用于玉米品種真實性鑒定的最優核心SNP位點集的研發

田紅麗 楊 揚 范亞明 易紅梅 王 蕊 金石橋 晉 芳 張云龍 劉亞維 王鳳格,* 趙久然,*

用于玉米品種真實性鑒定的最優核心SNP位點集的研發

田紅麗1,**楊 揚1,**范亞明1,**易紅梅1王 蕊1金石橋2晉 芳2張云龍1劉亞維1王鳳格1,*趙久然1,*

1北京市農林科學院玉米研究所/ 農業農村部農作物DNA指紋創新利用重點實驗室(部省共建) / 玉米DNA指紋及分子育種北京市重點實驗室, 北京 100097;2全國農業技術推廣服務中心, 北京 100125

品種真實性是種子質量監測的一個重要指標。為建立準確可靠、快速簡便、高通量、低成本的玉米品種真實性鑒定技術, 本文利用200個核心SNP位點構建的5816個玉米雜交品種, 3274個自交系的指紋數據, 基于遺傳算法、品種識別率評估確定了一套高鑒別力的核心SNP位點集, 包含96個SNP位點。這96個SNPs全部位于基因內區域, 相對均勻分布在10對染色體上。采用上述雜交品種和自交系的指紋數據評估顯示這96個位點具有較高多態性和品種區分能力, PIC、MAF、DP平均值分別為0.36、0.40、0.60和0.36、0.39、0.48, 對雜交品種、自交系的品種識別率達到99.14%和99.24%。兩兩樣品成對比較結果顯示, 99.99%的品種間差異位點數目≥3個, 雜交品種和自交系中96.74%和95.67%的成對比較差異位點數目集中在30～65個和30～60個。基于221個主推雜交品種的40個SSR位點、96個SNP位點的基因型數據分析結果顯示, 這2組標記集的鑒定結果具有較高的一致性。綜上所述, 本研究報道了一套具有位點數量最少、區分能力最強, 兼容多平臺、適于自動化分型等優點的最優核心SNP集。期望位點集將在玉米品種真實性監測、種子質量控制中得到廣泛應用, 進而維護玉米種子市場秩序、保障育種者權利以及保護農民利益。

玉米品種; 真實性鑒定; SNP位點集; 高鑒別力

種子是農業現代化的基礎。品種真實性是種子質量監測的一個重要指標, 如何快速準確的鑒定其真假, 對于保護育種者權益, 推動種業持續健康發展有著重要意義。隨著種業的快速發展, 種子質量監管力度不斷加大, 涵蓋了企業抽查、市場檢查、基地督查等; 監管重點不斷變化, 監管內容由常規指標向真實性等側重。玉米為全球第一大作物, 是我國總產最高、種業市值最大的作物, 也是種業市場監管重要作物之一。隨著玉米種業的快速發展和生物育種技術的普及應用品種數量劇增, 截至當前我國已有審定玉米品種2萬品次以上, 每年仍有近1萬個品種組合在參試; 申請植物新品種權超過15,000件, 其中授權品種6000多件, 在農作物中排名第一(http://202.127.42.145/bigdataNew/)。玉米品種數量的爆發對真實性鑒定是極大的挑戰, 迫切需要推薦一套區分能力最強、穩定性最好、兼容多平臺、易整合共享的位點集, 建立高效精準的分子鑒定技術, 解決海量品種真實性鑒定的需求。

基因分型技術快速發展、不斷與時俱進, 給利用更新更高效的分子技術手段有效鑒別品種真實性提供了可能。基于SSR分子標記, 玉米品種分子鑒定系列標準被陸續頒布[1-3]。利用上述標準, 北京市農林科學院玉米研究所構建了已包含10萬多個樣品、40個SSR標記的玉米標準DNA指紋庫, 相關鑒定技術在種業領域中得到了廣泛應用[4-5]。但是隨著檢測需求的不斷變化, 頒布標準中的SSR標記集已難以滿足對標記數量、檢測通量、指紋數據整合共享等更高的要求。SNP標記是基于單個核苷酸多態性開發的標記, 具有在基因組上分布密度高、數據易整合、檢測通量高等特征。同時玉米多個參考基因組序列的公布、大量重測序數據的釋放、高通量分型平臺的快速發展為SNP標記在品種鑒定領域中的應用奠定了良好基礎[6-11]。在玉米標準指紋構建和鑒定技術研發方面, 基于SNP標記研制出高密度SNP芯片產品Maize 6H-60K, 評估確定系列核心位點集合如兼容型Maize SNP 384位點集、適于標準指紋構建的200個SNP等, 構建了已包含2萬多個玉米品種SNP-DNA指紋庫[12-15]。然而在玉米以及其他農作物品種真實性鑒定方面, 除了已發布的玉米、水稻、小麥品種真實性鑒定的3個行業標準之外, 基于SNP標記圍繞品種真實性鑒定開展的系列研究報道非常少[16-21]。

