醒腦靜注射液“異病同治”急性腦梗死與急性腦出血作用機制的網絡藥理學研究

彭景 陳星 呂秋藝 宋蕾 鄒憶懷

摘要? 目的：采用網絡藥理學探討醒腦靜注射液“異病同治”急性腦梗死（ACI）與急性腦出血（ACH）的作用機制。方法：利用中藥系統(tǒng)藥理學數據庫及分析平臺（TCMSP）與中醫(yī)藥綜合數據庫（TCMID）獲得醒腦靜注射液的有效成分及其作用靶點，同時利用人類基因數據庫（GeneCards）、在線人類孟德爾遺傳數據庫（OMIM）、遺傳藥理學和藥物基因組學數據庫（PharmGkb）、治療目標數據庫（TTD）和藥物靶標數據庫（DrugBank）等數據庫獲取ACI和ACH潛在的基因靶點，在DIAGRAMS平臺內繪制共同靶點韋恩圖。采用Cytoscape 3.9軟件構建醒腦靜注射液“藥物-活性成分-潛在靶點”相互作用網絡圖。利用STRING構建蛋白-蛋白相互作用（PPI）網絡并進行拓撲分析。通過R/BioConductor對共同靶點進行基因本體（GO）及京都基因和基因組百科全書（KEGG）通路富集分析。結果：篩選共得到醒腦靜注射液藥物活性成分68種，對應靶點基因583個，ACI潛在靶點3 597個，ACH潛在靶點3 959個，三者共同靶點299個；PPI網絡核心蛋白包括血管內皮生成因子A（VEGFA）、JUN轉錄因子（JUN）、信號轉導與轉錄激活因子3（STAT3）、白細胞介素（IL）-6、腫瘤壞死因子（TNF）、清蛋白（ALB）、胱天蛋白酶 3（CASP3）、絲氨酸/蘇氨酸蛋白激酶 1（AKT1）、絲裂原活化蛋白激酶（MAPK）3、低氧誘導因子-1α（HIF-1α）、表皮生長因子受體（EGFR）、表皮生長因子（EGF）、前列腺素內過氧化物合酶2（PTGS2）、IL-1β、基質金屬蛋白酶-9（MMP-9）等；其主要生物學通路涉及脂質與動脈粥樣硬化、MAPK信號通路、流體剪切應力與動脈粥樣硬化、TNF信號通路、凋亡、IL-17信號通路等。結論：醒腦靜注射液通過抗氧化應激、抗炎癥反應、抗細胞凋亡和促血管生成等作用機制達到“異病同治”ACI和ACH的療效。

關鍵詞? 急性腦梗死；急性腦出血；醒腦靜注射液；網絡藥理學；異病同治

doi：10.12102/j.issn.1672-1349.2024.02.005

Mechanism of "Different Diseases with Same Treatment" with Xingnaojing Injection for the Treatment of Acute Cerebral Infarction and Acute Cerebral Hemorrhage Based on Network Pharmacology

PENG Jing， CHEN Xing， LYU Qiuyi， SONG Lei， ZOU Yihuai

Dongzhimen Hospital， Beijing University of Chinese Medicine， Beijing 100700， China; Beijing University of Chinese Medicine， Beijing 100029， China

