miR-26a通過HGF/c-Met通路調控乳腺癌血管生成及分子機制

楊曉玲,曾憲威,陳 塵,陳嘉俊,許業棟,唐麗艷

(深圳市寶安區松崗人民醫院檢驗科,廣東 深圳 518105)

乳腺癌屬于婦科較為常見的惡性腫瘤之一,其作為一種血管依賴性疾病,血管生成在乳腺癌發生、發展、侵襲以及轉移等過程中發揮著至關重要的作用[1]。盡管目前臨床上已有不少抗細胞增殖藥物可以促使腫瘤細胞凋亡,然而因受周圍血管支持,殘留的腫瘤細胞仍可獲得充足的血供,進一步持續生長、繁殖[2]。此外,異常腫瘤血管會導致藥物朝腫瘤組織內部的遞送明顯減少,進而導致抗細胞增殖的效果大打折扣。因此,尋求一種全新的腫瘤藥物治療方案顯得尤為重要,且目標不應單獨針對腫瘤細胞,而是要重視腫瘤微環境,特別是要注意腫瘤血管生成的作用[3]。隨著近年來有關研究的日益深入,不少學者發現微小RNA(miRNAs)可通過調控相關靶基因表達,從而在多種細胞行為中發揮著關鍵性作用[4]。miR-26a屬于miRNAs家族重要成員之一,其在多種惡性腫瘤中均存在異常表達,介導腫瘤發生、發展過程[5]。然而,miR-26a抑制乳腺癌血管生成的具體分子機制不清楚。本研究率先提出“miR-26a通過負調HGF/c-Met信號通路,抑制VEGF,從而抑制乳腺癌血管生成”的假說和原創性理論,相關研究未見文獻報道。本文通過研究miR-26a通過肝細胞生長因子(HGF)/細胞間質上皮轉化(c-Met)通路調控乳腺癌血管生成及分子機制,以期為臨床乳腺癌的治療提供新的靶點與方向。

1 資料與方法

1.1一般資料:選取2021年1月～2022年3月深圳市寶安區松崗人民醫院收治的40例乳腺癌患者。年齡33～79歲,平均(57.72±4.67)歲;體重指數(BMI)18～32 kg/m2,平均(23.55±1.78)kg/m2;臨床分期:Ⅰ～Ⅱ期18例,Ⅲ～Ⅳ期22例;分化程度:低分化15例,中分化17例,高分化8例;淋巴結轉移18例。入組標準:①所有入選對象均經手術病理檢查確診為乳腺癌;②入組前尚未接受任何抗腫瘤治療;③均為成年女性;④臨床資料完整。排除標準:①合并其他惡性腫瘤;②神志異常;③正處于其他研究過程中。入組人員均已簽署知情同意書,經醫院倫理委員會批準。

1.2研究方法:①人乳腺癌細胞株MDA-MB-231購自美國典型培養物保藏中心。將細胞株接種到含有10%胎牛血清以及100 U/ml青霉素-鏈霉素雙抗 RPMI 1640培養基內。隨后將其放置在37℃、5%二氧化碳濃度的細胞培養箱中培養。以0.25%胰蛋白酶溶液消化傳代處理,2～3 d傳代1次。②采集所有受試者的乳腺癌組織以及癌旁正常組織,將前者作為觀察組,后者作為對照組。③細胞轉染:通過LipofectamineTM2000脂質體法將miR-26a模擬物以及抑制物分別轉染至乳腺癌細胞中,記作miR-26a轉染組、miR-26a抑制組,并將未進行任何處理的乳腺癌細胞作為陰性對照組。④實時熒光定量PCR:以Trizol法提取細胞總RNA,以凝膠電泳法檢測RNA相對分子質量,借助分光光度計完成RNA濃度的檢測。借助mirpremier miRNA分離試劑盒完成miRNA的分離,并遵循Super Script逆轉錄試劑盒說明書進行cDNA的合成。之后按照PCR試劑盒說明書完成熒光定量PCR檢測。之后按照美國國立生物技術信息中心(NCBI)數據庫有關資料完成PCR引物的設計。嚴格遵循熒光定量PCR儀說明書進行基線的調整,設定閾值處于熒光值對數圖線性部分,并從軟件中進行Ct值讀取。以β-actin為內參,根據2-ΔΔCt法完成目標基因mRNA的相對表達量計算。檢測涵蓋下述幾項:①miR-26a;②血管內皮生長因子A(VEGFA);③HGF;④p-c-Met/c-MET;⑤下游靶基因磷脂酰肌醇激酶3(PI3K);⑥蛋白酶B(AKT);⑦雷帕霉素靶蛋白(mTOR)。

1.3觀察指標:比較不同乳腺組織miR-26a、VEGFA以及微血管密度(MVD)表達,各組乳腺癌細胞中HGF/c-Met通路相關蛋白表達以及PI3K/AKT/mTOR表達水平。

