玉屏風顆粒治療大鼠變應性鼻炎的血清氨基酸代謝組學研究*

李小曼, 曹 婕 ,吳飛虎

(安徽中醫藥大學第一附屬醫院耳鼻咽喉科,安徽 合肥 230031)

變應性鼻炎(allergic rhinitis,AR)是特應性的個體對某些過敏原如塵螨、霉菌、動物皮屑等過敏,在自身免疫系統作用下發生的以陣發性噴嚏、清水樣鼻涕、鼻癢、鼻塞為主要癥狀的鼻黏膜非感染性慢性炎性疾病[1],患病率為10.58%[2],癥狀的反復發作導致患者生活質量下降,易出現焦慮狀態。玉屏風顆粒是以治療AR的經典方劑玉屏風散為基礎制備而成的中藥制劑。相關研究證實玉屏風散能夠降低小鼠的免疫球蛋白E(immunoglobulin E,IgE)水平,改善小鼠體液免疫功能[3],提高臨床近遠期的療效[4]。玉屏風顆粒結合西藥較單純西藥治療AR能緩解癥狀,總有效性高,復發率低,不良反應少[5]。代謝組學揭示機體內小分子化合物的分布及變化規律,其研究的整體性和動態性與中醫“整體觀念”思想相契合,為從微觀角度闡述中醫藥復雜作用機制提供了全新的理論視角[6]。氨基酸是構成生命的基礎物質,可控制T淋巴細胞的生長和活化從而產生控制促炎信息傳遞和抗氧化應激作用[7]。AR病程中體內營養物質的合成與能量代謝的異常可能是其反復發作的原因。基于此提出“玉屏風顆粒可以通過調節機體血清氨基酸水平達到治療變應性鼻炎”這一假說,并進行驗證。

1 材料與方法

1.1 動 物

無特定病原體級雄性Sprague Dawley大鼠40只,7周齡,體質量170～230 g,購自鄭州市惠濟區華興實驗動物公司,實驗動物生產許可證號為SCXK(豫)2019-0002,實驗動物使用許可證號為SCXK(豫)2023-0011。實驗室級別為1級生物安全實驗室。大鼠自由進食飲水,自然晝夜光線照明,室內溫度24～26 ℃,空氣濕度53%～63%。

1.2 藥品、試劑和主要儀器

玉屏風顆粒,國藥集團產品廣東環球制藥有限公司產品,產品批號Z10930036;枸地氯雷他定片,南京海辰藥業股份公司產品,產品批號H20090104。氫氧化鋁凝膠(批號21645-51-2)和卵清蛋白(批號9006-59-1),美國西格瑪公司產品。ACQUITY UPLC?BEH C18色譜柱(2.1 mm×100 mm,1.7 μm),美國沃特世公司產品。

1.3 動物分組、造模和給藥方法

大鼠適應性飼養3 d后,隨機分為正常對照組、模型組、玉屏風顆粒組和枸地氯雷他定組,每組10只。參考文獻[8]并調整制備大鼠AR模型[7]的方法,造模過程包括基礎致敏、局部激發兩個階段。以卵清蛋白0.3 mg作抗原、30 mg氫氧化鋁作輔助劑,加入1 mL生理鹽水制成懸浮液。基礎致敏階段:對模型組、玉屏風顆粒組、枸地氯雷他定組大鼠腹腔注射1 mL混懸液,隔日1次,共7次。間歇10 d,進入局部激發階段:以質量分數10 g/L的卵清蛋白溶液 100 μL滴鼻激發,1次/d,連續7 d。正常對照組用相同量生理鹽水替代進行腹腔注射和滴鼻。在第一次滴鼻激發后觀察15 min內大鼠鼻部癥狀并記錄評分。從第1次卵清蛋白滴鼻當日起,滴鼻后開始灌胃給藥,共給藥7 d。根據人與動物之間按體表面積計算的等效劑量比確定給藥劑量,玉屏風顆粒的等效劑量為37.8 g/(kg·d),枸地氯雷他定的等效劑量為2.60 mg/(kg·d)。玉屏風顆粒組:每天灌胃給藥2次,間隔時間約10 h,每次0.3 mL。枸地氯雷他定組:大鼠每天早晨一次性給予枸地氯雷他定0.3 mL,下午給予等體積純水。正常對照組、模型組:大鼠每天灌胃等體積純水2次。

