褪黑素對(duì)人腹膜間皮細(xì)胞上皮-間質(zhì)轉(zhuǎn)化的作用及機(jī)制

劉珊，張明霞，劉倫志

（湖北民族大學(xué)附屬民大醫(yī)院腎內(nèi)科，湖北省腎臟病臨床醫(yī)學(xué)研究中心，湖北 恩施 445000）

腹膜透析（peritoneal dialysis，PD）是終末期腎臟病（end-stage kidney disease，ESKD）的主要腎臟替代療法之一，目前全球約有11%的ESKD患者選擇PD［1］。PD液中的高糖、低pH值等多種因素可導(dǎo)致PD患者發(fā)生腹膜纖維化（peritoneal fibrosis，PF），PF是PD患者發(fā)生腹膜超濾衰竭及退出PD的重要原因［2］，因此，延緩PF對(duì)保證PD患者長(zhǎng)期有效透析至關(guān)重要。

轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子β（transforming growth factor-β，TGF-β）是腹膜上皮-間質(zhì)轉(zhuǎn)化（epithelial-mesenchymal transition，EMT）的關(guān)鍵誘導(dǎo)物，而EMT在PF的發(fā)生和進(jìn)展中起重要作用［3］。核心蛋白聚糖（decorin，DCN）的一個(gè)特定結(jié)構(gòu)域可與TGF-β結(jié)合，從而阻止TGF-β與其他受體結(jié)合［4］。在腹膜間皮細(xì)胞中，褪黑素能夠逆轉(zhuǎn)脂多糖（lipopolysaccharide，LPS）誘導(dǎo)的EMT過(guò)程［5］。本研究擬通過(guò)人腹膜間皮細(xì)胞HMrSV5明確褪黑素是否參與調(diào)控DCN，DCN是否是治療PF的潛在靶點(diǎn)，并探討其治療PF的可能機(jī)制，為相關(guān)臨床研究提供理論基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 細(xì)胞：人腹膜間皮細(xì)胞株HMrSV5由武漢大學(xué)生物典藏庫(kù)CCTCC提供。用含10%胎牛血清、青霉素（100 U/mL）、鏈霉素（100 g/mL）的DMEM/F12培養(yǎng)基培養(yǎng)。細(xì)胞密度達(dá)80%時(shí)進(jìn)行傳代。

1.1.2 質(zhì)粒構(gòu)建：DCN（human）-shRNA及DCN（NM-001920.5）過(guò)表達(dá)重組質(zhì)粒均由載基生物有限公司提供。

1.2 方法

1.2.1 分組：（1）正常對(duì)照組，不加任何處理；（2）TGF-β1組，采用TGF-β1誘導(dǎo)細(xì)胞；（3）TGF-β1+褪黑素組，TGF-β1對(duì)細(xì)胞進(jìn)行誘導(dǎo)后，利用褪黑素干預(yù)；（4）TGF-β1+褪黑素+siDCN組，對(duì)細(xì)胞進(jìn)行TGF-β1誘導(dǎo)后，采用褪黑素干預(yù)，并進(jìn)行DCN敲減質(zhì)粒轉(zhuǎn)染；（5）TGF-β1+褪黑素+siNC組，對(duì)細(xì)胞進(jìn)行TGF-β1誘導(dǎo)后，采用褪黑素干預(yù)，并進(jìn)行DCN空載質(zhì)粒轉(zhuǎn)染；（6）TGF-β1+DCN組，對(duì)細(xì)胞采用TGF-β1誘導(dǎo)后，進(jìn)行DCN過(guò)表達(dá)質(zhì)粒轉(zhuǎn)染。

1.2.2 質(zhì)粒轉(zhuǎn)染及藥物處理：用脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染試劑Lipofectamine?3000轉(zhuǎn)染DCN-shRNA和DCN過(guò)表達(dá)質(zhì)粒，并按照分組情況加入TGF-β1（10 ng/mL）和褪黑素（1 nmol/L）繼續(xù)培養(yǎng)24 h。

1.2.3 CCK-8檢測(cè)：消化并調(diào)整細(xì)胞濃度，接種于 96孔板并培養(yǎng)過(guò)夜。分別加入CCK-8（10 μL/孔）并孵育1.5 h，酶標(biāo)儀上測(cè)定吸光度值（OD450nm）。

1.2.4 Western blotting：加入含蛋白酶抑制劑的細(xì)胞裂解液提取總蛋白，100℃變性5 min；取等量蛋白行SDS-PAGE凝膠電泳分離，轉(zhuǎn)移至PVDF膜；5%BSA封閉1 h后，加入相應(yīng)的一抗，4℃孵育過(guò)夜；加入辣根過(guò)氧化物酶標(biāo)記的二抗，室溫孵育1.5 h；加入發(fā)光液后，凝膠成像儀進(jìn)行曝光拍照，統(tǒng)計(jì)灰度值并計(jì)算相對(duì)表達(dá)量。

