二氫青蒿素結合SERCA2b誘導結腸癌HCT-116細胞凋亡的機制研究

孫盧浩然，盧敏

（中國醫科大學附屬第一醫院 1.泌尿外科；2.肛腸外科，沈陽 110001）

結腸癌是一種常見的惡性腫瘤，死亡率較高［1-2］。常規化療藥物耐藥是結腸癌預后差的重要原因［3-4］。二氫青蒿素（dihydroartemisinin，DHA）對多種惡性腫瘤具有抗腫瘤作用［5-8］。前期研究［9］證實，DHA可通過內質網凋亡途徑誘導結腸癌HCT-116細胞凋亡，肌漿/內質網鈣 ATP 酶（sarcoplasmic/endoplasmic reticulum calcium ATPase，SERCA）2b活性下降，但其具體機制尚不明確。SERCA在維持Ca2+穩態中起關鍵作用，并可通過下游多個通路誘導細胞凋亡，其抑制與否對細胞的生死決策有重要的影響［10］。多種天然藥物提取物抗癌作用的靶點也被證實為SERCA，如金絲桃素［11］、姜黃素［12］等。DHA亦可調控細胞內質網和細胞質Ca2+失衡，引起內質網應激反應誘導細胞凋亡［13-14］，因此，DHA可能也是通過作用于SERCA，誘導結腸癌細胞凋亡，具體機制有待闡明。本研究首次采用LeDock分子對接方法及生物膜干涉技術，預測并證實DHA與SERCA2b的結合及其結合位點，揭示了DHA通過線粒體途徑誘導結腸癌HCT-116細胞凋亡。

1 材料與方法

1.1 細胞及處理

人結腸癌細胞HCT-116購自中國科學院上海細胞庫。用含10%胎牛血清（美國Hyclone公司）、1%青鏈霉素的McCoy’s 5A培養基（美國Gibco公司），在37℃、5%CO2培養箱中培養。常規換液、傳代。當細胞生長至80%～90%，分別加入不同濃度（10、20、40 μmol/L）DHA處理，并設置DMSO處理的對照組。

1.2 方法

1.2.1 SERCA活性檢測：通過差速離心提取微粒體蛋白質。用BCA試劑盒（上海碧云天生物技術有限公司）測定蛋白濃度，根據SERCA活性檢測試劑盒（南京建成生物工程研究所）說明書檢測SERCA活性，1 h后酶標儀讀取600 nm光密度值。每個點重復檢測3次。SERCA活性以每毫克微粒體蛋白每小時產生無機磷酸鹽的量表示。

1.2.2 Western blotting檢測：通過細胞裂解液（上海碧云天生物技術有限公司）裂解提取總蛋白，BCA試劑盒檢測蛋白濃度，上等量蛋白樣品行SDSPAGE凝膠電泳，電轉移至PVDF膜（美國Millipore公司）。室溫條件下，用5%脫脂牛奶封閉PVDF膜1 h，加入小鼠SERCA2單克隆抗體（sc-376235，美國Santa Cruz Biotechnology公司）4℃孵育過夜。洗膜后，用二抗辣根過氧化物酶標記的抗鼠IgG抗體37℃孵育45 min。采用ECL試劑盒（美國Millipore公司）顯像。β-actin和COX-Ⅳ作內參照。

1.2.3 流式細胞儀檢測：按照Annexin V-FITC/PI細胞凋亡檢測試劑盒（江蘇凱基生物技術股份有限公司）說明書檢測。分別將HCT-116細胞培養于含0、10、20、40 μmol/L DHA的培養基中24 h。用胰酶消化細胞，待細胞變圓脫落后，加入完全培養基終止消化，PBS洗滌2次，并進行細胞計數。加入500 μL Binding buffer重懸細胞，加入5 μL Annexin V-FITC、10 μL PI混勻，室溫避光反應15 min。行流式細胞儀檢測，通過FL1檢測Annexin V-FITC，FL2檢測PI。

