circLRP6調節miR-31-5p/HMGA1軸對高糖誘導的腎小管上皮細胞損傷的影響

許崢嶸，任衛東，谷君，張志英，鄧文娟，左麗娟

（河北北方學院附屬第一醫院內分泌科，河北 張家口 075000）

糖尿病腎病（diabetic nephropathy，DN）是糖尿病控制不佳導致蛋白尿與腎小球濾過率進行性降低，是糖尿病的嚴重合并癥［1］。隨著社會的進步、飲食結構的改變，DN已成為我國終末期腎病的第2位原因。DN的發病機制是DN的研究重點，有助于臨床控制DN腎臟損傷。微RNA（mciroRNA，miRNA）可能通過影響腎小管上皮細胞的凋亡參與DN的發展［2］。研究［3］報道，miR-31-5p升高可抑制高糖誘導的人系膜細胞生長、炎癥、細胞外積累以及氧化應激。高遷移率族蛋白A1（high mobility group protein A1，HMGA1）在DN中發揮重要作用，可調節DN小鼠腎小管上皮-間充質轉化［4］。生物信息學分析顯示，miR-31-5p與HMGA1存在結合位點，miR-31-5p/HMGA1可能是調控DN的一個方向。環狀RNA（circular RNA，circRNA）主要通過與miRNA競爭性結合調控靶基因發揮作用，并參與DN的進展。circLRP6在DN中表達異常，且生物信息學分析顯示circLRP6與miR-31-5p存在結合位點。因此，本研究以高糖誘導的腎小管上皮細胞損傷模擬體內DN損傷，分析circLRP6對高糖誘導的腎小管上皮細胞損傷的影響，并分析其潛在機制。

1 材料與方法

1.1 細胞與主要試劑

人腎小管上皮細胞HK-2，購自美國ATCC細胞庫；白細胞介素-6（interleukin-6，IL-6）、腫瘤壞死因子-α（tumor necrosis factor-α，TNF-α）試劑盒，購自上海酶聯生物科技有限公司；丙二醛（malondialdehyde，MDA）、乳酸脫氫酶（lactate dehydrogenase，LDH）試劑盒，購自上海碧云天生物技術有限公司；HMGA1、Bax、Bcl-2、GAPDH兔抗、羊抗兔IgG二抗，購自英國Abcam公司。

1.2 實驗方法

1.2.1 分組：體外培養HK-2細胞，常規傳代，取對數生長期HK-2細胞，分為對照組、高糖組、高糖+si-NC組、高糖+si-circLRP6組、高糖+si-circLRP6+miR-NC組、高糖+si-circLRP6+miR-31-5p inhibitor組、高糖+si-circLRP6+miR-31-5p inhibitor+si-NC組、高糖+sicircLRP6+miR-31-5p inhibitor+si-HMGA1組。對照組置于含5.5 mmol/L葡萄糖的DMEM培養基內培養，其余各組置于含25 mmol/L葡萄糖的DMEM培養基內培養，并通過Lipofectamine 2000將相應質粒轉染至HK-2細胞內，培養基內培養。

1.2.2 HK-2細胞circLRP6、miR-31-5p、HMGA1mRNA水平檢測：采用TRIzol法提取各組細胞中總RNA，反轉錄后進行cDNA擴增，程序設定為95℃，30 s（預變性）；95℃，5 s（變性），55℃，10 s（退火），72℃，15 s（延伸），共40個循環。采用2-ΔΔCt法分析circLRP6、miR-31-5p、HMGA1mRNA表達情況，以GAPDH作為circLRP6、HMGA1mRNA的內參，以U6作為miR-31-5p的內參。引物序列：circLRP6，正向5’-CAAGATTGA GGCAGGCAGTG-3’，反向5’-GCTCCAGTCAGTCCA GTACA-3’；HMGA1，正向5’-ATGAACTCCGAAGGC CAGCC-3’，反向5’-CCTTCCTAGGTCTGCCTCTTG G-3’；GAPDH，正向5’-TGTTCGTCATGGGTGTGAA C-3’，反向5’-ATGGCATGGACTGTGGTCAT-3’；miR-31-5p，正向5’-CCCTCGAGACATTTGAAAGCCATTA GACT-3’，反向5’-GCGTCGACAGGTTGAGCGAGCG AAG-3’；U6，正向5’-TGCGGGTGCTCGCTTCGGCAG C-3’，反向5’-CCAGTGCAGGGTCCGAGGT-3’。