常用的SNP標記檢測技術主要有測序法、基因芯片和KASP (Kompetitive Allele Specific PCR)分型技術平臺等。其中KASP技術為競爭性等位基因特異性PCR體系, 可兼容96、384和1536多種酶標板, 具有試驗流程簡單、樣本通量高、試驗設計靈活等特點, 尤其適合SNP二態性標記類型的基因分型檢測[11]。本研究基于已構建的玉米品種SNP-DNA指紋庫, 利用遺傳算法, 篩選確定了一套適于真實性鑒定的高鑒別力最優SNP位點集[15]。利用已知品種對核心位點進行評估驗證, 基于KASP平臺建立快速高效精準玉米品種真實性鑒定技術, 以期為提高種子質量、維護種子市場秩序、保障農民合法權益提供有力的技術支撐。

1 材料與方法

1.1 供試材料

利用1984—2019年通過國家和各省審定的5816個玉米雜交品種, 3274個廣泛代表性的玉米自交系的指紋數據從200個SNP位點中評估確定一套品種鑒別區分能力最強的核心位點集[15]。利用221個雜交品種評價SNP核心位點組合與40個SSR位點鑒定結果的相關性。221個雜交種為通過國家審定, 代表了我國主要推廣種植的品種。選用了20套三聯體(雙親及其F1)材料評價核心位點集的遺傳穩定性, 具體包含鄭單958、先玉335、京科968等種植面積較大的品種、區試審定試驗對照品種、專用雜交品種等及其對應親本。

1.2 總DNA提取

每個材料隨機選取30個單株混合, 采用改良CTAB法提取總DNA, 并去除RNA[1-2]。用1%瓊脂糖凝膠電泳及紫外分光光度計(Nanodrop 2000, Thermo Fisher Scientific)檢測DNA的質量和濃度, 工作液濃度統一稀釋到20 ng μL–1備用。

1.3 SNP基因分型試驗及基因型數據采集

SNP基因分型采用SNP-Line平臺、KASP技術體系(Kompetitive Allele Specific PCR, LGC Genomics)。PCR擴增反應使用1536微孔板, 體系為1 μL, 包含1.5 μL DNA工作液(烘干), 0.5 μL 2× Master mix, 去離子水0.486 μL, 0.014 μL引物工作液(引物1、引物2和引物3濃度分別為12、12和30 μmol L–1, 附表1)。PCR擴增反應在水浴PCR儀(Hydrocycler- 64, LGC Genomics)上進行, 擴增反應程序為: 94℃ 15 min; 94℃ 20 s, 61～55℃ 60 s, 10個循環(每循環降低0.6℃); 94℃ 20 s, 55℃ 60 s, 26個循環。每板96個樣品中放置2個參照樣品、1個重復樣品、1個空白。利用PHERAstar plate reader (LGC Genomics)熒光掃描儀對擴增后的產物進行掃描, 掃描結果利用Kraken軟件(V17.12.8.19596, LGC Genomics)進行基因型數據采集。

1.4 數據分析

采用SNP/INDEL位點篩選工具LociScan_V1.0 (北京市農林科學院玉米研究所, 軟著登記號為2018SR003573), 利用“基于遺傳算法的植物品種真實性鑒定位點篩選方法”[22], 基于5816個雜交品種、3274個自交系的指紋數據, 從200個SNP位點中逐步抽取位點組合, 確定一套適于玉米品種真實性鑒定的、高鑒別力的最優SNP位點集[15]。200個SNP位點是從Maize 6H-60K芯片包含的61,214個SNP位點中, 根據位點的平臺兼容性(芯片、KASP、靶向測序等平臺)、均勻分布、多態性(能明確區分已知品種)、位點數目充分考慮未來品種情況兼顧檢測平臺通量特征等而綜合確定的一套核心位點集[15]。利用SNP 比對統計工具V1.0 (北京市農林科學院玉米研究所, 軟著登記號為2018SR026743)分析核心SNP位點的MAF (Minor Allele Frequency)、PIC (Polymorphism Information Content)、DP (Discrimination Power)以及雜合基因型頻率(AB rate)。

