食品中亞硝酸鹽檢測關鍵影響因素探究

摘 要：目的：運用《食品安全國家標準 食品中亞硝酸鹽與硝酸鹽的測定》（GB 5009.33—2016）第二法 分光光度法對食品中亞硝酸鹽進行檢測，分析影響檢測結果的關鍵因素。方法：將標準溶液和待測溶液在同等條件下進行測定，擴展標準曲線線性范圍，將檢測過程分為4個步驟，分別進行加標回收試驗，結合氧化還原反應標準電極電勢分析影響檢測結果的關鍵因素。結果：亞鐵氰化鉀溶液久置后可能分解產生Fe3+，Fe3+可氧化亞硝酸根導致檢測結果偏低，其他溶液相對穩定。結論：GB 5009.33—2016中分光光度法穩定可靠，亞鐵氰化鉀溶液的穩定性是影響檢測結果的關鍵因素。

關鍵詞：食品；亞硝酸鹽；亞鐵氰化鉀；分光光度法

Research on Key Influencing Factors of Determination of Nitrite in Foods

WANG Qiangli

（Xiamen Institute for Food and Drug Quality Control， Xiamen 361013， China）

Abstract： Objective： To detect nitrite in food by GB 5009.33—2016 second method spectrophotometry， and analyze the key factors affecting the test results. Method： The standard solution and the solution to be tested were measured under the same conditions， and the linear range of the standard curve was expanded. The detection process was divided into four steps， and the standard recovery test was carried out respectively. Combined with the standard electrode potential of the redox reaction， the key factors affecting the detection results were analyzed. Result： The potassium ferrocyanide solution may decompose to produce Fe3+ after a long time. Fe3+ can oxidize nitrite， resulting in low detection results， and other solutions are relatively stable. Conclusion： The spectrophotometric method in"GB 5009.33—2016 is stable and reliable， and the stability of potassium ferrocyanide solution is the key factor affecting the test results.

Keywords： food; nitrite; potassium ferrocyanide; spectrophotometry

亞硝酸鹽主要以鈉鹽和鉀鹽的形式存在于食品中，食品中的亞硝酸鹽主要來源于人工添加和食品本身。亞硝酸鹽可用于食物的增色、保色、抗氧化及防腐[1]。食品本身如蔬菜、肉類、水果等均含有硝酸鹽，在加工工藝、保存條件、保存時間以及保存溫度等[2-3]的影響下可轉化為亞硝酸鹽[4]，特別是腌制食品易發生亞硝酸鹽含量超標[3，5]。亞硝酸鹽易與人體中的血紅蛋白反應，阻礙人體氧的運輸，導致組織缺氧[1]，且在酸性條件下易與人體中的胺類物質反應生成致癌物[5-6]。人體（成年人）攝入0.2～0.5 g亞硝酸鹽就能引起中毒現象，攝入3 g可引起死亡[5]。因此，食品中亞硝酸鹽含量直接影響人類的身體健康，準確測定食品中亞硝酸鹽的含量成為檢驗機構的共同目標。《食品安全國家標準 食品中亞硝酸鹽與硝酸鹽的測定》（GB 5009.33—2016）已經歷多次改版，規定的檢測方法有離子色譜法和分光光度法，其中分光光度法由于具有快速、簡便、成本低等優勢被大多數實驗室采用[7]，并被廣泛應用于快速檢測[8]。雖然國家標準經歷多次改版，但均未對分光光度法的試劑種類、試劑濃度、顯色原理以及顯色條件進行修改，表明該方法樣品提取、分離、顯色的原理穩定、方法可靠。

1 材料與方法

1.1 試劑

亞鐵氰化鉀、乙酸鋅、冰乙酸、硼酸鈉、對氨基苯磺酸、鹽酸萘乙二胺、鹽酸等試劑均為分析純，國藥集團化學試劑有限公司；實驗用水為《分析實驗室用水規格和試驗方法》（GB/T 6682—2008）規定的一級水。亞鐵氰化鉀、乙酸鋅、飽和硼砂溶液于密閉透明廣口瓶室溫存放；對氨基苯磺酸、鹽酸萘乙二胺溶液于棕色瓶密閉、避光冷藏。