1.2.3 細胞上清液IL-6水平、TNF-α水平、LDH活性、MDA含量測定：收集各組細胞培養上清液，按照ELISA試劑盒說明書檢測IL-6、TNF-α水平；硫代巴比妥酸法檢測MDA含量；LDH試劑盒檢測LDH活性。

1.2.4 細胞凋亡率的測定：收集各組細胞，胰酶消化后，以5×105/mL的濃度重懸于500 μL 1×膜聯蛋白結合緩沖液中，加入Annexin V-FITC（5 μL）和碘化丙啶（10 μL）避光孵育15 min，流式細胞儀觀察細胞凋亡情況。

1.2.5 Western blotting檢測蛋白水平：用RIPA裂解液裂解各組HK-2細胞后，BCA法測定總蛋白濃度，SDS-PAGE分離并轉膜，脫脂牛奶封閉1 h后，加入兔抗GAPDH（1∶5 000）、HMGA1（1∶1 000）、Bax（1∶1 000）、Bcl-2（1∶1 000）一抗孵育（4℃）過夜，隔日加入羊抗兔二抗（1∶4 000）孵育2 h，用蛋白凝膠成像儀定量分析蛋白含量。

1.2.6 雙熒光素酶報告基因實驗：Starbase網站（https：//rnasysu.com/encori/）預測miR-31-5p與circ-LRP6、HMGA1的結合位點。構建circLRP6野生型（circLRP6 WT）和突變型質粒（circLRP6 MUT）以及HMGA1野生型（HMGA1 WT）和突變型質粒（HMGA1 MUT），分別與mimic NC、miR-31-5p mimic共轉染至HK-2細胞，分為mimic NC+circLRP6 WT組（circLRP6 WT與mimic NC共轉染）、miR-31-5p mimic+circLRP6 WT組（circLRP6 WT與miR-31-5p mimic共轉染）、mimic NC+circLRP6 MUT組（circLRP6 MUT與mimic NC共轉染）、miR-31-5p mimic+circLRP6 MUT組（circ-LRP6 MUT與miR-31-5p mimic共轉染）、mimic NC+HMGA1 WT組（HMGA1 WT與mimic NC共轉染）、miR-31-5p mimic+HMGA1 WT組（HMGA1 WT與miR-31-5p mimic共轉染）、mimic NC+HMGA1 MUT組（HMGA1 MUT與mimic NC共轉染）、miR-31-5p mimic+HMGA1 MUT組（HMGA1 MUT與miR-31-5p mimic共轉染），48 h后測定熒光素酶活性。實時定量PCR測定沉默si-circ-LRP6后circLRP6與miR-31-5p水平（si-NC組、si-circ-LRP6組），實時定量PCR和Western blotting測定miR-31-5p過表達對HMGA1mRNA和蛋白表達的影響（mimic NC組、miR-31-5p mimic組）。

1.3 統計學分析

采用SPSS 21.0軟件進行統計分析，計量資料用±s表示，2組間比較采用t檢驗，多組間比較采用單因素方差分析和SNK-q檢驗。P＜0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 circLRP6在高糖誘導的HK-2細胞中的表達

與對照組相比，高糖組HK-2細胞中circLRP6表達水平升高（1.01±0.09和1.97±0.21，P＜0.05）。

2.2 各組HK-2細胞增殖抑制率、炎性細胞因子水平、LDH活性和MDA含量的比較

與對照組相比，高糖組HK-2細胞增殖抑制率、細胞上清液IL-6水平、TNF-α水平、LDH活性、MDA含量均升高（P＜0.05）；與高糖組相比，高糖+si-circ-LRP6組HK-2細胞增殖抑制率、細胞上清液IL-6水平、TNF-α水平、LDH活性、MDA含量均降低（P＜0.05）；與高糖+si-circLRP6組相比，高糖+si-circLRP6+miR-31-5p inhibitor組HK-2細胞增殖抑制率、細胞上清液IL-6水平、TNF-α水平、LDH活性、MDA含量均升高（P＜0.05）；與高糖+si-circLRP6+miR-31-5p inhibitor組相比，高糖+si-circLRP6+miR-31-5p inhibitor+si-HMGA1組HK-2細胞增殖抑制率、細胞上清液IL-6水平、TNF-α水平、LDH活性、MDA含量均降低（P＜0.05），見表1。