利用Python3語言, 采用Biopython圖形庫繪制SNP核心位點在染色體上的物理位置示意圖(https:// biopython.org/)。利用SNP比對統計工具V1.0, 基于5816個雜交品種、3274個自交系的核心SNP集的指紋數據, 計算品種間兩兩成對比較差異位點數; 選用221個雜交種的核心SNP和40對SSR指紋數據, 計算品種間的Nei1973遺傳距離, 分析2種標記之間鑒定結果的相關性。基于Python3語言、采用matplotlib圖形庫繪制20套三聯體材料的SNP-DNA指紋圖譜(https://matplotlib.org/)[2,5]。

2 結果與分析

2.1 玉米品種真實性鑒定最優核心SNP位點集- 96個SNP位點的篩選確定

基于玉米SNP-DNA指紋庫中5816個雜交品種、3274個自交系的指紋數據, 利用遺傳算法從200個建庫位點中逐步抽取最優位點組合, 包含的位點數目從2個增加到100個, 并分析其品種識別率的變化情況, 進而確定適于玉米品種真實性鑒定的位點數目和最優組合(圖1)[15]。不同位點數目對于雜交品種、自交系2組材料的品種識別率(Variety Discrimination Power, VDP)情況為: 20個位點組合的品種識別率為89.80%、86.96%; 40、60和80個位點組合的品種識別率分別為96.14%、94.99%、97.68%、97.61%、98.45%、98.74%; 96個位點組合品種識別率達到99.14%和99.24%; 100個位點組合品種識別率達到99.17%和99.33% (圖1)[23]。基于最優位點組合對玉米已知品種識別率的變化曲線圖, 結合KASP基因分型平臺特征, 確定具備高鑒別力的SNP位點集, 包含96個位點(附表1)。

圖1 最優位點集的品種識別率變化曲線圖

橫坐標為位點組合包含的位點數目, 縱坐標為品種識別率。

The abscissa is the number of loci included in the loci combination, and the ordinate is the rate of variety discrimination power.

2.2 96個核心SNP位點的基本特征

根據96個核心SNP位點的物理位置繪制其在玉米核基因組的分布圖(附表1和圖2)。96個位點相對均勻分布在玉米10對染色體上, 3號、4號、7號和9號染色體分布9個位點, 其余染色體上分布10個位點(圖2)。基于B73 AGPv3注釋信息, 96個SNP核心位點均位于基因內區域, 其中50個(52%)位點位于exon區, 26個(27%)位于5'UTR和3'UTR區, 17個(18%)位于promotor區, 3個(3%)位于intron區。

基于5816個雜交品種、3274個自交系數據分析96個SNP的評估參數PIC、MAF、品種識別能力DP和雜合基因型頻率(AB genotype rate, 雜合基因型標記數目/96) (圖3)。雜交品種數據分析顯示96個SNP位點的PIC、MAF、DP、雜合基因型頻率值的變異范圍分別為0.29～0.38、0.23～0.50、0.52～0.65、0.33～0.63, 平均值分別為0.36、0.40、0.60、0.48; 97%的位點PIC值高于0.30, 91%的位點MAF值高于0.30, 所有位點DP值均高于0.50, 在雜交品種材料中顯示了較高的雜合基因型頻率。利用自交系數據分析顯示96個SNP位點的PIC、MAF、DP、雜合基因型頻率值的變異范圍分別為0.25～0.38、0.18～ 0.49、0.31～0.53、0.01～0.04, 平均值分別為0.36、0.39、0.48、0.01; 95%的位點PIC值高于0.30, 85%的位點MAF值高于0.30, 92%的位點DP值高于0.40,在自交系材料中顯示了極低的雜合基因型頻率。

圖2 96個核心SNP位點在玉米核基因組上的分布

圖3 基于5816個雜交品種、3274個自交系評估96個SNP位點的PIC、MAF、DP和雜合基因型頻率(AB rate)分布

橫坐標為SNP位點, 排序依據PIC值由小到大的順序; 縱坐標為各評估參數值。

The abscissa is the SNP loci sorted by PIC value in descending order, the ordinate is the values of each evaluation parameter.PIC: polymorphism information content; MAF: minor allele frequency; DP: discrimination power; AB rate: AB heterozygous genotype rate.