1.2.5 實(shí)時(shí)PCR：氯仿、異丙醇法提取總RNA。瓊脂糖凝膠電泳分析 RNA 純度，分光光度計(jì)下測(cè)定RNA濃度。按照試劑盒（NovoScript?Plus All-in-one 1st Strand cDNA Synthesis SuperMix，中國(guó)諾沃蛋白科技有限公司）說(shuō)明書(shū)行逆轉(zhuǎn)錄獲得cDNA。根據(jù)試劑盒（NovoStart?SYBR qPCR SuperMix Plus，中國(guó)諾沃蛋白科技有限公司）說(shuō)明書(shū)配制實(shí)時(shí)熒光定量 PCR反應(yīng)體系，并對(duì)DCN、E-cadherin、TGF-β1、Smad2進(jìn)行PCR擴(kuò)增，引物序列見(jiàn)表1。用2-ΔΔCt法計(jì)算相對(duì)表達(dá)量。GAPDH作為內(nèi)參照。

表1 PCR引物序列Fig.1 Sequences of the PCR primers

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

各組實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次以上。采用GraphPad Prism5和SPSS 25.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行分析。正態(tài)分布的計(jì)量資料以±s表示，2組比較采用t檢驗(yàn)，多個(gè)實(shí)驗(yàn)組與對(duì)照組比較采用Dunnett檢驗(yàn)，兩兩比較采用單因素方差分析，在滿足方差齊性條件下采用LSD法兩兩比較。P＜0.05 為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 CCK-8實(shí)驗(yàn)結(jié)果

TGF-β1組細(xì)胞存活率低于其他各組，TGF-β1+褪黑素組與TGF-β1+DCN組細(xì)胞存活率高于TGF-β1+褪黑素+siDCN組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。見(jiàn)圖1。

*P＜0.05 vs.normal control group；#P＜0.05 vs.TGF-β1 group；△P＜0.05 vs.TGF-β1+melatonin+siDCN group.圖1 各組HMrSV5細(xì)胞CCK-8實(shí)驗(yàn)結(jié)果Fig.1 Results of CCK-8 experiment on HMrSV5 cells in each group

2.2 Wesrtern blotting結(jié)果

與正常對(duì)照組比較，TGF-β1組DCN和E-cadherin蛋白表達(dá)均下調(diào)，TGF-β1、Smad2蛋白表達(dá)均上調(diào)（P＜0.05）。與TGF-β1組比較，TGF-β1+褪黑素組、TGF-β1+褪黑素+siDCN組及TGF-β1+DCN組DCN和E-cadherin蛋白表達(dá)均上調(diào)，TGF-β1、Smad2蛋白均下調(diào)（P＜0.05）；且TGF-β1+褪黑素/DCN組較TGF-β1+褪黑素+siDCN組DCN和E-cadherin蛋白表達(dá)明顯上調(diào)，TGF-β1、Smad2蛋白表達(dá)明顯下調(diào)（P＜0.05）。見(jiàn)圖2。

1，normal control group；2，TGF-β1 group；3，TGF-β1+melatonin group；4，TGF-β1+melatonin+siDCN group；5，TGF-β1+melatonin+siNC group；6，TGF-β1+DCN group.*P＜0.05 vs.normal control group；#P＜0.05 vs.TGF-β1 group；△P＜0.05 vs.TGF-β1+melatonin+siDCN group.圖2 各組HMrSV5細(xì)胞DCN、E-cadherin、TGF-β1、Smad2 蛋白表達(dá)情況Fig.2 Expression of DCN，E-cadherin，TGF-β1，and Smad2 protein in HMrSV5 cells of each group

2.3 實(shí)時(shí)PCR結(jié)果

驗(yàn)證已構(gòu)建DCN過(guò)表達(dá)質(zhì)粒和篩選敲減質(zhì)粒，分別確定為DCN（NM-001920.5）與DCN（human）-shRNA2（圖3）。與正常對(duì)照組比較，TGF-β1組DCN、E-cadherinmRNA表達(dá)下調(diào)，TGF-β1、Smad2mRNA表達(dá)上調(diào)（均P＜0.05）。與TGF-β1組對(duì)比，TGF-β1+褪黑素或DCN組DCN、E-cadherinmRNA表達(dá)上調(diào)，TGF-β1、Smad2mRNA表達(dá)下調(diào)（均P＜0.05）；且TGF-β1+褪黑素組與TGF-β1+DCN組較TGF-β1+褪黑素+siDCN組DCN、E-cadherinmRNA表達(dá)明顯上調(diào)，TGF-β1、Smad2mRNA表達(dá)明顯下調(diào)（均P＜0.05）。見(jiàn)圖4。