Corresponding Author? ZOU Yihuai， E-mail： zouyihuai2004@163.com

Abstract? Objective：To explore the mechanism of "different diseases with same treatment" of Xingnaojing injection for? treating acute cerebral infarction（ACI） and acute cerebral hemorrhage（ACH） by network pharmacology.Methods：The effective components and the targets of Xingnaojing injection were obtained by Traditional Chinese Medicine Systems Pharmacology Database and Analysis Platform（TCMSP） and Traditional Chinese Medicine Integrated Database（TCMID）.The potential gene targets of ACI and ACH were obtained by GeneCards，OMIM，PharmGkb，TTD，and DrugBank.The common target Venn diagram was drawn by DIAGRAMS.The interaction network of "drugs-active ingredients-potential targets" was constructed by Cytoscape 3.9 software.Finally，the protein-protein interaction（PPI） network was constructed by STRING and topology analysis was carried out.Gene ontology（GO） and Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes（KEGG） enrichment of common targets were analyzed by R/BioConductor.Results：There were 68 active components of Xingnaojing injection，583 corresponding target genes，of which 3 597 potential targets were related to ACI，3 959 potential targets were related to ACH，and there were 299 common targets.PPI network core proteins included vascular endothelial growth factor A（VEGFA），JUN，signal transducers and activators of transcription 3（STAT3），interleukin（IL）-6，tumor necrosis factors（TNF），serum albumin（ALB），caspase-3（CASP3），protein kinase（AKT）1，mitogen activated protein kinase（MAPK）3，hypoxia-inducible factor-1α（HIF-1α），epidermal growth factor receptor（EGFR），epidermal growth factor（EGF），recombinant prostaglandin endoperoxide synthase 2（PTGS2），IL-1β，matrix metalloproteinase 9（MMP-9）;mainly pathway involved in lipid and arteriosclerosis，MAPK signal pathway，fluid shear stress and arteriosclerosis，TNF signal pathway， apoptosis，IL-17 signal pathway and so on.Conclusion：Xingnaojing injection achieves the therapeutic effect on ACI and ACH by anti-oxidative stress，anti-inflammatory reaction，anti-apoptosis，and promoting angiogenesis.

Keywords? ??acute cerebral infarction; acute cerebral hemorrhage; Xingnaojing injection; network pharmacology; different diseases with same treatment

基金項目? 國家自然科學基金項目（No.81904285）；北京市自然科學基金項目（No.7182104）

作者單位? 1.北京中醫(yī)藥大學東直門醫(yī)院（北京 100700）；2.北京中醫(yī)藥大學（北京 100029）

通訊作者? 鄒憶懷，E-mail：zouyihuai2004@163.com

引用信息? 彭景，陳星，呂秋藝，等.醒腦靜注射液“異病同治”急性腦梗死與急性腦出血作用機制的網絡藥理學研究［J］.中西醫(yī)結合心腦血管病雜志，2024，22（2）：231-238.

急性腦梗死（acute cerebralinfarction，ACI）與急性腦出血（acute cerebral hemorrhage，ACH）為常見的兩種腦血管急癥，合稱為腦卒中，是由于腦部血管突發(fā)阻塞或破裂，血液不能流入大腦而導致腦組織缺血、缺氧性損傷［1］，具有起病急、病情進展迅速的特點，以其高發(fā)病率、高致殘率、高死亡率嚴重危害人類的健康［2］。因此，ACI和ACH的診療策略以及藥物腦保護機制一直是腦損傷防治領域的研究重點，現研究發(fā)現治療中聯(lián)合醒腦靜注射液可有效提高腦卒中病人的臨床療效，在改善ACI和ACH神經功能缺損方面有效且安全［3-6］。

醒腦靜注射液方藥源自臨床使用200余年的經典急救名方“安宮牛黃丸”，由麝香、冰片、梔子和郁金4味中藥經科學提取精制而成，是國內唯一獲批用于腦缺血和出血性腦卒中急救的中藥注射液［7］。方中麝香、冰片氣味芳香走竄，能通諸竅不利，為通竅醒腦之要藥，又擅瀉火毒、化瘀血、散熱結；梔子、郁金性味苦寒、清熱瀉火、涼血解毒、化痰開郁，清利三焦痰瘀熱邪，并助開竅通絡。諸藥合用，共奏開竅醒腦、安神定志、清熱解毒、鎮(zhèn)驚止痛、涼血行氣之功，有“異病同治”之效。但其處方組成的合理性及作用機制的科學內涵尚未闡明，遂本研究利用網絡藥理學技術對醒腦靜注射液“異病同治”ACI和ACH的有效成分及作用靶點進行預測分析，以期進一步揭示其藥理作用，為醒腦靜注射液臨床應用推廣和作用機制研究提供理論基礎和科學依據。