1.4 樣本預處理

在卵清蛋白最后一次滴鼻激發24 h內,用氯胺酮0.2 mL肌內注射麻醉大鼠,固定,腹主動脈插管采血5 mL。按照參考文獻[9]方法:將樣本放置于離心管中,加體積分數100 mL/L的甲酸甲醇溶液水400 μL,漩渦震蕩 30 s;取20 μL上清液,將180 μL甲酸甲醇溶液水稀釋至100 μL,放置漩渦震蕩30 s;取上清液100 μL,加入內標100 μL,輕輕混勻,再加入剩余的標準品溶液1 μL。充分混勻后,漩渦震蕩30s;將上清液過0.22 μm濾膜,將過濾液加入檢測瓶中。

1.5 色譜-質譜儀條件

按照參考文獻[10]方法。采用ACQUITY UPLC?BEH C18色譜柱,進樣量5 μL,柱溫40 ℃,流動相A(500 mL/L甲醇水)、B(100 mL/L甲醇水)。梯度洗脫: 0—6.5 min,90%～70% B;6.5—7 min,70%～0% B;7—14 min,0% B;14—14.5 min,0%～90% B;14.5—17.5 min,90% B。流速:0—8.0 min,0.3 mL/min;8.0—17.5 min,0.4 mL/min。本實驗采用電噴霧離子化,正離子型。在500 ℃下,選擇5 500 V離子源、6 psi撞擊氣體、30 psi氣體、50 psi噴霧氣體、0 psi輔助氣體。

1.6 統計學分析

采用SIMCA-P軟件進行了主成分分析(principal component analysis,PCA)及正交偏最小二乘法判別分析(orthogonal partial least-squares discrimination analysis,OPLS-DA)檢驗。使用Metabo Analyst平臺進行對數轉換。當資料符合正態及變異系數的齊合性后,再加單因素方差分析。依據倍數變化>1.5、Tukey′s HSD檢驗P<0.05及FDR值等條件尋找有顯著差異的代謝產物。

2 結 果

2.1 代謝譜分析

采用氣相色譜-質譜聯用技術對大鼠血清中的代謝物進行分析。首先,利用非監督的PCA方法對4組血液中的氨基酸含量進行檢測,結果見圖1。結果表明,代謝譜很難將4組氨基酸含量完全區別出來。

圖1 4組血樣 PCA得分圖

圖2 4組血樣 OPLS-DA 得分圖

采用OPLS-DA法分析,并通過與經典的多元統計分析方法比較來評價不同樣品的差異。結果顯示:4組代謝譜在不同時間點分離良好,且樣品之間具有一定的離散性;相較于模型組和枸地氯雷他定組,玉屏風顆粒組更接近正常組。本研究所建立的模型解釋率與預測準確率均較高(R2Y=0.827,Q2Y=0.536)。隨后,筆者對該模型進行200次排序實驗,以驗證該模型是否存在過度擬合。結果得到R2值為0.63,Q2值為-0.64。Q2值為負值表明該模型具有較強的穩健性,沒有過擬合現象。置換測試見圖3。

圖3 置換測試圖

2.2 具有統計學意義的差異代謝物

進一步尋求與AR病理密切相關的差異代謝物。將OPLS模型的權重變量重要性投影(variable-importance in projection,VIP)設置為>1,正常對照組與模型組對比測得的差異代謝物有8種,分別是甘氨酸、丙氨酸、纈氨酸、蘇氨酸、亮氨酸、谷氨酰胺、賴氨酸、谷氨酸。做受試者操作特征曲線(receiver operating characteristic curve,ROC),曲線下的面積(area under curve,AUC)均>0.5,見表1。結果表明,上述氨基酸可用作AR相關發病機制的差異代謝物。為進一步尋找玉屏風顆粒改善AR的差異代謝物,玉屏風組與模型組對比測得的差異代謝物有6種,分別為甘氨酸、丙氨酸、絲氨酸、谷氨酰胺、賴氨酸、精氨酸。做ROC曲線,曲線下的面積均大于0.5,探索其作為生物標志物的診斷效能,結果見表2。