2.3 96個核心SNP位點的品種鑒定能力

圖1整體顯示了96個SNP位點集對玉米已知品種累計識別率均已達到99%以上, 品種間兩兩成對比較的差異位點數目能具體反映位點組合區分品種的情況。圖4為分別對5816個雜交品種和3274個自交系內兩兩樣品成對比較, 統計差異位點分布情況, 總共比較對數分別為16,910,020和5,357,901對。

分別對雜交品種和自交系兩兩樣品成對比較結果顯示差異位點數目范圍分別為0～83個和0～74個, 差異位點為0的樣品為極近似或派生品種(圖4)。對于雜交品種的鑒別: 差異位點數目分別為0、1、2、3個的分別占比0.0011%、0.0022%、0.0025%、0.0030%, 差異位點數目≥3個的占比99.99%, 差異位點數目≥20個的占比99.69%, 差異位點數目≥40個的占比87.00%, 差異位點數目≥60的占比9.96%, 差異位點數目≥70的占比0.16%, 96.74%的成對比較差異位點數目集中在30～65個。對于自交系的鑒別: 差異位點數目分別為0、1、2和3個的分別占比0.0025%、0.0043%、0.0055%和0.0067%, 差異位點數目≥3個的占比99.99%, 差異位點數目≥20個的占比99.30%, 差異位點數目≥40個的占比82.20%, 差異位點數目≥60的占比1.16%, 95.67%的成對比較差異位點數目集中在30～60個。

從玉米品種SSR-DNA指紋數據庫中抽取221個雜交品種40對SSR引物的基因型數據[2,5]。利用221份雜交品種40個SSR位點、96個SNP位點的基因型數據, 計算兩兩樣品之間的Nei1973遺傳距離, 分析顯示2種標記集鑒定結果具有較高的相關性。所有的數據點較集中分布, 并成線性關系, 皮爾遜相關系數值(Pearson’s Correlation Coefficient)值為0.63 (圖5)。

圖4 玉米自交系和雜交品種分別成對比較差異SNP位點數目分布圖

圖5 基于221個雜交品種兩兩遺傳距離對96個SNP與40個SSR位點之間的相關性分析

選取包含鄭單958、先玉335、京科968等推廣種植面積較大的品種、以及區試審定對照品種等共20套三聯體材料, 圖像化展示其在96個SNP位點中的基因型數據, 10種顏色分別代表了不同的基因型和缺失數據(圖6)。結果顯示20套三聯體材料在96個位點中無數據缺失, 且雜交種與父母本在每個位點上的指紋數據均符合遺傳規律。

3 討論

3.1 高鑒別力核心SNP位點集在玉米品種真實性鑒定中的應用優勢

廣義上的品種真實性鑒定包含品種真實性驗證和真實性身份鑒定2個方面。品種真實性驗證是指與其對應品種名稱的標準樣品比較, 檢測證實供檢樣品的品種名稱與標注名稱是否相符; 主要是檢測供檢樣品與標準樣品之間的差異, 強調的是對結果的否定, 一般采用區分能力最強、位點數目最少的標記集合。品種真實性身份鑒定是確定供檢樣品的真實品種名稱, 主要是確定2個樣品是否相同, 強調的是對結果的肯定, 一般采用全基因組均勻分布的高密度位點集合[24-25]。本文確定的一套高鑒別力最優核心SNP位點集主要是用于品種真實性驗證, 具備滿足品種真實性驗證位點組合的以下優勢特征。第一, 位點數量最少、品種區分能力最強。本文篩選確定的96個SNP位點, 是利用5816個雜交品種、3274個自交系(基本涵蓋了玉米已知品種)進行評估篩選, 基于最優遺傳算法從1個位點開始增加位點數目, 并且每輪都是尋找累計品種區分能力最強的一組位點。結合KASP等分型平臺特征, 最終確定了一套高鑒別力核心SNP位點集。該集合能夠區分99%以上的自交系和雜交品種, 體現了用最少位點區分最多品種的目的, 達到樣本通量高、檢測成本低的效果。第二, 位點適于自動化基因分型。96個位點在芯片、KASP等平臺每個位點的分型效果均體現了3種基因型的數據點各自內聚, 且有明顯的界限特征。因此在進行基因型讀取時易于自動化讀取, 無需人工校正。第三, 位點兼容多平臺。用于玉米標準SNP-DNA指紋構建的200個核心位點, 為利用大量樣品通過芯片、定點測序、KASP平臺的評估驗證, 具有較好分型效果的位點[15]。96個位點則是進一步通過多平臺、多實驗室驗證, 在樣本高通量平臺如KASP、TaqMan等平臺呈現完美分型效果的位點。同時由于96個SNP位點通過了多個平臺驗證, 說明位點側翼序列具有較好的保守性、易設計引物或探針, 即使再擴展到其他平臺, 也具有很高的技術平臺兼容型。

