正交試驗法優(yōu)選黃萸斛顆粒的提取工藝研究*

沈啟良,陳 帥

(河南中醫(yī)藥大學第一附屬醫(yī)院,河南 鄭州 450000)

亞健康狀態(tài)是機體陰陽氣血發(fā)生了輕度的偏盛或偏衰、進一步發(fā)展有可能趨向疾病的狀態(tài)。中醫(yī)學認為陰陽調(diào)和、氣血充足則百病自愈。因此,如果機體在亞健康狀態(tài)時就及時采取措施阻斷病邪侵入、轉(zhuǎn)化途徑,恢復(fù)陰陽平衡,就可達到“陰平陽秘”的健康狀態(tài),即“治未病”。黃萸斛顆粒由酒黃精、酒萸肉、鐵皮石斛3種中藥飲片組合成方。研究表明,石斛多糖具有調(diào)節(jié)機體免疫力、抑制血栓形成、降血糖、抗氧化作用[1-2];黃精多糖具有提高心肌細胞環(huán)腺苷酸的水平、改善腦功能、防治動脈血管粥樣硬化的作用[3];酒萸肉中環(huán)烯醚萜苷類馬錢苷具有抑制血栓、抑制神經(jīng)退行性病變等作用[4],此外,酒萸肉還可抑菌,抗流感病毒,降血糖,利尿[5],增強非特異性免疫功能,抗氧化[6]。因此,黃萸斛顆粒具有健脾潤肺、益胃生津、補益肝腎的作用,用于機體虛弱者,尤其是陰虛者。本研究以酒黃精、酒萸肉和鐵皮石斛中總多糖、馬錢苷含量為評價指標,設(shè)計正交試驗優(yōu)選黃萸斛顆粒最佳提取工藝,以提高原料利用率。

1 藥品、試劑與儀器

酒黃精(產(chǎn)地湖南,批號2010133)、鐵皮石斛(產(chǎn)地云南,批號2101191)和酒萸肉(產(chǎn)地河南,批號2012053),均為安徽普仁中藥飲片有限公司產(chǎn)品。鐵皮石斛經(jīng)粉碎機粉碎,過篩,備用。無水乙醇,分析純,500 mL/瓶,天津市富宇精細化工試劑有限公司產(chǎn)品,批號20220309;蒽酮,分析純,25 g/瓶,上海藍季科技發(fā)展有限公司產(chǎn)品,批號220311;濃硫酸,分析純,500 mL/瓶,洛陽市化學試劑廠產(chǎn)品,批號230615。無水葡萄糖對照品(100 mg/支,批號202109)和馬錢苷對照品(20 mg/支,批號201808),均為中國食品藥品檢定研究院產(chǎn)品。色譜乙腈(4 L/瓶,批號G6002GG)和色譜甲醇(4 L/瓶,批號G6001GG),均為貢登科技有限公司產(chǎn)品;磷酸,50 mL/瓶,迪馬科技有限公司產(chǎn)品,批號197432;實驗用水為雙蒸水。ZC100D超聲清洗機,上海杜斯儀器有限公司產(chǎn)品;MH-2000電調(diào)溫型電熱套, 陜西眾佳科學儀器有限公司產(chǎn)品;BSA224S-CW電子分析天平,德國賽多利斯公司產(chǎn)品;Evolution201紫外分光光度計和UltiMate 3000高效液相色譜儀,均為美國賽默飛世爾公司產(chǎn)品。

A.對照品;B.供試品溶液;C.陰性對照溶液

2 方法和結(jié)果

2.1 正交試驗設(shè)計

以馬錢苷含量、總多糖含量為評價指標,采用L9(34)正交表進行正交設(shè)計,對煎煮時間、煎煮次數(shù)、加水量進行考察,確定最佳工藝參數(shù)[7]。利用加熱回流的方式煎煮提取,設(shè)定加熱套溫度為100 ℃,因素水平設(shè)計見表1。

表1 水煎因素水平表

按處方配比稱取酒黃精、酒萸肉共9份,按相應(yīng)的因素水平加水煎煮,水煎液過濾,減壓濃縮,備用。

2.2 馬錢苷的含量測定

根據(jù)《中國藥典》2020版一部山茱萸飲片下有關(guān)含量測定方法[8],利用高效液相色譜(high performance liquid chromatography,HPLC)法對馬錢苷進行含量測定。

2.2.1 色譜條件

色譜柱-安捷倫ZORBAXSB C18柱(4.6 mm×250 mm,5 μm),流動相為乙腈-1 mL/L磷酸溶液(7∶93)。 檢測波長240 nm,流速1 mL/min,進樣量為10 μL,柱溫35 ℃。

2.2.2 溶液的制備

對照品溶液制備:精密量取適量對照品馬錢苷,放入25 mL容量瓶中,加入800 mL/L甲醇,使1 mL溶液含0.05 mg,作為對照品溶液。

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供試品溶液制備:精密稱取各正交試驗樣品濾液,放入25 mL量瓶中,用800 mL/L甲醇稀釋并定容至刻度線處,搖勻,然后用0.45 μm微孔濾膜濾過,取續(xù)濾液,即得。

陰性對照品溶液制備:按照處方比例制成沒有山茱萸的陰性藥品,按供試品溶液制備方法制備陰性對照品溶液。

2.2.3 測定法

分別精密吸取對照品溶液、供試品溶液、陰性對照溶液各10 μL,注入液相色譜儀,記錄色譜圖,見圖1。

2.2.4 方法學考察

專屬性考察:由圖1可知,陰性對照品溶液在馬錢苷出峰處無干擾。結(jié)果表明,該方法專屬性良好。

線性關(guān)系考察:參照參考文獻[9-11]進行。將配制好的0.05 g/L馬錢苷對照品溶液加入1 mL樣品瓶中,精密吸取對照品儲備液3、5、6、8、10、13 μL進樣,按2.2.1項下色譜條件進行實驗,以進樣體積(X)為橫坐標、對照品峰面積(Y) 為縱坐標,得到標準曲線方程為Y=1.575 6X+0.206,R2=0.999 7。結(jié)果表明,馬錢苷進樣體積在0.15～0.65 μg范圍內(nèi)有良好的線性關(guān)系。