1? 資料與方法

1.1? 醒腦靜注射液活性成分與靶點篩選

運用中藥系統(tǒng)藥理學數據庫及分析平臺（Traditional Chinese Medicine Systems Pharmacology Database and Analysis Platform，TCMSP）與中醫(yī)藥綜合數據庫（Traditional Chinese Medicines Integrated Database，TCMID），分別以“麝香”“冰片”“郁金”“梔子”為關鍵詞檢索其活性成分，通過PubChem數據庫（https：//pubchem.ncbi.nlm.nih.gov/）分別查找各活性成分的化學結構式，導入Swiss ADME平臺（http：//www.swissadme.ch/）篩選，符合“胃腸吸收度”為“high”，以及“類藥性”的5個過濾器屬性值中有2項或以上為“yes”的通過篩選，獲取有效成分。運用Swiss Target Prediction（http：//www.swisstargetprediction.ch/）預測各有效成分的靶點，設置“probability＞0”的靶點為有效靶點，運用UniProt蛋白質數據庫（https：//www.uniprot.org/）統(tǒng)一將蛋白質靶點信息標準化為相應的UniProt ID。收錄符合條件的活性成分及對應靶點。

1.2? ACI和ACH潛在疾病靶點篩選

分別以“acute cerebral infarction”和“acute cerebral hemorrhage”為檢索詞，從人類基因數據庫（GeneCards，https：//www.genecards.org/）、在線人類孟德爾遺傳數據庫（OMIM，https：//omim.org/）、遺傳藥理學和藥物基因組學數據庫（PharmGkb，https：//www.pharmgkb.org/）、治療目標數據庫（TTD，http：//db.idrblab.net/ttd/）和藥物靶標數據庫（DrugBank，https：//www.drugbank.com/）中檢索，合并5個數據庫信息，去重后得到ACI和ACH潛在靶點。

1.3? 共同靶點獲取

利用DIAGRAMS（http：//bioinformatics.psb.ugent.be/webtools/Venn/）在線工具平臺，將醒腦靜注射液各活性成分靶點與ACI、ACH疾病潛在靶點分別導入，取交集并繪制韋恩圖。

1.4? “藥物-活性成分-潛在靶點”調控網絡構建

利用Cytoscape 3.9軟件導入所獲得的藥物活性成分、潛在靶點等信息及相互作用關系，構建醒腦靜注射液治療ACI、ACH的“藥物-活性成分-潛在靶點”可視化調控網絡。

1.5? 蛋白-蛋白相互作用（protein-protein interaction，PPI）網絡構建與拓撲分析

將共同靶點導入STRING數據庫（https：//string-db.org/），設定物種為“Homo sapiens”，同時去掉游離的靶點，構建PPI網絡。將PPI網絡數據導入Cytoscape 3.9軟件并利用CytoNCA APP進行網絡拓撲分析，先以Betweenness值＞61為標準篩選，再提取Degree值排前15位的靶點作為核心蛋白靶點網絡。

1.6? 基因本體（gene ontology，GO）及京都基因和基因組百科全書（Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes，KEGG）通路富集分析

在BioConductor檢索“DOSE”“clusterProfiler”“enrichplot”“pathview”安裝語言，并在R中安裝，同時安裝“colorspace”“stringi”“ggplot2”。對篩選的共同靶點進行靶點GO功能富集分析和KEGG通路富集分析，篩選出具有統(tǒng)計學意義的生物學過程和信號通路，均以P＜0.05為標準。并將KEGG富集分析結果導入Cytoscape 3.9軟件進行拓撲分析，構建KEGG關系網絡。

2? 結? 果

2.1? 醒腦靜注射液藥物活性成分與靶點預測

依照上述檢索與篩選標準，收集醒腦靜注射液藥物有效成分信息見表1，去重后獲得活性成分68個及相應靶點基因583個。

2.2? 醒腦靜注射液“異病同治”ACI和ACH潛在靶點篩選

通過GeneCards、OMIM、PharmGkb、TTD和DrugBank等數據庫收集并去重后獲得ACI潛在靶點3 597個及ACH潛在靶點3 959個，與藥效靶點取交集后得到299個共同靶點，視為醒腦靜注射液治療ACI和ACH“異病同治”效應潛在的作用靶點。詳見圖1。

