眼表外胚層與表面外胚層轉錄組差異分析

孫 露,張燦偉,宋玉雯,李建新,段 練,高 陽,謝月美,王露萍,黨光福

?AIM：To identify transcriptional differences between the ocular surface ectoderm (OSE) and surface ectoderm (SE) using RNA-seq, and elucidate the OSE transcriptome landscape and the regulatory networks involved in its development.

?METHODS：OSE and SE cells were differentiated from human embryonic stem (hES) cells. Differentially expressed genes (DEGs) between OSE and SE were analyzed using RNA-seq. Based on the DEGs, we performed gene ontology (GO) analysis, Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes (KEGG) pathway enrichment analysis, and protein-protein interaction (PPI) network analysis. Transcription factors (TFs) and hub genes were screened. Subsequently, TF-gene and TF-miRNA regulatory networks were constructed using the NetworkAnalyst platform.

?RESULTS：A total of 4 182 DEGs were detected between OSE and SE cells, with 2 771 up-regulated and 1 411 down-regulated genes in OSE cells. GO-BP analysis revealed that up-regulated genes in OSE were enriched in the regulation of ion transmembrane transport, axon development, and modulation of chemical synaptic transmission. Down-regulated genes were primarily involved in nuclear division, chromosome segregation, and regulation of cell cycle phase transition. KEGG analysis indicated that up-regulated genes in OSE cells were enriched in signaling pathways such as cocaine addiction, axon guidance, and amphetamine addiction, while down-regulated genes were enriched in proteoglycans in cancer, ECM-receptor interaction, protein digestion and absorption, and cytokine-cytokine receptor interaction. Additionally, compared with SE, 204 TFs (including FOS, EGR1, POU5F1, SOX2, and PAX6) were up-regulated, and 80 TFs (including HAND2, HOXB6, HOXB5, HOXA5, and HOXB8) were down-regulated in OSE cells. Furthermore, we identified 6 up-regulated and 9 down-regulated hub genes in OSE cells, and constructed TF-gene and TF-miRNA regulatory networks based on these hub genes.

?CONCLUSIONS：The transcriptome characteristics of OSE and SE cells were elucidated through RNA-seq analysis. These findings may provide a novel insight for studies on the development and in vitro directed induction of OSE and corneal epithelial cells.

0 引言

眼表外胚層(ocular surface ectoderm,OSE)屬于表面外胚層(surface ectoderm,SE),是眼表上皮(即角膜和結膜上皮)在胚胎時期的前體細胞[1],其對眼表正常發育及出生后正常視覺功能的維持至關重要。在胚胎發育過程中,前神經板發育而來的視網膜前體細胞向覆蓋在其表面的表面外胚層延伸,然后該區域的表面外胚層增厚并產生假定的角結膜上皮[2]。因此,眼表外胚層在發育過程中受到表面外胚層以及來自視網膜前體細胞等神經外胚層的雙重信號調控。目前表面外胚層細胞發育調控機制已較明確[3],分析眼表外胚層與表面外胚層細胞基因表達差異,有助于闡明眼表外胚層發育調控機制。基于此,本研究通過對人胚胎干細胞(human embryonic stem cells,hES)來源的眼表外胚層和表面外胚層進行轉錄組測序(RNA sequencing,RNA-seq)分析,篩選出眼表外胚層與表面外胚層的差異表達基因(differential expressed genes,DEGs)、轉錄因子(transcription factor, TF)及Hub基因,并進行基因本體(gene ontology, GO)分析、京都基因組百科全書(Kyoto Encyclopedia of Gene and Genomes, KEGG)分析及蛋白質-蛋白質相互作用(protein-protein interaction, PPI)分析,還針對Hub基因構建了TF-gene調控網絡和TF-miRNA調控網絡,在轉錄組水平揭示了二者表型及信號調控的差異,可為眼表外胚層轉錄組特征及發育調控機制研究提供指導。