穩(wěn)定性試驗:取同一組樣品配置成0.05 g/L溶液,室溫下分別放置10、20、30、60、90、120 min,按照2.2.1項下色譜條件測量,計算相對標準差(relative standard deviation,RSD)。結(jié)果馬錢苷RSD為0.09%,表明樣品溶液在2 h內(nèi)穩(wěn)定性良好。

加樣回收試驗:精密吸取第9組樣品(馬錢苷含量0.19 g/L)3.5 mL,加入質(zhì)量分數(shù)0.099 5 g/L的對照品溶液6.7 mL(含馬錢苷0.666 7 mg),平行6份,按照2.2.1項下色譜條件進樣分析,計算平均回收率為101.73%,RSD為1.16%。結(jié)果表明,該方法具有較好的回收率。

2.3 多糖含量的測定

2.3.1 對照品溶液的制備

按照參考文獻[12-13],精密稱取0.033 17 g對照品D-無水葡萄糖,放置于100 mL容量瓶中,加入蒸餾水充分搖勻溶解,定容至刻度線,即得33 g/L的對照品溶液。

2.3.2 標準曲線的制備

分別取配置好的質(zhì)量分數(shù)0.05 g/L葡萄糖溶液0.2、0.4、0.6 mL,加入10 mL具塞刻度試管中,加水至2.0 mL,搖勻,放置冰水浴中,在冰水中緩慢滴加質(zhì)量分數(shù)為2 g/L的蒽酮-硫酸溶液至10 mL,搖勻,在沸水浴中反應(yīng)10 min,取出,放置冰水浴中冷卻10 min,取出,以水-蒽酮-硫酸為空白對照,根據(jù)紫外可見分光光度法測定原理進行光譜圖掃描,結(jié)果在(620±2) nm處有明顯吸收峰,確定吸收波長為620 nm。同法,分別取質(zhì)量分數(shù)為 33 g/L的葡萄糖溶液0.1、0.2、0.3、0.4、0.5、0.6 mL,在620 nm處測該波長處不同質(zhì)量分數(shù)對照品溶液的吸光度。以吸光度為縱坐標、質(zhì)量分數(shù)為橫坐標繪制標準曲線,得到Y(jié)=48.545X-0.061 5,R2=0.998 0。

2.3.3 含量測定

取上述正交試驗樣品溶液,稀釋溶液使質(zhì)量分數(shù)為0.05 g/L,將稀釋后的提取液,按照2.3.2項下方法測定吸光度值,計算黃萸斛多糖提取率。

2.4 提取工藝優(yōu)選

選擇馬錢苷含量及多糖提取率的綜合評分[14-15]為指標,根據(jù)兩個指標的藥理作用影響大小,設(shè)馬錢苷和多糖的權(quán)重系數(shù)分別為0.4和0.6。綜合評分=(馬錢苷提取率/馬錢苷提取率的最大值)×0.4+(多糖提取率/多糖提取率的最大值)×0.6,對水提條件進行優(yōu)選的結(jié)果見表2,方差分析見表3。各因素影響水提工藝的順序為C>B>A,因素C對提取工藝影響顯著,因素A 和B 對提取工藝無顯著影響,最后確定最佳提取工藝為A3B2C3,即加入10倍量水,煎煮3次,每次煎煮1.5 h。

表2 正交試驗設(shè)計和結(jié)果

表3 方差分析結(jié)果

2.5 正交試驗結(jié)果驗證

按處方比例分別取酒萸肉50 g、酒黃精50 g各3份,按最佳水煎煮工藝進行煎煮,即加飲片總量10倍量水,每次煎煮1.5 h,煎煮3次。合并水提液,測定水提液中馬錢苷、總多糖含量,計算提取率。測定方法與水提正交樣品相同。結(jié)果顯示,優(yōu)選出的最佳煎煮條件結(jié)果與正交試驗基本相近,說明該工藝穩(wěn)定、可行。見表4。

表4 煎煮工藝驗證結(jié)果

3 討 論

中藥是由多種成分組成的復(fù)合體,其藥效作用是多成分作用于一個或多個靶點所起的綜合效應(yīng),故中藥處方配比、成分種類、各成分的含量及各成分含量之間的比例對臨床療效的影響很大。隨著我國中藥制劑工藝的不斷創(chuàng)新和發(fā)展,中藥顆粒劑攜帶儲存方便和服用量少的優(yōu)勢逐漸突出。黃萸斛顆粒是先對酒黃精、酒萸肉、鐵皮石斛中的活性成分進行提取,然后選擇合適的輔料采用合理的工藝進行制備。在實驗操作中,曾設(shè)計了原料全提取工藝,即鐵皮石斛加酒黃精、酒萸肉共煎,濃縮后制粒。后經(jīng)正交試驗分析對比發(fā)現(xiàn),該結(jié)果與本試驗(將酒黃精、酒萸肉共煎濃縮后加鐵皮石斛粉混合再制粒)結(jié)果一致,均為1∶10 的料液比,每次煎煮1.5 h,煎煮3次。考慮到石斛多糖能夠提高機體免疫力、抗氧化等藥理作用及藥材珍貴性,為充分利用而避免在共煎中造成損失,最終選擇本實驗所用工藝。