(xù)的降解作用，可顯著降低木質(zhì)纖維素含量，破壞纖維素結(jié)晶區(qū)，使得紅外光譜吸收峰及纖維形態(tài)發(fā)生改變。