A，DCN（human）-shRNA screening.*P＜0.05，DCN（human）-shRNA2 group vs.blank control group，interference control group，DCN（human）-shRNA1 group，DCN（human）-shRNA3 group；B，verification of DCN overexpression plasmid.*P＜0.05，DCN（NM-001920.5）group vs.blank control group or overexpression group.圖3 DCN（human）-shRNA篩選及DCN過(guò)表達(dá)質(zhì)粒驗(yàn)證Fig.3 DCN（human）-shRNA screening and verification of DCN overexpression plasmid

3 討論

ESKD腎臟替代治療中，由于腎移植資源有限，故患者被迫選擇血液透析或PD。延緩PF是維持PD的重要保障，而抑制TGF-β活化是防治PF的關(guān)鍵。研究［6］表明，褪黑素能靶向TGF-β信號(hào)軸發(fā)揮抗纖維化作用，而其是否能調(diào)控PF及其作用機(jī)制尚缺乏有效的實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)。本研究通過(guò)藥物、靶點(diǎn)、通路的有機(jī)結(jié)合，進(jìn)一步研究了褪黑素對(duì)纖維化環(huán)境中人腹膜間皮細(xì)胞的作用及其機(jī)制。

褪黑素是人松果體分泌的主要激素，具有水溶性和脂溶性，可高效透過(guò)各種生物膜發(fā)揮抗氧化、抗凋亡和細(xì)胞保護(hù)等作用。褪黑素可減輕非酒精性脂肪肝小鼠肝臟炎癥反應(yīng)、球囊化和纖維化［7］；在腹膜間皮細(xì)胞中，褪黑素能逆轉(zhuǎn)LPS誘導(dǎo)的EMT過(guò)程［5］。本研究結(jié)果顯示，褪黑素可使TGF-β1誘導(dǎo)的HMrSV5細(xì)胞存活率明顯提高，且明顯下調(diào)TGF-β1表達(dá)，上調(diào)E-cadherin表達(dá)，提示褪黑素可抑制纖維化環(huán)境中HMrSV5細(xì)胞的TGF-β活化及EMT進(jìn)展。

DCN是富含亮氨酸的小分子蛋白多糖，普遍存在于細(xì)胞外基質(zhì)。DCN的某個(gè)特定結(jié)構(gòu)域可與TGF-β結(jié)合，從而阻止TGF-β與其他受體結(jié)合［4］。DCN作為生長(zhǎng)因子的負(fù)性調(diào)節(jié)劑，在維持內(nèi)環(huán)境穩(wěn)定、基質(zhì)形成、器官發(fā)育、細(xì)胞增殖分化過(guò)程中起重要作用［7］，并參與心臟、肝、骨骼肌、肺、腹膜等多種組織、器官纖維化的調(diào)控［8-13］。DCN可調(diào)控包括TGF-β在內(nèi)的多種生長(zhǎng)因子的生物利用度，從而改善PF。研究顯示，TGF-β1誘導(dǎo)的DCN基因沉默HMrSV5細(xì)胞被褪黑素處理后，可上調(diào)E-cadherin并下調(diào)TGF-β1、Smad2蛋白及mRNA表達(dá)；而TGF-β1誘導(dǎo)的HMrSV5細(xì)胞被褪黑素及DCN過(guò)表達(dá)處理后，比TGF-β1誘導(dǎo)的沉默DCN基因細(xì)胞DCN、E-cadherin蛋白及mRNA表達(dá)進(jìn)一步上調(diào)，TGF-β1、Smad2蛋白及基因表達(dá)進(jìn)一步下調(diào)。表明褪黑素可靶向激活DCN結(jié)合過(guò)度活化的TGF-β1，同時(shí)抑制Smad2信號(hào)通路，部分逆轉(zhuǎn)EMT，從而延緩PF。

綜上所述，本研究發(fā)現(xiàn)，褪黑素可通過(guò)調(diào)控DCN/TGF-β途徑抑制Smad2通路，改善纖維化環(huán)境中的人腹膜間皮細(xì)胞EMT，提高細(xì)胞存活率。以上結(jié)果為PF的預(yù)防及治療提供了新的靶點(diǎn)及干預(yù)思路。