1.2 儀器

UV-2700 SHIMADZN紫外可見分光光度計，島津儀器（蘇州）有限公司；DK-S26電熱恒溫水浴鍋，上海精宏實驗設備有限公司。

1.3 實驗方法

1.3.1 樣品制備

參照GB 5009.33—2016第二法 分光光度法，稱取一定量肉松、肉松盲樣、奶粉質控樣[亞硝酸鹽含量為（18.0±1.6）mg·kg-1（以亞硝酸鈉計）]，加入飽和硼砂進行熱提取，隨后加入亞鐵氰化鉀溶液和乙酸鋅溶液沉淀蛋白質，濾紙過濾，取濾液待測。

1.3.2 系列標準溶液配制

適當擴展標準曲線線性范圍[6]。亞硝酸鹽系列標準溶液（以亞硝酸鈉計）：準確移取一定量的亞硝酸鹽標準使用液，用純水稀釋定容，得到濃度分別為0.042 μg·mL-1、0.105 μg·mL-1、0.21 μg·mL-1、0.42 μg·mL-1和0.84 μg·mL-1的亞硝酸鹽系列標準溶液。

1.3.3 檢測方法

參照GB 5009.33—2016第二法 分光光度法，分別移取50 mL的標準溶液和待測液，用對氨基苯磺酸、鹽酸萘乙二胺溶液進行顯色測定，于538 nm處測定吸光度。本文中的加標濃度和檢測結果均表示樣品經1.3.1處理后待測液的濃度，盲樣、質控樣的檢測結果為樣品實際含量，ND值為未檢出，純水樣品均未檢出。

2 結果與分析

2.1 標準曲線繪制和擴展

GB 5009.33—2016第二法 分光光度法的標準曲線最高濃度點吸光度較低，僅適用于低濃度樣品，對于高濃度樣品，需要稀釋后重新測定。已有相關文獻報道[6]，可根據樣品需要，適當擴展標準曲線的線性范圍，使吸光度在0.2～0.8，甚至更寬，以減少高濃度樣品的重復測定，提高檢測準確性和檢測效率。考慮重氮化反應為放熱反應[9]，將分光光度法標準溶液的先顯色、后定容方式，改進為先稀釋定容、再加入顯色試劑，將標準溶液與待測溶液在同等條件下測定。按1.3.2繪制標準曲線，如圖1所示，以亞硝酸鹽濃度為橫坐標，吸光度值為縱坐標進行線性擬合，得到線性方程Y=0.649 99X+0.010 59，曲線斜率為0.649 99，截距為0.010 59，相關系數為0.999 82，標準曲線滿足測定要求。

2.2 加標回收試驗

GB 5009.33—2016第二法 分光光度法未對飽和硼砂、亞鐵氰化鉀、乙酸鋅溶液的保存條件和有效期進行明確說明，僅提及對氨基苯磺酸和鹽酸萘乙二胺溶液需置于棕色瓶中避光保存。在實際檢測過程中，會存在溶液配制1周甚至1個月后仍在使用的情況，這需要實驗室時刻關注并跟蹤溶液的變化情況。測試純水的加標回收率成為檢驗溶液是否持續有效的重要手段。用新配制和放置1個月的檢測溶液（飽和硼砂、亞鐵氰化鉀、乙酸鋅、對氨基苯磺酸和鹽酸萘乙二胺溶液），在純水中添加0.1 μg·mL-1的亞硝酸鹽進行加標回收試驗，試驗結果如表1所示。由表1可知，采用新配制檢測溶液進行加標回收試驗，加標濃度為0.1 μg·mL-1時，回收率達到98.8%，與相關文獻報道相近[10]；采用放置1個月的檢測溶液進行加標回收試驗，回收率僅為47.1%，將蛋白質沉淀時間縮短為10 min，加標回收率提高至75.4%，推測蛋白質沉淀時間會對檢測結果產生影響。

進一步將檢測溶液放置6個月，在純水中添加不同濃度的亞硝酸鹽進行加標回收試驗；在肉松中添加0.25 μg·mL-1的亞硝酸鹽進行加標回收試驗，放置不同時間后測定回收率，結果如表2所示。對比表1，純水的加標濃度為0.25 μg·mL-1時，加標回收率由低溶度（0.1 μg·mL-1）的47.1%提高到80.8%；加標濃度為0.75 μg·mL-1時，加標回收率提高到87.3%。肉松加標后直接測定得到的回收率為81.6%；肉松加標后放置1 d再進行測定，加標回收率上升至90.4%；放置2 d后，加標回收率下降至70.4%。結果表明，低濃度樣品受檢測試劑溶液影響較大。肉松加標回收率受放置天數的影響，表明亞硝酸鹽在肉松樣品中存在一定的轉化[4]。