1.2.4 細胞增殖檢測：用CCK-8檢測試劑盒分析細胞增殖情況。將細胞按2×104/孔接種至96孔板中，分別用不同濃度DHA（10、20、40 μmol/L）處理。每孔加入 CCK-8試劑10 μL，37℃孵育1 h。用酶標儀檢測450 nm處吸光度值。

1.2.5 Hoechst核染色：將細胞接種至12孔板，待生長至亞融合狀態后，用10、20、40 μmol/L DHA處理，37℃培養24 h后，用Hoechst33342染色，熒光顯微鏡下觀測細胞凋亡。

1.2.6 線粒體膜電位檢測：在0～6 h時分別用40 μmol/L DHA處理HCT-116細胞，然后用1 mg/mL JC-1探針（江蘇凱基生物技術股份有限公司）37℃避光孵育15 min。細胞洗滌后，通過IX73顯微鏡觀察。通過流式細胞儀在530 nm（FL1通道）和590 nm（FL2通道）檢測熒光強度，通過紅色熒光（FL2通道）與綠色熒光（FL1通道）的比值計算線粒體膜電位（ΔΨ）。

1.2.7 DHA與SERCA2b相互作用位點的預測：根據PDB數據庫（https：//www.rcsb.org/）信息，蛋白質SERCA2b的PDB ID為6LN6。使用LeDock軟件（http：//www.lephar.com/index.htm）進行互作位點預測。每個結合位點生成100個構象，以RMSD=1.0 ?進行聚類，其他參數默認設置。對接結果選擇結合能最低的構象，然后選擇結合能最低的構象，用PLIP和PyMOL進行結合位點的分析。

1.2.8 SERCA2b（314-756aa）野生型及突變體的重組蛋白表達：為了達到位點研究的目的，對預測的位點進行突變，將SERCA2b（314-756aa）突變體的氨基酸Ile315和Thr316突變為對蛋白功能及結構影響較小的丙氨酸［8］。為成功表達SERCA2b（314-756aa）野生型及突變體蛋白，利用基因合成技術合成了SERCA2b（314-756aa）野生型及突變體基因，插入his標簽，將2段基因分別連接到pET30a表達載體。利用大腸桿菌表達體系對2種蛋白分別進行表達。表達成功后，利用鎳柱對2種重組蛋白進行純化。對純化后的蛋白進行復性，并進行SDS-PAGE檢測，確定其濃度和純度。

1.2.9 SERCA2b（314-756aa）野生型及突變體與DHA結合的檢測：利用生物膜干涉技術分別檢測SERCA2b（314-756aa）野生型及突變體與DHA之間的結合。擬合模型選擇1∶1，即1個重組蛋白結合1個小分子DHA，擬合方式global，即把5個濃度作為1組關聯進行分析。

1.3 統計學分析

采用Data Analysis software 9.0進行統計學分析，計量資料用±s表示，采用Student’st檢驗比較組間差異。P＜0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 DHA抑制SERCA活性的同時降低SERCA2蛋白的表達水平

用不同濃度DHA（0、10、20、40 μmol/L）處理HCT-116細胞24 h，結果顯示，細胞中SERCA活性減弱（圖1A）；Western blotting結果顯示，0、10、20 μmol/L DHA不影響SERCA2蛋白表達，而40 μmol/L DHA明顯抑制了SERCA2蛋白表達（圖1B）。提示高濃度DHA可影響HCT-116細胞中SERCA2蛋白的表達。

A，SERCA activity is determined by the amount of inorganic phosphate produced per hour per milligram of microsomal protein；B，Western blotting measured SERCA2 protein levels and quantified them by density values，β-actin as an internal reference，and the data were expressed as ±s deviation of three independent replicates.*P＜0.05 vs.0 μmol·L-1 DHA.圖1 DHA抑制HCT-116細胞SERCA活性及其蛋白表達水平Fig.1 DHA inhibits SERCA activity and reduces the expression of SERCA2 protein in HCT-116 cells