表1 各組HK-2細胞增殖抑制率、LDH活性、IL-6和TNF-α水平以及MDA含量的比較Tab.1 Inhibition rate of HK-2 cell proliferation；lactate dehydrogenase（LDH）activity；interleukin（IL）-6 and tumor necrosis factor（TNF）-α levels；and malondialdehyde（MDA）content in each group

2.3 各組HK-2細胞凋亡情況

與對照組相比，高糖組HK-2細胞凋亡率、Bax蛋白表達升高，Bcl-2蛋白表達降低（P＜0.05）；與高糖組相比，高糖+si-circLRP6組HK-2細胞凋亡率、Bax蛋白表達降低，Bcl-2蛋白表達升高（P＜0.05）；與高糖+si-circLRP6組相比，高糖+si-circLRP6+miR-31-5p inhibitor組HK-2細胞凋亡率、Bax蛋白表達升高，Bcl-2蛋白表達降低（P＜0.05）；與高糖+si-circ-LRP6+miR-31-5p inhibitor組相比，高糖+si-circLRP6+miR-31-5p inhibitor+si-HMGA1組HK-2細胞凋亡率、Bax蛋白表達降低，Bcl-2蛋白表達升高（P＜0.05），見表2、圖1。

1，control group；2，high glucose group；3，high glucose+si-NC group；4，high glucose+si-circLRP6 group；5，high glucose+si-circLRP6+miR-NC group；6，high glucose+si-circLRP6+miR-31-5p inhibitor group；7，high glucose+si-circLRP6+miR-31-5p inhibitor+si-NC group；8，high glucose+si-circ-LRP6+miR-31-5p inhibitor+si-HMGA1 group.圖1 各組HK-2細胞中Bax和Bcl-2蛋白的表達情況Fig.1 Bax and Bcl-2 protein expression in HK-2 cells of each group

表2 各組HK-2細胞凋亡情況的比較Tab.2 Comparison of apoptosis of HK-2 cells in each group

2.4 miR-31-5p與circLRP6的靶向關系

Starbase網站預測顯示，miR-31-5p與circLRP6存在結合位點（圖2）。miR-31-5p mimic+circLRP6 WT組熒光素酶活性較mimic NC+circLRP6 WT組低（0.35±0.02和1.02±0.09，P＜0.05），mimic NC+circ-LRP6 MUT組與miR-31-5p mimic+circLRP6 MUT組比較，熒光素酶活性的差異無統計學意義（1.02±0.10和1.03±0.10，P＞0.05）。與si-NC組相比，circLRP6組circLRP6表達降低（0.33±0.04和1.01±0.12，P＜0.05），miR-31-5p表達升高（2.96±0.37和1.02±0.12，P＜0.05）。

圖2 Starbase網站預測miR-31-5p與circLRP6結合位點Fig.2 miR-31-5p and circLRP6 binding sites predicted by the Starbase website

2.5 miR-31-5p與HMGA1的靶向關系

Starbase網站預測顯示，miR-31-5p與HMGA1存在結合位點（圖3）。miR-31-5p mimic+HMGA1 WT組熒光素酶活性較mimic NC+HMGA1 WT組低（0.32±0.05和1.13±0.21，P＜0.05），mimic NC+HMGA1 MUT組與miR-31-5p mimic+HMGA1 MUT組比較，熒光素酶活性的差異無統計學意義（1.10±0.10和1.08±0.19，P＞0.05）。與mimic NC組相比，miR-31-5p mimic組HMGA1mRNA水平（0.40±0.05和1.01±0.12，P＜0.05）和蛋白表達水平（0.37±0.04和0.89±0.11，P＜0.05）降低。見圖4。