1 材料和方法

1.1材料本研究中所用到的人胚胎干細胞均購自美國康寧公司,且相關實驗工作均已獲得山東第一醫科大學第一附屬醫院醫學倫理委員會批準,并按照相關規定進行。

1.2方法

1.2.1人胚胎干細胞培養及誘導分化人胚胎干細胞H1細胞株接種于1%濃度的matrigel包被的培養板,采用mTeSRTM 1或mTeSRTM plus培養基(StemCell Technologies)培養。每5-6 d按1∶10的比例傳代一次。眼表外胚層細胞誘導參照以往文獻報道的方法[4-5]。首先,將 hES 細胞接種于LN511包被的培養皿,mTeSRTM 1或mTeSRTM plus培養基培養4-7 d,然后將培養基改為分化培養基,成分見表1。培養3 wk后,在誘導的細胞中即可同時形成神經外胚層、眼表外胚層和其他表面外胚層細胞,在顯微鏡下手動刮除神經外胚層和其他表面外胚層后即可獲取眼表外胚層細胞。表面外胚層細胞誘導:每平方厘米6.2×103個人胚胎干細胞接種于1%濃度的matrigel包被的培養板上。第2 d,將培養基改為含1 μmol/L RA(Sigma)和5 ng/mL重組人BMP-4(R&D Systems)的E6培養基培養,2 d換液1次,培養7 d。

表1 細胞分化培養基成分表

1.2.2免疫熒光染色4%多聚甲醛固定細胞后,用PBS緩沖液沖洗。然后山羊血清孵育30 min,一抗在4 ℃孵育過夜。PBS緩沖液沖洗后加入二抗在37 ℃孵育1 h。PBS緩沖液沖洗后DAPI染色,PBS緩沖液沖洗后在熒光顯微鏡下采集細胞免疫熒光圖像。

1.2.3定量實時逆轉錄酶PCR 使用RNeasy Mini Kit (QIAGEN)提取人胚胎干細胞及人胚胎干細胞誘導的眼表外胚層、表面外胚層細胞的總RNA。隨后使用PrimeScript Real-Time Master Mix Kit (Takara)合成cDNA后進行定量實時逆轉錄酶PCR(qRT-PCR)。PCR程序:95 ℃變性3 min,然后進入熱循環程序:95 ℃變性5 s和60 ℃退火和延伸30 s,重復40個循環。

1.2.4轉錄組測序及RNA-Seq數據分析提取的眼表外胚層和表面外胚層細胞的總RNA,檢測質量合格后,使用 TruSeq Stranded mRNA Library Prep kit試劑盒構建文庫。隨后總RNA使用NextSeq 500(Illumina)進行轉錄組測序。差異基因及GO、KEGG分析:使用R4.1.2版進行基因表達分析,并應用DEseq2分析眼表外胚層、表面外胚層細胞中基因水平的差異表達,篩選出|log2(fold change)|>1和Padj<0.05的DEGs,使用R軟件進行火山圖譜繪制。隨后,利用GO分析和KEGG分析對DEGs進行功能富集分析,以確定DEGs的主要生物學功能和相關的信號通路。轉錄因子分析:通過hTFtarget database 數據庫(http://bioinfo.life.hust.edu.cn/hTFtarget)獲取人類轉錄因子基因集,將差異基因與轉錄因子進行比較、篩選和校正。用R軟件篩選|log2(fold change)|>1和Padj<0.05的轉錄因子,并繪制熱圖。

1.2.5PPI網絡搭建及模塊分析為了進一步探討DEGs之間的相互作用,我們使用STRING數據庫(http://string-db.org/)構建PPI網絡,設置相關系數絕對值大于0.4[6-7]。使用Cytoscape 軟件繪制 PPI 網絡。另外,使用Cytoscape插件Cytoscape MCODE篩選關鍵功能基因模塊。