表1 8種氨基酸曲線下的面積分析結果

表2 6種氨基酸曲線下的面積分析結果

2.3 代謝通路分析

以Metabo Analyst行相關的通路分析,進一步明確AR的發病機制和玉屏風顆粒治療AR差異代謝物的相關通路。根據通路影響值(impact factor>0.15) 得到以下6條與AR發病機制相關的通路:①D-谷氨酰胺和D-谷氨酸代謝;②丙氨酸、天冬氨酸和谷氨酸代謝;③纈氨酸、亮氨酸和異亮氨酸生物合成;④甘氨酸、絲氨酸和蘇氨酸代謝;⑤谷胱甘肽代謝;⑥精氨酸生物合成。見圖4。同理得到以下3條與玉屏風顆粒治療AR機制相關的通路:①精氨酸生物合成;②丙氨酸、天冬氨酸和谷氨酸代謝;③D-谷氨酰胺和D-谷氨酸代謝。見圖5。

a. D-谷氨酰胺和D-谷氨酸代謝;b.丙氨酸、天冬氨酸和谷氨酸代謝;c.纈氨酸、亮氨酸和異亮氨酸生物合成;d.甘氨酸、絲氨酸和蘇氨酸代謝;e.谷胱甘肽代謝;f.精氨酸生物合成

a.精氨酸生物合成;b.丙氨酸、天冬氨酸和谷氨酸代謝;c.D-谷氨酰胺和D-谷氨酸代謝

3 討 論

前期多項研究表明,應用代謝組學技術分析AR患者或動物模型血清,所測的血清氨基酸含量較治療前有明顯改變,多種氨基酸代謝途徑(包括酪氨酸、丙氨酸、谷氨酸、天冬氨酸、賴氨酸、組氨酸代謝等)發生紊亂[11-15]。AR是由IgE介導的鼻黏膜非感染性慢性炎性疾病,患病率高,癥狀易反復,病程長,嚴重者可誘發哮喘等并發癥。其發病機制較復雜,目前尚未十分明確,多認為是由過敏原誘發,出現體內輔助性T細胞(helper T cell,Th)1/Th2免疫細胞平衡紊亂,合成特異性IgE,再次接觸過敏原,使肥大細胞和嗜堿粒細胞釋放組胺等炎性介質,同時分泌趨化因子、細胞因子等,致使相關癥狀持續和加重。與AR發病機制中組胺釋放增多相對應的是其病理過程中組胺受體活化、蛋白激酶激活及炎癥因子的釋放等環節,因此,在AR的藥物治療中,抗組胺藥物是一線治療藥物。本研究所選枸地氯雷他定是第3代長效抗組胺藥,有更強的抗組胺作用,起效迅速,半衰期長,沒有第2代抗組胺藥嗜睡和心臟毒性等不良反應[16]。

《諸病源候論》曰:“肺氣通于鼻,其臟有冷,冷隨氣入乘于鼻,故使津涕不能自收。”肺合皮毛,若患者為肺氣虛寒的體質則易衛表不固、腠理疏松,遇風寒邪氣,則內外合邪而易被風寒所犯,致肺氣宣降功能失調;肺開竅于鼻,氣機不暢則鼻竅不通,風寒侵襲,氣失固攝,則津液不能自收。此證型為臨床常見的肺氣虛寒證。玉屏風顆粒是以臨床常用治療AR的經典方劑玉屏風散為基礎制備的中藥制劑。玉屏風散出自《丹溪心法》,由黃芪、白術和防風組成。方中黃芪補脾肺之氣兼固表,白術健脾益氣以固里,防風走肌表散風寒以祛外,全方表里同治。現代藥理學研究證實,玉屏風顆粒具有抗菌、抗病毒和雙向調節免疫功能作用,能提高巨噬細胞吞噬功能,增強體內免疫球蛋白A水平[17]。相關臨床研究[5]表明,玉屏風顆粒聯合西藥治療變應性鼻炎相較西藥對照組lgE、白細胞介素(interleukin,IL)-6及IL-10水平差異有統計學意義(P<0.05),可明顯改善機體免疫功能,提高療效,且不良反應發生率較低。動物實驗[18]表明,玉屏風顆粒可降低變應性鼻炎大鼠血清IL-17水平和提高重組小鼠轉換生長因子β1水平,從而推測其可通過調節Th17與調節性T細胞免疫失衡來達到治療效果。有學者通過研究核因子κB(nuclear factor kappa-B,NF-κB)信號通路中相關蛋白及IL-4、IL-6的含量發現,玉屏風顆粒可通過調控NF-κB信號通路、抑制Th2細胞過度分泌IL-4和IL-6而調節Th1和Th2平衡[19]。上述實驗表明玉屏風顆粒可有效改善免疫功能,同時也探究了玉屏風顆粒治療AR的可能機制。