圖1? 醒腦靜注射液治療ACI和ACH靶點韋恩圖

2.3? “藥物-活性成分-潛在靶點”調控網絡構建

將醒腦靜注射液藥物活性成分與ACI、ACH藥效作用靶點導入Cytoscape 3.9軟件，構建“藥物-活性成分-潛在靶點”調控網絡圖（見圖2），共有367個節(jié)點（包括68個活性成分及299個潛在靶點基因）和1 244條邊，許多靶點可以通過多種活性成分進行調控，并存在單個活性成分與多個靶點的相互作用。運用網絡拓撲分析得到各節(jié)點度值，Degree值排名前10位的核心活性成分及其詳細信息見表2，Degree值排名前10位的潛在靶點為前列腺素內過氧化物合酶2（PTGS2）、細胞色素P450 19A1酶（CYP19A1）、羥基類固醇脫氫酶11β1（HSD11B1）、花生四烯酸-5-脂加氧酶（ALOX5）、性激素結合球蛋白（SHBG）、乙酰膽堿酯酶（ACHE）、雌激素受體1（ESR1）、細胞色素P450 17A1酶（CYP17A1）、雌激素受體2（ESR2）、組織蛋白酶K（CTSK）等。

2.4? PPI網絡的構建及拓撲分析

通過STRING數據庫和Cytoscape 3.9軟件對上述299個醒腦靜注射液作用靶點進行蛋白質相互作用信息分析并構建PPI網絡，運用CytoNCA APP進行網絡拓撲分析，根據Betweenness值和Degree值篩選出核心蛋白網絡，包括血管內皮生成因子A（VEGFA）、JUN轉錄因子（JUN）、信號轉導與轉錄激活因子3（STAT3）、白細胞介素（IL）-6、腫瘤壞死因子（TNF）、清蛋白（ALB）、胱天蛋白酶（CASP）3、絲氨酸/蘇氨酸蛋白激酶 1（AKT1）、絲裂原活化蛋白激酶（MAPK）3、低氧誘導因子-1α（HIF-1α）、表皮生長因子受體（EGFR）、表皮生長因子（EGF）、PTGS2、IL-1β、基質金屬蛋白酶-9（MMP-9）等。詳見圖3。

2.5? GO富集分析結果

將醒腦靜注射液治療ACI和ACH的299個作用靶點基因導入R軟件進行富集分析，GO分析排前10位的結果見圖4，其中，生物過程（biological process，BP）主要涉及對外源性刺激的反應、氧化應激反應、傷口愈合、脂多糖反應等；細胞組分（cellular component，CC）包括膜微結構域、膜筏、細胞-基底連接、黏著斑、神經元細胞體等；分子功能（molecular function，MF）主要富集在蛋白質絲氨酸/蘇氨酸/酪氨酸激酶活性、內肽酶活性、血紅素結合、跨膜受體蛋白激酶活性、跨膜受體蛋白酪氨酸激酶活性等。

2.6? KEGG富集分析及關系網絡構建

KEGG富集分析結果顯示P＜0.05的醒腦靜注射液治療ACI和ACH的信號通路共176條，主要相關通路為脂質與動脈粥樣硬化、MAPK信號通路、流體剪切應力與動脈粥樣硬化、TNF信號通路、凋亡、IL-17信號通路等。詳見圖5。將KEGG富集分析結果與相關基因靶點導入Cytoscape 3.9軟件進行拓撲分析，構建KEGG關系網絡，圖形大小代表連接節(jié)點的數量，可見MAPK3、MAPK1、AKT1、RELA癌基因（RELA）、螺旋環(huán)螺旋結構域擴散激酶（CHUK）、核因子κB（NF-κB）激酶亞基β抑制因子（IKBKB）、STAT3、MAPK10、MAPK8、MAPK9、絲裂原激活蛋白激酶激酶1（MAP2K1）、CASP、MAPK14、JUN、NF-κB抑制因子α（NFKBIα）等可能是醒腦靜注射液治療ACI和ACH的核心靶點。詳見圖6。繪制與ACI、ACH關系密切的2條信號通路機制圖。詳見圖7。