1.2.6Hub基因的篩選應用Cytoscape軟件中的cytoHubba 插件篩選Hub基因。然后,我們選擇7種算法(MCC、MNC、Degree、EPC、Closeness、Radiality、Stress)的交集,最終得到Hub基因。最后,通過GeneMANIA10 (http://www.genemania.org/) 構建了Hub基因的共表達網絡[6]。

1.2.7TF-gene調控網絡和TF-miRNA調控網絡的構建通過Networkanalyst數據庫(https://www.networkanalyst.ca/)構建了TF-gene和TF-miRNA調控網絡。隨后通過Cytoscape軟件可視化。

統計學分析:使用GraphPad Prism(GraphPad, San Diego, CA)軟件進行統計分析。所有實驗數據均以均數±標準差表示。采用單因素方差分析對各組間數據進行統計學檢驗,兩組間比較采用獨立樣本t檢驗,以P<0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1人胚胎干細胞誘導分化及相關標記物的鑒定人胚胎干細胞在分化培養基中被誘導,逐漸形成了3個同心細胞團(神經外胚層、眼表外胚層和其他表面外胚層細胞),見圖1A,定向分化成表面外胚層細胞,見圖1C。誘導的眼表外胚層細胞高表達PAX6、p63、K18、K8,而在神經外胚層細胞高表達PAX6,表面外胚層細胞高表達p63、K18、K8(圖1B、D)。相對定量的qRT-PCR結果顯示與免疫熒光染色的結果相一致(圖1E)。選取一些眼表外胚層標記物,包括KRT8、KRT18、KRT19、PAX6、TP63、CDH1、TFAP2A、FOXC1,繪制成熱圖,見圖1F。

圖1 hES細胞誘導分化及特異性標記物鑒定圖 A:hES細胞在角膜分化培養基分化后顯微鏡下照相; B:對分化的多胚層細胞團進行神經細胞標志物PAX6(紅色)和角膜上皮發育相關標志物p63(綠色)、K18(紅色)和 K8(綠色)的免疫熒光染色結果。細胞核藍色;C:顯微鏡觀察定向分化的SE細胞;D:對SE細胞進行神經細胞標志物PAX6(紅色)和角膜上皮發育相關標志物p63(綠色)、K18(紅色)和K8(綠色)的免疫熒光染色;E:以 hES 為對照組,OSE和SE細胞中TP63、PAX6、KRT8、KRT18基因的表達情況;F:常見眼表外胚層標記物基因熱圖。

2.2DEGs分析對眼表外胚層與表面外胚層之間的RNA-Seq數據進行了差異基因表達分析。相對于表面外胚層,眼表外胚層共有4 182個基因發生差異性表達,包含2 771個上調基因和1 411個下調基因(圖2A),Padj值<0.05。按log2(fold change)值大小排序,前100位差異基因見圖2B。

圖2 RNA-Seq數據分析圖 A:OSE與SE的 DEGs火山圖。紅色點代表上調,綠色點代表下調;B:OSE與SE的前100個差異基因熱圖;C:OSE與SE差異基因的GO功能富集的氣泡圖;D:OSE與SE差異基因的KEGG Pathway分析;E:OSE與SE差異基因的轉錄因子分析熱圖。