圖3 Starbase網站預測miR-31-5p與HMGA1結合位點Fig.3 miR-31-5p and HMGA1 binding sites predicted by the Starbase website

3 討論

DN與腎小管病變和腎功能損傷關系密切，腎小管上皮細胞丟失是腎小管病變的原因之一［5］。在糖尿病中，長期的高糖刺激會誘導腎小管上皮細胞損傷，導致腎功能障礙。用高糖處理腎小管上皮細胞能模擬體內高糖誘導的腎小管損傷環境［6］。本研究中，高糖處理后HK-2細胞的增殖抑制率、凋亡率升高，證明成功構建HK-2細胞損傷模型。

circRNA可作為miRNA海綿介導下游基因表達，參與DN的發生、發展。研究［7］報道，circLRP6在高糖誘導的系膜細胞中上調。本研究中，高糖誘導的HK-2細胞中circLRP6水平升高，下調circLRP6表達后，HK-2細胞的增殖抑制率、凋亡率降低，提示circ-LRP6可能為腎小管上皮細胞的有害因子，可能是DN治療的靶點之一。DN患者中腎小管上皮細胞損傷與炎癥和氧化應激有關。炎癥在DN的腎小管上皮細胞損傷中占據重要地位，IL-6、TNF-α等炎性因子的產生會進一步誘導細胞凋亡的發生。此外，細胞內氧自由基累積增加時會引發細胞膜脂質過氧化，細胞膜完整性被破壞，細胞內LDH等毒性物質流出，MDA作為脂質過氧化產物可反映細胞氧化應激損傷程度［8］。本研究中，circLRP6沉默可降低HK-2細胞上清液中IL-6、TNF-α、LDH、MDA水平，提示circ-LRP6沉默可能通過抑制氧化應激和炎癥反應，減輕高糖誘導的HK-2細胞損傷。

研究［9］顯示，miR-31-5p在DN患者體內表達降低。在高糖誘導的足細胞損傷模型中，miR-31-5p低表達［10］。此外，miR-31-5p在高糖誘導的系膜細胞損傷中低表達，上調miR-31-5p表達可抑制高糖誘導的系膜細胞增殖、炎癥和氧化應激［5］。以上研究表明，miR-31-5p在DN中發揮保護作用。本研究中，miR-31-5p抑制劑可減弱circLRP6沉默對高糖誘導的HK-2細胞損傷的保護作用，且雙熒光素酶報告基因實驗證實circLRP6與miR-31-5p存在靶向調控關系，提示circLRP6沉默可能通過上調miR-31-5p表達發揮對HK-2的保護作用。

HMGA1是廣泛分布于細胞核內的非組蛋白，廣泛調節DNA復制、轉錄、基因表達調控等［11-12］。研究［13］報道，HMGA1是胰島素受體基因的重要調節因子，也是2型糖尿病發展的危險因素，在鏈脲佐菌素誘導的糖尿病大鼠中，主動脈組織中HMGA1水平顯著上調和積累，在體外，高糖會增加HMGA1的表達并促進血管平滑肌細胞增殖。WU等［14］的研究顯示，HMGA1在糖尿病小鼠心臟和高糖刺激的心肌細胞中上調，其過表達加速了高糖誘導的心肌細胞炎癥和細胞凋亡，并加重了糖尿病小鼠心臟功能障礙，而HMGA1敲低可減輕心肌細胞對高糖誘導的炎癥和細胞凋亡的反應。在本研究中，雙熒光素酶報告基因實驗證實miR-31-5p與HMGA1存在靶向結合，且miR-31-5p過表達可顯著降低HMGA1mRNA和蛋白表達，提示circLRP6沉默可能通過miR-31-5p/HMGA1發揮對HK-2的保護作用。下調HMGA1表達恢復了miR-31-5p抑制劑對circLRP6沉默在高糖誘導的HK-2細胞損傷中的逆轉作用。

綜上所述，沉默circLRP6可能通過上調miR-31-5p、抑制HMGA1表達對高糖誘導的腎小管上皮細胞損傷發揮保護作用。本研究為DN藥物的研發及基因靶向治療提供了一定參考。但是，在高糖誘導的HK-2細胞損傷中circLRP6上調的分子機制尚不明確，有待后續進行進一步研究。