HPLC切換波長法同時測定金花消痤丸中5種成分

【摘?要】?目的：建立HPLC法同時測定金花消痤丸中5種成分含量的方法。方法：色譜柱為依利特C₁₈色譜柱（4.6 mm×250 mm，5 μm）；流動相為0.1%甲酸溶液-乙腈，梯度洗脫；流速為1.0 mL/min；柱溫為30 ℃；檢測波長為220 nm、225 nm、238 nm、275 nm；進樣量為10 μL。結果：沒食子酸、梔子苷、黃芩苷、漢黃芩苷、大黃酚分別在1.81～54.24 μg/mL（r=0.9994）、23.91～717.3 μg/mL（r=0.9997）、17.11～513.33 μg/mL（r=0.9996）、3.57～106.98 μg/mL（r=0.9998）、1.72～51.45 μg/mL（r=0.9996）范圍內線性關系良好，平均回收率（RSD）分別為99.13％（0.87%）、100.33％（0.51%）、99.30％（0.64%）、100.64％（0.70%）、98.48％（1.07%）。結論：本方法簡便、高效、可靠，可用于金花消痤丸的質量控制。

【關鍵詞】?金花消痤丸；5種成分；HPLC；含量測定

【中圖分類號】R284.2???【文獻標志碼】 A????【文章編號】1007-8517（2024）03-0062-05

DOI：10.3969/j.issn.1007-8517.2024.03.zgmzmjyyzz202403014

Simultaneous Determination of Five Constituents in Jinhua Xiaocuo Pills by HPLC Wavelength Switching Method

GUI Lihua

Center for Food and Drug Inspection of Yunnan Province， Kunming 650106，China

Abstract：Objective ?To establish an HPLC method for the simultaneous content determination of five constituents in Jinhua Xiaocuo pills.?Methods ?The determination was performed on Yilite C₁₈column（4.6 mm×250 mm，5μm）with mobile phase consisted of 0.1% formic acid solution-acetonitrile at the flow rate of 1.0 ml/min.?The column temperature was 30 ℃，and the detection wavelengths were set at 220 nm，225 nm，238 nm and 275 nm.The injection volume was 10 μL.?Results ??The method achieved good linearity in the ranges of 1.81-54.24 μg/mL（r=0.9994）for Gallic acid，23.91-717.3 μg/mL（r=0.9997）for Geniposide，17.11-513.33 μg/mL（r=0.9996）for Baicalin，3.57-106.98 μg/mL（r=0.9998）for Wogonoside and 1.72-51.45 μg/mL（r=0.9996）for Chrysophanol.The average recoveries were 99.13％（0.87%），100.33％（0.51%），99.30％（0.64%），100.64％（0.70%），98.48％（1.07%）.Conclusions ?This simple， efficient and reliable method can be used for the quality control of Jinhua Xiaocuo pills.

Keywords：Jinhua Xiaocuo Pills；Five Constituents；HPLC；Determination

痤瘡是一種青春期常見的毛囊皮脂腺的慢性炎癥疾病，其主要由雄激素分泌增多，皮脂腺分泌亢進，毛囊皮脂腺導管阻塞角化異常，導致皮脂排泄障礙，皮脂潴留，繼發痤瘡丙酸桿菌感染所致^［1］。中醫認為痤瘡多為風熱犯肺證，屬肺風粉刺范疇。金花消痤丸是由梔子（炒）、金銀花、黃芩（炒）、大黃（酒炙）、黃連、桔梗、薄荷、黃柏、甘草9味中藥制成的濃縮水丸。具有清熱瀉火、解毒消腫之功效，用于肺胃熱盛所致的痤瘡、粉刺、胃火牙痛、口舌生瘡、喉嚨腫痛、目赤、便秘、尿黃赤。梔子瀉火除煩、清熱利尿、涼血解毒，金銀花清熱解毒，黃芩清肺熱、瀉上焦之火，大黃涼血解毒、清瀉實熱，黃連瀉心火兼瀉中焦之火，黃柏瀉下焦之火，各藥合用，清上和瀉下并行共同發揮清熱解毒、涼血瀉火、清癰散結之功效。現行質量標準無含量測定項目。文獻報道，陳磊^［2］采用HPLC法測定梔子苷含量，汪艷等^［3］采用HPLC法測定大黃酸、大黃素、大黃酚及大黃素甲醚含量，汪艷^［4］采用HPLC法測定鹽酸小檗堿含量，但都是對組方中的一味藥材中的一種或幾種成分進行測定，沒有對多味藥材中多種成分同時測定的研究報道，不利于從整體上控制該制劑質量。本文參考文獻^［5-20］，建立了HPLC法同時測定金花消痤丸中梔子苷、黃芩苷、漢黃芩苷、沒食子酸、大黃酚含量的方法，為該制劑標準提升提供參考。