2.3GO和KEGG富集分析利用基因本體進行了GO分析。GO富集分析包括3個分支,即生物學過程 (biological process,BP)、細胞組分(cellular component,CC)和分子功能(molecular function,MF)。在GO-BP分析中,眼表外胚層上調的DEGs主要富集在離子跨膜轉運的調節(regulation of ion transmembrane transport)、軸突發育(axon development)、調節化學突觸傳遞(modulation of chemical synaptic transmission)等相關生物學過程,下調的DEGs主要富集在核分裂(nuclear division)、染色體分離(chromosome segregation)、細胞周期相變的調控(regulation of cell cycle phase transition)等生物學過程。在GO-CC分析中,眼表外胚層細胞上調的DEGs多定位在神經元細胞體(neuronal cell body)、含膠原蛋白的細胞外基質(collagen-containing extracellular matrix)、突觸膜(synaptic membrane)等細胞結構中,下調DEGs主要定位在染色質區域(chromosomal region)、轉軸(spindle)、濃縮染色質(condensed chromosome)等細胞結構中。在GO-MF分析中,眼表外胚層細胞上調的DEGs富集于信號受體調節活動(signaling receptor regulator activity)、信號受體激活劑活性(signaling receptor activator activity)、受體配體活性(receptor ligand activity)等分子功能,而下調的DEGs則更多地富集于微管蛋白結合(tubulin binding)、微管結合(microtubule binding)、細胞骨架運動活性(cytoskeletal motor activity)等分子功能(圖2C)。在KEGG分析中,我們篩選了DEGs富集的20條通路(上調10條、下調10條),其中可卡因成癮(cocaine addiction)、軸突導向(axon guidance)、苯丙胺成癮(amphetamine addiction)、cAMP 信號(cAMP signaling pathway)等信號通路顯著上調,癌癥中的蛋白聚糖(proteoglycans in cancer)、ECM-受體相互作用(ECM-receptor interaction)、蛋白質消化和吸收(protein digestion and absorption)、細胞因子-細胞因子受體相互作用(cytokine-cytokine receptor interaction)等信號通路顯著下調(圖2D)。

2.4轉錄因子分析轉錄因子通過調控其他基因的表達在細胞表型決定及生物學功能中發揮關鍵調控作用。因此進一步分析了眼表外胚層和表面外胚層的差異轉錄因子,共篩選了284個轉錄因子。FOS、EGR1、POU5F1、SOX2以及PAX6等204核心轉錄因子在眼表外胚層中高表達,HAND2、HOXB6、HOXB5、HOXA5以及HOXB8等80個核心轉錄因子在表面外胚層中高表達。在眼表外胚層高表達轉錄因子中,FOS表達差異最大。圖2E展示了眼表外胚層細胞相對于表面外胚層細胞表達上調及下調的前25位轉錄因子。

2.5PPI網絡構建和模塊分析將|log2(fold change)|>2的DEGs輸入STRING數據庫以獲取蛋白互作信息,并進一步利用Cytoscape軟件進行可視化分析,分別篩選出前6個Degree值最大的DEGs蛋白,見圖3A。利用Ctoscape Mcode插件篩選DEGs相關功能模塊基因(包含33個上調功能模塊基因、13個下調功能模塊基因),見圖3B。發現上調功能模塊基因在趨化作用(chemotaxis、taxis)、MAPK級聯的正向調節(positive regulation of MAPK cascade)等生物過程中顯著富集(圖3C),富集于1型糖尿病(type I diabetes mellitus)、炎癥性腸病(inflammatory bowel disease)等信號通路(圖3D)。

圖3 PPI分析及功能模塊分析圖 A:PPI網絡圖(差異表達基因之間的蛋白相互作用網絡, 左為上調,右為下調); B:功能基因模塊(左為上調,右為下調);C:上調功能模塊基因GO-BP功能富集的氣泡圖(前十位);D:上調功能模塊基因KEGG Pathway分析圖(前五位)。

2.6Hub基因的選擇與分析通過插件cytoHubba的7種算法,在眼表外胚層細胞上調和下調差異基因中分別計算出了排名前30的Hub基因(表2、3)。用venny進行交集后,我們發現了6個常見的上調Hub基因,包括FOS、IL1B、SOX2、IL6、JUN、MMP9,以及9個常見的下調Hub基因,包括COL1A1、POSTN、LUM、PDGFRA、VCAM1、IGF1、FGF10、ENG、BDNF。基于GeneMANIA數據庫,我們分析了這些基因的共表達網絡和相關功能,其中上調Hub基因物理相互作用為48.20%、共表達為26.40%、預測為23.35%、共定位為1.20%、途徑為0.85%,下調Hub基因共表達為86.58%、共定位為9.19%、途徑為2.31%、共享蛋白質結構域為1.92%,但未富集到已知的生物學功能(圖4A)。