圖6 20套三聯體(雜交品種及其雙親)樣品96個位點的SNP-DNA指紋展示圖

每行代表1個樣品, 每3行代表1套三聯體樣品, N01～N20為三聯體樣品的編號; 每列代表1個SNP位點, 按照在基因組上的物理位置排序; DNA指紋分別用不同顏色表示。

Each row represents one variety, each three rows represent one set of triplet samples, N01–N20 are the numbers of the triplet samples; each column represents one SNP locus sorted by physical location on genome; DNA fingerprints are displayed in different colors.

3.2 96個核心SNP位點在玉米品種真實性驗證中的應用方案

基于推薦的96個核心SNP位點開展玉米品種真實性驗證時, 實驗室可統籌考慮檢測樣本規模、已有分型平臺(如KASP、熒光定量PCR、TaqMan探針法等), 制定相應的檢測方案。由于品種真實性驗證的目的為判定供檢種子是否為假種子、主要是找不同, 故允許采用序貫法方式檢測, 若檢測到足夠的差異位點可終止檢測, 對于結果的判定依據差異位點數目給出鑒定意見。

玉米品種真實性驗證的判定閾值需綜合考慮玉米品種間、品種內差異, 現行標準以及玉米種業現狀等各種因素。第一, 玉米不同品種間的差異情況。本文中通過大量已知品種(5816個雜交品種和3274個自交系)兩兩比對結果顯示: 已知自交系、自交系, 差異位點數目在0、1、2和3占據比例極少在0.0067%以內, 差異位點數目≥3個的占比99.99%, 95%以上的成對比較差異位點數目集中在30～65個之間。第二, 玉米品種內差異情況。玉米雜交品種存在其親本中極少數位點未完全純合的情況, 未純合位點的基因型會隨著親本的提純而發生變化, 在雜交品種會呈現分離。品種真實性驗證的判定閾值需考慮此情況, 避免將不同繁種世代的種子誤判為不同品種的可能, 因此應允許品種內不同個體存在極小的變異。第三, 現行相關標準的情況。現行玉米品種真實性鑒定SSR標記法標準中判定不同的閾值為2, 即達到5%的位點差異判定為不同。但是由于單個SNP比單個SSR位點品種區分能力低, 因此SNP標記法差異位點的比例低于5%。綜上所述, 基于96個核心SNP位點的玉米品種真實性驗證標準中判定閾值推薦為3個位點[2,16]。當供檢樣品與標準樣品比較差異位點數目≥3, 排除兩者為同一品種; 供檢樣品與標準樣品比較差異位點數為1或2, 不確定兩者為同一品種; 供檢樣品與標準樣品比較差異位點數為0, 不排除兩者屬于同一品種。

3.3 96個核心SNP位點集在玉米品種真實性鑒定中的應用前景

種子是農業現代化的基礎, 關系國家糧食安全和長遠發展。我國最早于1962年發布《關于加強種子工作的決定》; 2000年《種子法》開始實施, 農作物種業開啟市場化改革, 形成了數量龐大的種子企業; 2021年通過的《種業振興行動方案》, 提出加強知識產權保護、優化營商環境, 要推行全鏈條、全流程監管, 對假冒偽劣、套牌侵權等突出問題要重拳出擊。真實性鑒定是種子質量監管中的重要內容, 是評價種子等級的主要依據, 是保障優良品種遺傳特征充分發揮、保障穩產高產的有效措施。玉米蘊藏巨大經濟價值, 作為第一大農作物真實性鑒定需求量最高, 同時也一直是首要的關鍵監管作物。就政府需求而言, 監管力度不斷加大, 包含了制種基地督查、企業抽查、市場檢查、市場摸底行動。從市場需求分析, 來自于企業質檢、工商打假、司法鑒定、科研育種、農民維權等方面的真實性檢測需求逐步上升。同時隨著近些年品種數量的爆發, 其種子真實鑒定樣本數量也在急劇增加。面對上述需求, 高效精準低成本的檢測技術一直是研究者的追求目標。利用本文篩選確定的高鑒別力最優SNP位點集, 結合樣本高通量的KASP平臺建立準確可靠、快速簡便、高通量、低成本的玉米品種真實性鑒定技術, 解決了指紋數據整合共享的問題, 提高了檢測規模和自動化水平, 技術可在種子監管、品種創新、市場需求中展現良好的應用前景, 保障種業的健康穩定發展。