3? 討? 論

ACI和ACH為臨床難治性疾病，其病理機制分別為腦組織缺血性和出血性損傷，學術界普遍認同二者病理生理過程中引發(fā)的氧化應激、炎癥反應、細胞凋亡、興奮性毒性等復雜的生化和分子機制相互關聯(lián)，參與腦缺血、腦水腫、血腦屏障通透性改變和神經元凋亡等一系列神經系統(tǒng)損害［8］。且臨床研究證實醒腦靜注射液通過減輕免疫炎性反應、抗氧化應激損傷、參與新生血管形成等機制保護受損腦組織，促進神經功能恢復，應用于腦血管疾病療效肯定［9］。而從中醫(yī)學角度來看，ACI和ACH統(tǒng)稱“中風病”，其中ACI源于風火痰瘀、痹阻腦絡，而ACH源于風火灼傷腦絡、絡破血溢，均致氣血逆亂、上擾腦竅、神明失用，為中風病之核心病機［10］，表現為突然昏仆、半身不遂、口舌歪斜、言語謇澀或不語、偏身麻木等典型癥狀［11］。中風病急性期標實癥狀突出，本著“急則治其標”的原則，早期圍繞核心病機予醒腦開竅、醒神回厥治法，對證首選醒腦靜注射液涼血解毒、開竅醒腦、行氣活血，進行共性治療。可見，ACI和ACH的中醫(yī)核心病機與西醫(yī)病理機制共同為醒腦靜注射液“異病同治”的基礎。

本研究通過數據庫篩選與網絡構建發(fā)現，醒腦靜注射液“異病同治”ACI和ACH的關鍵活性成分有槲皮素、梔子苷、桑色素、青蒿素和山柰酚等，可調節(jié)醒腦靜注射液治療的大多數靶點，且均可透過血腦屏障對ACI和ACH后受損的神經細胞產生良好的保護作用。槲皮素具有抗氧化反應、清除自由基、抗炎、抗血栓、抑制細胞凋亡的獨特神經保護作用，在中樞神經系統(tǒng)疾病的病理生理過程中可作為一種神經保護物質［12］。梔子苷營養(yǎng)神經的作用顯著，Chiu等［13］在細胞實驗中證實其能誘導PC12細胞神經突生長，并伴有神經元分化，可能與作用于MAPK/細胞外調節(jié)蛋白激酶（ERK）信號通路有關，亦有研究認為其抗氧化和解毒功能也是腦保護的機制之一［14］。桑色素可通過下調炎性遞質NF-κB、Toll樣受體4（TLR4）和多聚ADP核糖聚合酶1（PARP1）等的表達而抑制炎性反應，促進腦缺血受損神經功能的恢復［15］。青蒿素是治療瘧疾最有效的藥物之一，此外，研究表明青蒿素及其衍生物可抵抗氧化應激來發(fā)揮營養(yǎng)和保護神經的作用［16-17］。山柰酚通過調節(jié)NF-κB、p38MAPK和AKT等重要的炎癥信號通路，促進抗炎和抗氧化應激作用［18］，從而發(fā)揮多種腦神經保護功能。

通過STRING數據庫對醒腦靜注射液“異病同治”ACI和ACH的共同靶點構建PPI網絡顯示，核心靶點包括VEGFA、JUN、STAT3、IL-6、TNF、ALB、CASP3、AKT1、MAPK3、HIF-1α、EGFR、EGF、PTGS2、IL-1β、MMP-9等。主要涉及以下機制，1）血管生成方面：EGFR協(xié)同EGF具有促進神經再生的功能，研究證實激活EGFR可增加神經前體細胞的增殖和存活，減少缺血性腦損傷［19］。HIF-1α是調節(jié)機體免疫和炎癥的關鍵轉錄因子，其表達和活性受到細胞氧濃度與EGFR的嚴密調控，并通過控制血管生成來調節(jié)氧的運輸能力，增強機體對低氧的耐受［20］。VEGFA為HIF-1α的下游基因，在腦損傷和缺氧的雙重刺激下，通過誘導血管生成、進行血供重建而提高神經保護［21］。故推測醒腦靜注射液減輕ACI和ACH神經系統(tǒng)損害的機制可能與調節(jié)HIF-1α/VEGFA通路促進腦梗死后血管新生、修復受損血腦屏障有關。2）細胞凋亡方面：Caspase-3是涉及細胞凋亡的半胱天冬酶家族成員，已被公認為神經元凋亡的關鍵介質［22］。JUN可調節(jié)炎癥反應和細胞凋亡，加重腦缺血/再灌注過程誘導的損傷［23］。此外，STAT3和AKT1與腦卒中后神經元細胞凋亡亦有著密切關系［24］。3）炎癥反應方面：ACI早期免疫系統(tǒng)激活誘發(fā)炎癥細胞的積累和炎性細胞因子（IL-6、TNF、IL-1β、MMP-9）的釋放，是導致神經元凋亡、神經系統(tǒng)受損的主要因素［25］。此外，大腦中PTGS2是合成前列腺素的核心酶介，后者介導神經源性炎癥反應同時，使腦血管過度擴張引發(fā)疼痛［26］。以上核心作用靶點表明醒腦靜注射液可能通過促血管生成、抗細胞凋亡、抗炎癥反應等機制發(fā)揮中藥多靶點“異病同治”的特性。