圖4 Hub基因鑒定及TF-gene、TF-miRNA信號調控網絡圖 A:通過GeneMANIA分析Hub基因及其共表達基因圖;B:TF-gene相互作用和TF-miRNA共同調控網絡(左側為上調基因,右側為下調基因)。紅色節點代表Hub基因,藍色節點代表 TF; C:Venny圖(OSE高表達TF與上調Hub基因互作TF取交集,篩選共表達TF);D:共表達TF熱圖;E:TF-miRNA 共同調控網絡(左側為上調,右側為下調)。

表2 cytoHubba 中上調DEGs前 30 個 Hub 基因排名

表3 cytoHubba 中下調DEGs前 30 個 Hub 基因排名

2.7TF-gene相互作用和TF-miRNA共同調控網絡基于NetworkAnalyst數據庫預測可與Hub基因相互作用的轉錄因子,設置最小網絡數,然后使用Cytoscape對結果進行可視化(圖4B)。上調網絡包括150 個節點和 164個邊, 其中受轉錄因子調節最多的基因是JUN,共有73個轉錄因子參與調控轉錄過程。隨后,我們利用Venny將眼表外胚層高表達TF與上調Hub基因互作TF取交集,篩選出23個共表達TF(圖4C),并制成熱圖見圖4D。下調網絡包括69個節點和72個邊,其中受轉錄因子調節最多的基因是COL1A1,共有21個轉錄因子參與調控轉錄過程。此外,我們還使用NetworkAnalyst構建了TF-miRNA共調控網絡,該網絡預測了miRNA、TF和Hub基因之間的相互作用,設置最小網絡數,最終篩選出由11個節點和24個邊組成的上調網絡圖及由24個節點和40個邊組成的下調網絡圖(圖4E)。

3 討論

眼表外胚層屬于表面外胚層,其發育過程中受到表面外胚層發育調控信號和來自神經外胚層調控信號的雙重調控。研究發現,眼表外胚層除了表達表面外胚層重要轉錄因子TP63外,還高表達神經外胚層核心轉錄因子PAX6[4],而角結膜上皮也與表面外胚層來源的皮膚表現出不同的表型[8]。近年來已有研究闡明了表面外胚層發育調控機制,而眼表外胚層和角結膜上皮發育調控機制仍不明確[3, 5]。

隨著干細胞及眼發育領域研究的深入,人胚胎干細胞和誘導的多能干細胞(human induced pluripotent stem cells,hiPSCs)已被廣泛應用于眼部器官發育的研究,其在眼部發育調控機制及遺傳性眼病治療方案的開發中發揮重要作用[9-11]。轉錄組測序是一種高通量測序技術,能夠全面、快速地篩選差異表達基因,研究特定組織的基因表達情況,目前已成為疾病及胚胎發育機理研究不可或缺的技術手段。本研究通過對眼表外胚層和表面外胚層轉錄組數據進行分析,共篩選出4 182個DEGs, 包含2 771個上調基因和1 411個下調基因。從轉錄組水平闡明了眼表外胚層的轉錄組特征,明確了眼表外胚層細胞高表達的基因及信號通路。轉錄因子在決定細胞表型及命運中發揮關鍵用。既往研究發現神經細胞核心轉錄因子PAX6 通過促進角膜上皮標記物K3、K12等基因的表達決定角膜上皮細胞命運[12]。此外,FOS家族的成員(cFos、Fra-1、Fra-2及 FosB)與JUN家族(c-Jun、JunB和JunD)可以結合形成異二聚體AP1因子,參與調節角膜上皮細胞的分化及維持細胞穩態[13-14],在差異基因分析中,我們發現PAX6和FOS高表達于眼表外胚層細胞。據此,我們推測PAX6、FOS可能參與眼表外胚層發育調控,但其具體作用及機制仍需進一步研究。以往研究還發現神經細胞及干細胞標志物及重要轉錄因子SOX2在角膜上皮前體細胞中與p63共表達,參與角膜上皮細胞分化調控[15]。在本研究中,我們發現眼表外胚層細胞SOX2表達明顯高于表面外胚層,這與以往研究結果相一致。另外,在眼表外胚層相對于表面外胚層高表達DEGs中,PRDM14表達量最大,以往研究發現PRDM14能夠維持干細胞干性和多能性[16],但其在眼表外胚層中的作用尚未見報道,仍待進一步研究。