1?儀器與材料

1.1?儀器?LC-20AT型高效液相色譜儀（Shimadzu），UV-2401PC型紫外可見分光光度計（Shimadzu），XSE205型電子天平（Mettler Toledo），KQ-300VDB雙頻數控超聲波清洗器（昆山市超聲儀器有限公司），電熱恒溫水浴鍋（北京市永光明醫療儀器有限公司）。

1.2?材料?梔子苷 （批號：110749-201718； 含量：97.6%）、黃芩苷 （批號： 110715-201619； 含量： 93.5%）、 漢黃芩苷（批號：112002-201702；含量：98.5%）、沒食子酸（批號：110831-201605；含量：90.8%）、大黃酚（批號：110796-201621；含量：99.2%），以上對照品均購置于中國食品藥品檢定研究院；金花消痤丸（批號：271288，200167，201814，210315，210823，211584；生產企業A）；乙腈為色譜純（Merck KGaA）；水為超純水（自制）；其余試劑均為分析純。

2?方法與結果

2.1?色譜條件?色譜柱：依利特C₁₈色譜柱（4.6 mm×250 mm，5 μm）；流動相：0.1%甲酸溶液（A）-乙腈（B），梯度洗脫（0～35 min，4%→39% B，35～50 min，39%→78% B，50～60 min，4% B）；檢測波長：0～11 min，220 nm（沒食子酸）；11～26 min，238 nm（梔子苷）；26～40 min，275 nm（黃芩苷、漢黃芩苷）；40～60 min，225 nm（大黃酚）；流速：1.0 mL/min；柱溫：30 ℃；進樣量：10 μL。

2.2?溶液的制備

2.2.1?對照品溶液?精密稱取梔子苷、黃芩苷、漢黃芩苷、沒食子酸、大黃酚對照品適量，加甲醇制成分別含上述對照品2.3910 mg/mL、1.7111 mg/mL、0.3566 mg/mL、0.1808 mg/mL、0.1715 mg/mL的混合對照品儲備液。精密量取混合對照品儲備液2.5 mL，置25 mL容量瓶中，加甲醇稀釋至刻度，搖勻，濾過，即得。

2.2.2?供試品溶液?取金花消痤丸適量，研細，混勻，精密稱取約0.8 g，置具塞錐形瓶中，精密加入甲醇50 mL，稱重，超聲（400 W，40 kHz）提取30 min，放冷，用甲醇補足重量，搖勻，靜置，取上清液濾過，即得。

2.2.3?陰性樣品溶液?按處方分別制得缺梔子、缺黃芩、缺大黃的陰性樣品，按“2.2.2”項下制備。

2.3?方法學考察

2.3.1?線性關系考察?精密吸取“2.2.1”項下的混合對照品儲備液0.25 mL、0.5 mL、1.25 mL、2.5 mL、5.0 mL、7.5 mL，分別置25 mL容量瓶中，加甲醇稀釋至刻度，搖勻，濾過，即得。濾液分別進樣10 μL，記錄峰面積。以濃度（X）、峰面積（Y）分別為為橫、縱坐標，進行線性回歸，各成分有良好的線性關系，詳見表1。

2.3.2?專屬性試驗?分別吸取“2.2”項下的各溶液，在“2.1”項色譜條件下測定，結果顯示，陰性樣品不干擾測定，如圖1所示。

2.3.3?精密度試驗?精密吸取“2.2.1”項下的溶液進樣6次，每次10 μL，記錄峰面積。結果，梔子苷、黃芩苷、漢黃芩苷、沒食子酸、大黃酚的RSD依次為0.45%、0.53%、0.34%、0.43%、0.61%。表明儀器有良好的精密度。

2.3.4?重復性試驗?取同一批（批號：271288）樣品6份，按“2.2.2”制備，測定梔子苷、黃芩苷、漢黃芩苷、沒食子酸、大黃酚的含量，其含量的RSD依次為0.58%、0.70%、0.81%、0.77%、1.02%。

2.3.5?穩定性試驗?取 “2.2.2”項下制備的同一供試品溶液，分別在0 h、5 h、10 h、20 h、36 h時進樣10 μL，記錄峰面積。結果，梔子苷、黃芩苷、漢黃芩苷、沒食子酸、大黃酚峰面積的RSD依次為0.49%、0.69%、0.48%、0.67%、0.81%，表明供試品溶液在36 h內穩定。

2.3.6?回收率試驗?精密稱取已測定含量的金花消痤丸（批號：271288）6份，每份約0.4 g，精密加入“2.2.1”項下的混合對照品儲備液2.5 mL，再精密加入甲醇47.5 mL，按“2.2.2”項下制備。測得回收率，詳見表2。