2.2 DHA通過抑制SERCA活性抑制HCT-116細胞增殖

CCK-8檢測結果顯示，DHA處理48～72 h后，HCT-116細胞增殖活性顯著降低，并呈劑量相關性（P＜0.01）（圖2A）。Hoechst核染色顯示，與對照組相比，DHA誘導HCT-116細胞膜通透性增加，細胞核變圓、固縮，染色質凝縮，即出現凋亡細胞特征（圖2B）。

A，after exposed to progressively increasing concentrations（0，10，20，40 μmol/L）of DHA，HCT-116 cell viability was assessed using CCK-8.*P＜0.01 vs.0 μmol/L DHA after 48 h treatment，**P＜0.01 vs.0 μmol/L DHA after 72 h treatment；B，after co-incubating HCT116 cells with different concentrations of DHA for 24 h，Hoechst 33342 staining was performed and observed by fluorescence microscopy to detect apoptosis（×10）.Arrows indicate apoptotic cells.圖2 DHA誘導的抗增殖及促凋亡作用Fig.2 DHA-induced antiproliferative and pro-apoptosis effects

2.3 DHA誘導細胞線粒體膜電位降低

JC-1的單體形式發綠色熒光，而在膜極化的線粒體中形成聚合體（即線粒體膜電位增加），并發紅色熒光。用DHA處理HCT-116細胞，隨著時間推移，細胞內紅色熒光消失（圖3A），提示線粒體膜電位下降。流式細胞分析結果顯示，在DHA處理的最初數小時內，線粒體膜電位稍下降，而在5 h后，超過半數細胞線粒體膜電位明顯下降（圖3B）。

A，fluorescence microscopy（×10）；B，analysis of results，data expressed as ±s deviation of three independent replicates.*P＜0.05，**P＜0.01，compared with 0 h.圖3 DHA誘導線粒體膜電位下降Fig.3 DHA-induced decrease in mitochondrial membrane potential

2.4 SERCA2b與DHA相互作用位點的預測

通過軟件對最小結合能構象進行分析，發現DHA與SERCA2b的Arg246、Gln250、Thr316形成氫鍵相互作用，與Glu58、Asp59、Pro312和Ile315有疏水相互作用。預測DHA和SERCA之間的結合模式見圖4。

圖4 DHA和SERCA之間結合模式的預測Fig.4 Predicted binding patterns between dihydroartemisinin and SERCA

2.5 SERCA2b（314-756aa）野生型及突變體的重組蛋白表達

用最大的非跨膜相aa314-756對SERCA2b蛋白進行相互作用位點研究，結果顯示，SERCA2b（314-756aa）包含了Thr316和Ile315這2個結合位點，因此，以Thr316和Ile315為預測結合位點進行突變研究。在SERCA2b（314-756aa）的突變體中，為了避免干擾蛋白質結構，將Thr316和Ile315突變成為丙氨酸（圖5）。

M，marker；1，SERCA2b（314-756aa）wild-type protein recombinant protein；2，SERCA2b（314-756aa）mutant recombinant protein.圖5 蛋白質質量表達純化凝膠圖Fig.5 Protein mass expression purification gel diagram

2.6 SERCA2b（314-756aa）野生型及突變體與DHA之間的結合檢測結果

首先，檢測SERCA2b（314-756aa）野生型與DHA之間的結合。結果如圖6A所示，隨著分析物濃度的增加，結果相應增加，即呈顯著正相關，表明SERCA2b（314-756aa）野生型蛋白和小分子DHA之間存在相互作用。然后，檢測了SERCA2b（314-756aa）突變體與DHA之間的結合。結果如圖6B所示，隨著分析物濃度的增加，結果未顯示相關性，意味著SERCA2b（314-756aa）突變體蛋白和小分子DHA之間無相互作用。證明Thr316和Ile315有可能是SERCA2b（314-756aa）與小分子DHA之間相互結合的關鍵性氨基酸位點。