本研究還篩選了決定眼表外胚層和表面外胚層差異的Hub基因,共篩選出了6個上調的Hub基因,包括FOS、IL1B、SOX2、IL6、JUN、MMP9,9個下調Hub基因,包括COL1A1、POSTN、LUM、PDGFRA、VCAM1、IGF1、FGF10、ENG、BDNF。除FOS、JUN、SOX2外,上調 Hub基因IL1B、IL6、MMP9在外傷、炎癥方面的研究較為深入,既往文獻中提到它們參與角膜上皮損傷愈合過程,而其在角膜上皮發育中的作用尚未見報道[17-19]。此外,以往研究發現下調Hub基因多參與上皮細胞-間充質轉化過程,在癌癥轉移和多種纖維化疾病中發揮了重要作用[20-21]。

GO分析結果顯示,眼表外胚層細胞上調基因主要與神經發育、神經信號轉導相關,下調的DEGs主要與細胞增殖過程相關。在KEGG分析中,我們發現眼表外胚層上調DEGs富集在軸突導向(axon guidance)、神經活性配體-受體相互作用(neuroactive ligand-receptor interaction)、cAMP信號(cAMP signaling pathway)通路等。有學者研究發現小鼠Gpr48基因缺失通過cAMP信號通路導致角膜上皮細胞增殖和分化不良[22],表明cAMP信號通路在角膜上皮發育中發揮調控作用。眼表外胚層下調差異基因主要富集在癌癥中的蛋白聚糖(proteoglycans in cancer)、ECM-受體相互作用(ECM-receptor interaction)、蛋白質消化和吸收(protein digestion and absorption)等信號通路。既往研究表明,下調通路參與調節上皮細胞-間充質轉化過程,與下調Hub基因功能基本相符,但它們在眼表外胚層發育中的調控機制尚未得到研究[21, 23]。

miRNA是基因表達的關鍵調節因子,具有通過抑制信使RNA(mRNA)翻譯或促進mRNA降解的作用,在轉錄后水平調節基因表達。本研究中我們利用Hub基因構建了TF-miRNA共同調控網絡,在上調網絡中篩選出1個高相關miRNA,即has-miR-21。Kalaimani等[24]已在角膜緣干細胞中發現has-miR-21-5p高表達,該miRNA可能在角膜上皮細胞再生中發揮作用,但其在角膜上皮發育及再生中的具體通路尚未闡明。在下調網絡中,我們篩選出4個高相關miRNA,即has-miR-586、has-miR-301、has-miR-181a、has-miR-30e。目前,下調網絡中miRNA的研究多見于腫瘤細胞中,它們通過促進細胞增殖和轉移來發揮致癌基因的作用,但在眼表外胚層及表面外胚層發育中的作用仍尚不清楚[25-27]。

綜上所述,本研究通過轉錄組測序分析了人胚胎干細胞來源的眼表外胚層和表面外胚層轉錄組表達差異,篩選了眼表外胚層和表面外胚層差異基因富集的GO terms及信號通路,并篩選了決定這種表型差異的Hub基因以及相關的信號調控網絡。這可為眼表外胚層及角結膜上皮發育調控機制研究及角膜上皮相關遺傳性疾病的防治提供理論參考。我們將在以后的研究中進一步探索二者的差異基因及相關信號通路在眼表外胚層和表面外胚層發育調控中的作用,力爭闡明眼表外胚層發育調控信號網絡。