當前對具體的免疫調節機制研究還不夠深入,而利用代謝組學技術完善中醫藥方劑治療疾病的機制研究有著廣闊的前景。代謝組學可更整體性和動態性觀察比較方藥整體效應,從更微觀的小分子代謝物角度分析相關機制是研究中成藥的新的切入點。差異代謝物能夠反映機體的代謝信息,并能發現其在代謝途徑中的異常。前期一項基于液質聯用技術的組學研究[13]發現,消風宣竅方可通過調節組氨酸、半胱氨酸、甲硫氨酸等代謝途徑發揮抗過敏作用。茍小軍等[14]利用GC-MS技術對 AR患者血清中代謝產物進行了分析,研究表明有9個氨基酸代謝物與AR的發生有顯著關聯。這一研究結果為深入探討 AR的發病機制提供了重要的參考,為進一步研究奠定了基礎。

本研究利用代謝組學方法研究與AR相關的22種氨基酸水平的變化。結果表明,與正常對照組對比,模型組中甘氨酸、丙氨酸、纈氨酸、蘇氨酸、亮氨酸、谷氨酰胺、賴氨酸、谷氨酸血清水平明顯改變。這些氨基酸與炎癥、免疫反應存在關聯,與AR發病機制緊密聯系[20]。

谷氨酰胺與谷氨酸之間可相互轉化。谷氨酸進入三羧酸循環來提供能量[21]。谷氨酰胺是機體多種代謝過程中的重要底物,其能量主要來源于三羧酸循環。此外,它的代謝產物還可通過多種信號傳導、轉錄等途徑調控細胞的免疫應答,如γ-氨基丁酸可促進巨噬細胞、淋巴細胞的增殖、分化和細胞因子分泌。

丙氨酸可有效參與人體內丙氨酸-葡萄糖的代謝循環,其可在脫氨酶下生成丙酮酸而轉化成葡萄糖儲存能量,故人體內葡萄糖的含量可隨丙氨酸水平升高而上升,從而使得機體能量提升[22]。天冬氨酸與天冬酰胺在相關酶及腺苷三磷酸的作用下可相互轉化,故其對細胞的供能和脫氧核糖核酸的合成較為關鍵。

支鏈氨基酸包括纈氨酸、亮氨酸和異亮氨酸,在支鏈氨基酸轉移酶的催化作用下形成相應支鏈酮酸,在氧化脫羧反應下形成了支鏈酰輔酶A酯[23],再經脫氫加水作用,形成β-羥酰基輔酶A,隨即進入三羧酸循環等代謝途徑,發揮著如調節促炎細胞因子和抗炎細胞因子之間的平衡性,緩解氧化應激,提高機體免疫力等[24]。甘氨酸還能通過調控抗炎因子,降低氧自由基產生,進而起到控制炎性細胞活性,產生調控免疫、耐炎的效果,并在抗氧化過程中起到一定效果。蘇氨酸是必需氨基酸,也是一種免疫刺激劑,對于胸腺的生長和抗體的合成有一定刺激作用,可促進細胞免疫。絲氨酸可促進免疫球蛋白及抗體形成,并能引導骨髓的T淋巴細胞成熟發育[25]。

谷胱甘肽是含巰基的低分子肽,可參與脫氧核糖核酸 、核糖核酸和蛋白質的合成;其抗氧化的作用較為突出,因為機體內的小成分物質被氧化后會引起相關的細胞功能障礙,故谷胱甘肽維護細胞內的蛋白質等成分不被輕易氧化的作用顯得較為重要[26]。精氨酸作為條件必需氨基酸是人體內合成蛋白質重要參與者,是人體內主要的供氮體,參與體內一氧化氮及一氧化氮合成酶途徑,可將一氧化氮維持在較低劑量以增加組織血供,抑制炎癥反應,促進蛋白質合成;還參與精氨酸酶-鳥氨酸途徑,可被分解成鳥氨酸;此外,精氨酸的缺乏會阻斷T細胞的增殖[27]。

本實驗結果顯示,在玉屏風顆粒治療干預下AR大鼠的血清氨基酸較模型組表現出正常回歸的態勢,玉屏風顆粒可有效調整機體內紊亂的氨基酸代謝,從實驗數據方面進一步明確了玉屏風顆粒在AR中的治療作用。甘氨酸、丙氨酸、絲氨酸、谷氨酰胺、賴氨酸、精氨酸等6種物質可能為玉屏風顆粒治療AR作用機制的標志物,可進一步分析研究。本次研究僅針對AR大鼠血清的變化,臨床病例未予以收集,下一步可擴大樣本量,以期從臨床患者等多方位進行深入研究。