A，interaction between wild-type SERCA2b and dihydroartemisinin；B，interaction between mutant SERCA2b and dihydroartemisinin.圖6 SERCA2b和DHA之間的相互作用Fig.6 Interaction between SERCA2b and dihydroartemisinin

3 討論

DHA可抑制多種腫瘤細胞的增殖，促進細胞凋亡。研究［9］表明，DHA可抑制SERCA2b，導致腫瘤細胞內質網中Ca2+紊亂，從而通過內質網、線粒體、死亡受體等多種途徑誘導細胞凋亡。

為探討DHA在HCT-116細胞線粒體途徑凋亡中的作用，本研究首先使用流式細胞儀檢測DHA處理后HCT-116細胞的凋亡情況，并通過Western blotting檢測SERCA2b蛋白的表達。結果發現，DHA抑制了SERCA2b活性并降低了SERCA2b蛋白的表達水平，促進了HCT-116細胞凋亡，且與濃度呈正相關。

為了闡明線粒體參與DHA誘導的結腸癌細胞凋亡機制，本研究檢測了DHA處理后線粒體膜電位的變化，發現DHA作用細胞5 h時線粒體膜電位急劇下降。說明線粒體功能障礙是DHA誘導結腸癌細胞凋亡的機制之一。DHA誘導的線粒體膜電位降低發生在DHA暴露后相對較早的時期。本研究還發現線粒體功能紊亂在DHA促進HCT-116細胞的凋亡中起關鍵作用。線粒體通路是典型的細胞凋亡通路。線粒體膜電位喪失導致細胞色素c從線粒體內釋放至細胞質中，激活caspase-8和caspase-9，進而激活細胞凋亡的執行者caspase-3［15］。前期研究［16］發現，DHA可能導致HCT-116細胞線粒體膜電位崩潰，釋放細胞色素c，增加Bax/Bcl2比率，激活caspas-3、caspas-8和caspas-9，證明線粒體參與了DHA誘導的結腸癌細胞的凋亡。

SERCA包含3種亞型，通過水解ATP，將細胞質中Ca2+轉移至內質網腔內［17］。結腸癌細胞調控Ca2+平衡的主要是SERCA2b。SERCA2b是一種多跨膜蛋白，很難在體外表達［6］，這也限制了DHA與SERCA具體結合位點的研究。為進一步確定DHA調控SERCA2b活性的靶點，本研究選取SERCA2b最長的一段Topological domain（314-756aa），該段屬于細胞質區域。首先，應用生物膜干涉技術［7］檢測并確認了SERCA2b和DHA間的結合。其次，應用LeDock分子對接方法預測DHA與SERCA 的結合位點［8，12］，發現處于314-756aa段的Ile315和Thr316是可能的結合位點。進一步對Ile315和Thr316進行丙氨酸位點突變并表達突變蛋白，再次通過Octet 平臺基于生物膜干涉技術［9-11］，對合成的Ile315與Thr316位點突變后的SERCA2b突變蛋白和非突變蛋白分別與小分子DHA進行結合檢測，結果證實突變型SERCA2b與DHA之間無相互作用，提示DHA可與SERCA2b的Ile315和Thr316位點直接結合。

綜上所述，本研究結果顯示，DHA可直接結合SERCA2b的Ile315和Thr316位點，通過增加HCT-116細胞內Ca2+濃度，導致Ca2+紊亂，繼而通過線粒體途徑誘導細胞凋亡。未來將嘗試合成SERCA2b全蛋白，并進一步明確SERCA2b與DHA的全部結合位點及其上下游調控機制，以期為DHA抗腫瘤研究提供新思路，開辟新途徑。