進一步運用GO及KEGG富集分析發(fā)現，相關靶點富集通路與動脈粥樣硬化密切相關，而動脈粥樣硬化是ACI和ACH發(fā)生、發(fā)展最重要的病理生理機制，亦為獨立危險因素［27］。早期機體脂質代謝障礙、纖維組織增生、鈣沉積，致使動脈血管內膜增厚，從而形成動脈粥樣硬化斑塊，病變繼續(xù)加重則可出現斑塊鈣化、粥樣潰瘍、血栓形成和斑塊內出血等繼發(fā)病變，導致顱內動脈狹窄、堵塞或破裂［28］，引發(fā)ACI和ACH病理改變。可見脂質代謝異常是動脈粥樣硬化的基礎，而流體剪切應力則代表血流施加在血管內皮的摩擦力，其下降是動脈粥樣硬化和血管炎癥的促成條件［29］。隨著動脈粥樣硬化斑塊面積的不斷增加，ACI、ACH病情嚴重程度與復發(fā)風險亦增加，故現代醫(yī)學多采用腦卒中后強化降脂治療的策略。此外，其他途徑如MAPK家族的信號通路可以被各種炎癥、損傷、應激等激活，在ACI和ACH炎癥反應、神經退行性病變和神經細胞凋亡過程中均發(fā)揮重要的作用［30-32］，已被視為缺血性和出血性腦血管疾病的潛在治療靶點；神經細胞凋亡信號通路的激活會導致神經元喪失，被認為是繼發(fā)性腦損傷的主要病理變化之一，造成神經功能損傷進行性發(fā)展［33］；TNF信號通路、IL-17信號通路介導的神經炎癥反應在ACI和ACH病程進展中一方面能夠損傷血管內皮細胞，促使動脈粥樣硬化及不穩(wěn)定斑塊的破裂，另一方面增加血腦屏障通透性，導致腦水腫及組織壞死，并致預后不良［34］。

基于以上認識，近年來，阻斷相關通路的藥物一直是ACI和ACH藥效機制研究的熱點，值得注意的是，本研究發(fā)現醒腦靜注射液可能通過調節(jié)脂質與動脈粥樣硬化、流體剪切應力與動脈粥樣硬化及炎癥相關通路從而修復受損的血管內皮系統(tǒng)，減輕血管炎癥反應與氧化應激反應，抑制腦損傷的進展，為ACI和ACH神經保護擴展新的治療手段。

4? 小? 結

綜上所述，通過網絡藥理學方法初步探究醒腦靜注射液“異病同治”ACI和ACH的分子生物學機制，發(fā)現醒腦靜注射液可能通過槲皮素、梔子苷、桑色素、青蒿素和山柰酚等主要活性成分，作用于VEGFA、JUN、STAT3、IL-6、TNF、ALB、CASP3、AKT1、MAPK3、HIF-1α、EGFR、EGF、PTGS2、IL-1β、MMP-9等核心靶點，涉及脂質與動脈粥樣硬化、MAPK信號通路、流體剪切應力與動脈粥樣硬化、TNF信號通路、凋亡、IL-17信號通路等多條通路，發(fā)揮抗氧化應激、抗炎癥反應、抗細胞凋亡和促血管生成的作用，從而實現對ACI和ACH腦損傷的保護與修復，具有多成分、多靶點、多通道協(xié)同作用、異病同治的特點。

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（收稿日期：2023-02-17）

（本文編輯王麗）