2.4?樣品測定結果?取6批金花消痤丸，按“2.2.2”項下制備，測定含量，結果見表3。結果顯示，6批次金花消痤丸中沒食子酸、梔子苷、黃芩苷、漢黃芩苷、大黃酚含量最大值是最小值的1.40倍、 1.42倍、1.29倍、1.27倍、1.55倍，各成分的平均值 （RSD） 為1.8096 （18.14%）、 12.8675 （12.31%）、 13.6489 （8.94%）、 2.2119 （8.51%）、 1.0487（15.05%），說明各成分含量之間存在一定差異，特別是含量較小的沒食子酸和大黃酚其RSD達18.14%和15.05%，產生這種結果的原因可能與處方中各藥材的產地、生長年限、采收季節、炮制方法等多種因素有關。

3?討論

3.1?指標成分的選擇?黃光強等^［18］、史永平等^［19］、王玉等^［20］均基于Q-marker理論預測分析，得出黃酮及其苷類化合物是黃芩發揮抗炎的物質基礎，梔子苷為梔子藥理作用的活性成分，蒽醌類及其衍生物成分是大黃瀉下攻積、清熱瀉火、涼血解毒的物質基礎。根據上述文獻^［18-20］，選擇了黃芩苷、漢黃芩苷、梔子苷、沒食子酸、大黃酚為該制劑的質控指標。

3.2?提取方法的選擇?參考文獻^［5-17］，首先考察了提取溶劑（乙醇和甲醇）及提取溶劑濃度（50%、75%、100%），100%甲醇提取時雜峰少且基線平穩，其次考察提取方法（回流和超聲），兩者沒有顯著差異；再次考察了提取時間（20 min、30 min、40 min），發現超聲提取30 min后5種成分的含量均未再增加。最終定用100%甲醇超聲（400 W，40 kHz）提取30 min。

3.3?檢測波長的選擇?分別取黃芩苷、漢黃芩苷、梔子苷、沒食子酸、大黃酚對照品的甲醇溶液在190～500 nm范圍內進行掃描，黃芩苷在215 nm和278 nm、漢黃芩苷在275 nm、梔子苷在238 nm、沒食子酸在220 nm和272 nm、大黃酚在225 nm和254 nm處有最大吸收。曾嘗試用單一波長同時檢測以上5種成分，當用225 nm或220 nm或215 nm時，梔子苷和漢黃芩苷響應值偏低，當用238 nm時，其它4種成分響應值均偏低，當用275 nm時，大黃酚和梔子苷響應值偏低，不利于定量測定，故選擇切換波長進行測定。

3.4?流動相的選擇?曾嘗試用乙腈-水或甲醇-水不含酸系統進行分離，但沒食子酸拖尾嚴重，為改善沒食子酸拖尾現象。根據文獻^［5-17］，流動相初步定為甲醇-0.1%甲酸溶液、甲醇-0.1%磷酸溶液、乙腈-0.1%甲酸溶液、乙腈-0.1%磷酸溶液，實驗發現乙腈-0.1%甲酸溶液、乙腈-0.1%磷酸溶液洗脫能力強，基線平穩，5種成分分離度和峰形均良好。0.1%磷酸溶液的pH值為3左右，酸性較強，不利于色譜柱的使用，為延長色譜柱使用壽命，選擇了酸性相對弱一些的乙腈-0.1%甲酸溶液，并進行梯度洗脫為本實驗的流動相。

3.5?測定結果分析?從樣品測定結果來看，各種成分含量在不同批次之間存在一定差異。為了達到中藥復方制劑質量的穩定可靠，建議藥品生產企業對藥材來源的穩定性加強把控，如相對固定產地、采收季節等，并建立科學有效的檢測方法對各味藥材進行質量控制，保障藥品質量穩定，確保發揮較好的臨床療效。

現代醫學研究^［21-22］表明，金花消痤丸治療痤瘡療效明顯。梔子、大黃、黃芩對丙酸桿菌有一定的抑菌作用，調節皮脂分泌，同時還可以使大便變軟和促進排便，改善體內環境，是金花消痤丸發揮療效的重要藥味。中藥復方制劑的臨床療效是來自組方中各味中藥的共同作用，為確保臨床療效，同時控制多味中藥質量非常必要。該方法能同時測定金花消痤丸中5種成分的含量，對確保金花消痤丸的臨床療效發揮了積極的作用。

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（收稿日期：2023-05-04?編輯：杜玲玉珊）

作者簡介：桂立華（1989—），女，漢族，本科，主管藥師，研究方向為藥品質量標準研究。E-mail：504614512@qq.com