4 結論

利于5816個玉米雜交種, 3274個自交系的指紋數據, 篩選確定了一套適于真實性鑒定的高鑒別力、高準確性、高穩定性、兼容多平臺的SNP位點集(包含96個SNP位點), 基于KASP平臺建立高效精準快速的玉米品種真實性鑒定技術, 為保障種子質量、維護種子市場秩序、保障農民合法權益等提供技術支撐。

附表 請見網絡版: 1) 本刊網站http://zwxb. chinacrops.org/; 2) 中國知網http://www.cnki.net/; 3) 萬方數據http://c.wanfangdata.com.cn/Periodical- zuowxb.aspx。

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Development of an optimal core SNP loci set for maize variety genuineness identification

TIAN Hong-Li1,**, YANG Yang1,**, FAN Ya-Ming1,**, YI Hong-Mei1, WANG Rui1, JIN Shi-Qiao2, JIN Fang2, ZHANG Yun-Long1, LIU Ya-Wei1, WANG Feng-Ge1,*, and ZHAO Jiu-Ran1,*

1Maize Research Institute, Beijing Academy of Agriculture and Forestry Sciences / Key Laboratory of Crop DNA Fingerprinting Innovation and Utilization of the Ministry of Agriculture and Rural Affairs (Co-construction by Ministry and Province) / Beijing Key Laboratory of Maize DNA Fingerprinting and Molecular Breeding, Beijing 100097, China;2National Agricultural Technology Extension and Service Center, Beijing 100026, China

Variety genuineness is an important indicator for seed quality monitoring. In order to establish accurate, reliable, fast, simple, high-throughput, and low-cost maize variety genuineness identification technology, we evaluated and determined a set of high discriminative power core SNP loci set including 96 SNPs based on SNP fingerprint data of 5816 maize hybrids and 3274 inbred lines using the genetic algorithm and variety recognition rate. All 96 SNPs were located in the intra-gene region, generally distributed evenly on 10 pairs of chromosomes. The evaluation results using the above hybrid and inbred line data showed that 96 SNPs set had high polymorphism and variety discrimination power. The average values of PIC, MAF, and DP were 0.36, 0.40, 0.60, and 0.36, 0.39, 0.48 for hybrids and inbred lines, respectively. The variety discrimination power for hybrids and inbred lines reached 99.14% and 99.24%, respectively. Pairwise comparison between varieties showed that 99.99% of the comparisons had at least three differential loci. About 96.74% of hybrids and 95.67% of inbred lines mostly had the 30?65 and 30?60 differential loci between varieties, respectively. Compared with the 40 SSRs genotype dataset using 221 hybrids, the 96-SNPs set had high consistency in the identification results of the two marker sets. In summary, the optimal core SNPs set reported in this study had the advantage of the minimum number of loci, the highest discrimination power, the strongest differentiation platforms, and the automatic genotyping. It is expected that the extensive application of this core SNP loci set will be widely used in maize variety genuineness monitor and seed quality control for maintaining seed market order, so as to defend the breeders’ rights and protecting interests of farmers.

maize variety; genuineness identification; SNP loci set; high discrimination power

10.3724/SP.J.1006.2024.33052

本研究由國家科技創新重大項目(2022ZD04019)和北京市農林科學院財政項目(KJCX20230301, CZZJ202206)資助。

This study was supported by the National Scientific and Technological Innovation-Major Projects (2022ZD04019) and the Financial Project of Beijing Academy of Agriculture and Forestry Sciences (KJCX20230301, CZZJ202206).

趙久然, E-mail: maizezhao@126.com, Tel: 86-10-51503936; 王鳳格, E-mail: gege0106@163.com, Tel: 86-10-51503558

**同等貢獻(Contributed equally to this work)

田紅麗, E-mail: tianhongli9963@163.com; 楊楊, E-mail: caurwx@163.com; 范亞明, E-mail: 13718078547@163.com

2023-10-25;

2024-01-12;

2024-02-08.

URL: https://link.cnki.net/urlid/11.1809.S.20240206.1450.008

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