2.3 各檢測步驟對檢測結果的影響

將檢測過程分為4個步驟：飽和硼砂溶液熱提取15 min、亞鐵氰化鉀溶液和乙酸鋅溶液沉淀蛋白質30 min、濾紙過濾樣品以及顯色。以純水為樣品，通過加標回收試驗的方法，考察各檢測步驟對檢測結果的影響，包括在樣品中加標、熱提取15 min冷卻后加標、蛋白質沉淀30 min后加標以及過濾后加標。仍使用放置6個月的檢測溶液進行檢測，檢測結果如表3所示。由表3可知，熱提取15 min冷卻后的加標回收率為78.0%，蛋白質沉淀30 min后加標和過濾后加標的回收率分別為99.6%、98.4%，證明濾紙并未吸附亞硝酸鹽，且顯色試劑穩定有效。結合2.2，縮短沉淀時間、提高加標濃度均可提高加標回收率，推測沉淀劑為影響加標回收率的主要因素。鑒于乙酸鋅的化學穩定性，推測加標回收率受亞鐵氰化鉀溶液影響較大。因此，后續僅重新配制亞鐵氰化鉀溶液，繼續考察加標回收率情況。

2.4 亞鐵氰化鉀溶液對檢測結果的影響

重新配制亞鐵氰化鉀溶液，其他檢測溶液仍使用放置6個月后的溶液，考察純水和肉松的加標回收率，結果如表4所示。由表4可知，純水加標濃度為0.25 μg·mL-1時，加標回收率為101.6%，加標濃度為0.75 μg·mL-1時，加標回收率為98.9%；肉松加標濃度為0.25 μg·mL-1時，加標回收率為96.4%，加標濃度為0.75 μg·mL-1時，加標回收率為97.6%。且表5中奶粉質控樣（4 g）的檢測結果為17.6 mg·kg-1，在質控范圍之內，結果準確；肉松盲樣檢測結果為32.0 mg·kg-1，初濾液為31.8 mg·kg-1，將肉松盲樣沉淀后過濾，濾液放置1 d后的檢測結果為32.0 mg·kg-1，濾液放置4 d后的檢測結果為32.6 mg·kg-1，結果并無太大差異，表明分離沉淀后的濾液穩定，新配制的亞鐵氰化鉀溶液穩定有效、沉淀過程對亞硝酸鹽無影響。增加質控樣的稱樣量時，發現樣品提取過程存在結塊現象，檢測結果為14.3 mg·kg-1，偏離質控范圍，且相對偏差較大。

3 討論

相關文獻報道[11]，亞鐵氰化鉀能夠與Fe3+生產深藍色普魯士藍，普魯士藍水溶性較弱，實驗發現長期存放亞鐵氰化鉀溶液的器壁存在藍色沉淀，推測久置亞鐵氰化鉀溶液中存在Fe3+，Fe3+為高價態，具有一定的氧化性，可氧化亞硝酸鹽，導致檢測結果偏低。2.2中縮短沉淀時間（表1）即減少氧化反應時間、提高加標濃度（表2），2.4中使用新配制的亞鐵氰化鉀溶液（表4）均能提高加標回收率，進一步證實久置亞鐵氰化鉀溶液中存在Fe3+。對比氧化還原電位，堿性條件下，NO3-還原成NO2-的標準電極電勢為0.01 V[12]，Fe3+還原成Fe2+的標準電極電勢為0.771 V[13]，在久置亞鐵氰化鉀溶液中可能存在Fe（CN）63-和Fe（CN）64-，Fe（CN）63-還原成Fe（CN）64-的標準電極電勢為0.360 V[13]。三價鐵兩種形態的氧化電位均高于亞硝酸鹽，因此，久置的亞鐵氰化鉀試劑可氧化亞硝酸鹽。

4 結論

已有相關學者對GB 5009.33—2016第二法 分光光度法的影響因素進行了探討，包括沉淀劑[10，14]、標準系列溶液是否參與前處理[15]、顯色反應時間、溫度、pH值以及顯色劑用量[16-18]等。GB 5009.33—2016第二法 分光光度法的不足之處在于未對試劑溶液保存、使用條件進行明確規定。本文將標準溶液和待測液在同等條件下進行測定，擴展了標準曲線的線性范圍，并考察了溶液保存時間對檢測結果的影響，結果表明，溶液久置會導致加標回收率降低；通過考察各檢測步驟對檢測結果的影響，發現亞鐵氰化鉀溶液的穩定性是影響檢測結果準確性的關鍵因素，其他試劑相對穩定。

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