1.4統計學方法:以SPSS21.0軟件進行χ2及t檢驗。

2 結果

2.1不同乳腺組織miR-26a、VEGFA以及MVD表達比較:乳腺癌組織中miR-26a相對表達量為0.47±0.08,相較于癌旁正常組織的1.02±0.17更低,而VEGFA相對表達量與MVD分別為1.04±0.25、14.68±2.91,相較于癌旁正常組織的0.68±0.11、7.85±1.05更高,差異均有統計學意義(t=18.514、8.336、14.009,P<0.05)。

2.2各組乳腺癌細胞中HGF/c-Met通路相關蛋白表達比較:miR-26a抑制組HGF、p-c-Met/c-MET表達水平分別0.92±0.12、0.67±0.06,相較于陰性對照組的0.62±0.08、0.37±0.04以及miR-26a轉染組的0.30±0.04、0.18±0.02均更高,而miR-26a轉染組HGF、p-c-Met/c-MET表達水平相較于陰性對照組更低,差異有統計學意義(F=10.478、15.691,P<0.05)。

2.3各組乳腺癌細胞中PI3K、AKT、mTOR mRNA表達比較:miR-26a抑制組PI3K、AKT、mTOR mRNA相對表達量相較于陰性對照組及miR-26a轉染組更高,而miR-26a轉染組PI3K、AKT、mTOR mRNA相對表達量相較于陰性對照組更低,差異有統計學意義(P<0.05)。見表1。

表1 各組乳腺癌細胞中PI3K、AKT、mTOR mRNA表達比較

3 討論

迄今為止,關于乳腺癌的具體發病機制尚存在一定的爭議,目前普遍認為可能與遺傳、生活方式等密切相關[6]。由于該病發病早期具有極強的隱匿性,從而導致絕大部分患者首次確診便喪失了手術根治的最佳時機,從而導致預后不良[7-8]。因此,尋找一種可早期診斷以及靶向基因治療新靶點具有極其重要的意義。研究者通過前期研究發現:miR-26a在乳腺癌組織中表達降低,且VEGF與腫瘤血管生成關系密切,而miR-26a可能參與乳腺癌血管生長的調控。此外,miR-26a可能通過負調HGF/c-Met信號通路,抑制VEGF,從而抑制乳腺癌血管生成[9-10]。

本研究提示了miR-26a在乳腺癌中存在異常高表達,而VEGFA異常低表達,且MVD較低。分析原因,miR-26a可能通過靶向多種癌基因介導調控細胞周期、增殖、凋亡以及侵襲等多種細胞功能,進一步抑制腫瘤的發生、發展過程。VEGFA參與了血管生成以及內皮細胞生長等過程,促進了內皮細胞的增殖,誘導腫瘤血管形成,為乳腺癌的發生、發展提供了重要基礎。腫瘤細胞的生長依靠從周圍細胞間質中汲取的營養物質,在病灶直徑超過一定界限后,其中心部分細胞生長以及增殖所需的營養物質則由血管提供,否則會出現缺氧以及壞死,因此,腫瘤組織中往往存在較高的MVD[11-12]。本研究反映了miR-26a對乳腺癌細胞中HGF/c-Met通路具有一定的負向調控作用。其中HGF主要是由間質細胞分泌而來的一種多功能生長因子,其主要成分包括兩個亞基,其本質為含有728個氨基酸的肝素結合糖蛋白。c-Met主要是由原癌基因Mte所編碼的一種蛋白,而HGF為其唯一天然配體,屬于受體酪氨酸激酶家族重要成員之一[13-14]。兩者特異性結合會促進酪氨酸激酶活性的增強,進而發揮誘導上皮-間充質轉化以及血管生成的作用,在腫瘤細胞的增殖、遷移以及侵襲等過程中扮演著至關重要的作用。由此推測,miR-26a作為乳腺癌的抑癌基因,其發揮抑癌的作用機制可能與調控HGF/c-Met通路有關。另外,miR-26a抑制組PI3K、AKT、mTOR mRNA相對表達量相較于陰性對照組以及miR-26a轉染組更高,而miR-26a轉染組PI3K、AKT、mTOR mRNA相對表達量相較于陰性對照組更低。證實了miR-26a可能對乳腺癌細胞PI3K/AKT/mTOR信號通路亦有負向調控作用。PI3K/AKT/mTOR信號通路在抑制細胞增殖以及促進細胞凋亡中發揮著至關重要的作用,當該信號通路異常激活,會引起相關下游信號分子出現異常活化,進而刺激腫瘤細胞的增殖、分化、侵襲以及轉移。目前,國內外已有不少研究報道證實,PI3K/AKT/mTOR信號通路在乳腺癌的發生、發展過程中扮演著重要角色[15-16]。由此可見,miR-26a的抑癌機制可能通過調控PI3K/AKT/mTOR信號通路實現,但關于其具體作用機制尚未闡明,有待進一步研究證實,為今后的研究提供了方向。

綜上,miR-26a可能通過調控HGF/c-Met通路以及PI3K/AKT/mTOR信號通路,進一步發揮抑癌基因的作用。