白及根腐病病原菌的鑒定及抑制效應研究

摘 要：為明確鑒定白及塊莖腐爛?。ǜ。┑牟≡⒑Y選能夠抑制病原菌的中藥材提取物。該研究利用常規組織分離法對病原菌進行分離，通過形態學和分子生物學技術對致病菌株進行鑒定，同時觀察了7種中藥材提取物對病原菌的抑菌效果。結果表明：（1）從感病葉片、葉鞘及塊莖中共分離得到 14 株真菌和 4株細菌，病原菌室內和室外回接表明菌株 GF-1致病癥狀與田間一致，致病率均達到100%。（2）經形態學鑒定，菌株GF-1為附球菌屬（Epicoccum）病原菌，菌落白色絨絮狀，圓形；菌絲匍匐向外、向上生長，氣生，無色，有隔膜，有分枝，具有分生孢子和厚垣孢子。（3）菌株GF-1的ITS 序列（全長522 bp）與 GenBank 中已登錄的甘蔗的高粱附球菌（E. sorghinum，MN493119.1）序列一致性最高，達99.62%，與已報道的白及葉斑病致病菌高粱附球菌（E. sorghinum， MF948994.1）的一致性為98.88%。（4）培養基中含有0.1～0.2 g·mL^-1的青錢柳等7種中藥材提取物，能夠完全抑制GF-1菌落的生長；當培養基中含有0.05 g·mL^-1的提取物時，肉桂和丁香提取物仍然能夠完全抑制菌落的生長。綜上認為，引起白及根腐病的致病菌為附球菌屬高粱附球菌（E. sorghinum），培養基中分別含有0.1～0.2 g·mL^-1的青錢柳、白及、厚樸、八角、肉桂、蛇床子和丁香7種中藥材提取物且均能完全抑制致病菌的生長。該研究結果為白及根腐病的防治提供了理論指導。

關鍵詞：白及，根腐病，病原菌分離和鑒定，高粱附球菌，中草藥提取物

中圖分類號：Q948 文獻標識碼：A 文章編號：1000-3142（2024）02-0345-09

基金項目：廣西重點研發計劃項目 （桂科AB18294026）；廣西科學院園藝植物種質資源創新及利用創新研究團隊啟動經費項目（CQZ-E-1919）；桂林市創新平臺和人才計劃項目 （20210102-3）；桂林市技術應用與推廣計劃項目 （20220135-1）。

第一作者：馬曉雅（1997-），碩士研究生，主要從事園林植物栽培及景觀設計研究，（E-mail）1207092435@qq.com。

^*通信作者：鄭文俊，博士，教授，主要從事民族鄉土景觀及風景旅游規劃，（E-mail）149480860@qq.com;" 仇碩，博士，副研究員，主要從事園藝植物種質資源創新與利用研究，（E-mail）qiushuo001@163.com。

Identification and inhibiting effect of pathogens that caused tuber rot of Bletilla striata MA Xiaoya^1，2， LU Xi^1，2， WU Qiaofen²， YANG Yanni²， XIA Ke²，

ZHAO Zhiguo²， ZHENG Wenjun^1*， QIU Shuo^2*

（ 1. College of Tourism ＆ Landscape Architecture， Guilin University of Technology， Guilin 541006， Guangxi， China; 2. Guangxi Key Laboratory of Plant Functional Phytochemicals and Sustainable Utilization， Guangxi Institute of Botany， Guangxi Zhuang Autonomous Region and Chinese Academy of Sciences， Guilin 541006， Guangxi， China ）

Abstract： In order to identify" the pathogens that caused tuber rot in Bletilla striata and study the inhibiting effects of herbal extracts on pathogens， the pathogens that caused tuber rot of B. striata were isolated using usual tissue isolation the strains were identified by morphological and molecular biological techniques， and inhibiting effects of seven traditional Chinese medicine extracts on pathogen were observed. The results were as follows：（1） A total of fourteen fungi and four bacteria were isolated from diseased leaves， leaf sheaths and tubers. But only strain GF-1 caused disease， whose symptoms consistent with those in the field. The incidences of GF-1 disease reinoculated in the field and laboratory were both 100％. （2）GF-1 was identified as a member of Epicoccum， and its colonial morphology was a circular form， with white mycelium， prostrate on the medium， aerial， diaphragms and branches. There were conidia and chlamydospores. （3）At last， the sequence of internal transcribed spacer （ITS） region of GF-1 were analyzed， the length was 522 bp. The sequence was compared with other species in the GenBank and reached" 99.62% similarity to Epicoccum sorghinum （MN493119.1） isolated form Sorghum， which was" closer than others， including Epicoccum sorghinum （MF948994.1） isolated form leaves of Bletilla striata. （4）GF-1 could be fully inhibited when the medium contained 0.1-0.2 g·mL^-1 extracts that extracted from seven traditional Chinese medicines， respectively." It also could be fully inhibited by 0.05 g·mL^-1 of Cinnamomum cassia or Syringa oblate. In summary， the pathogen that caused tuber rot in Bletilla striata was identified as Epicoccum sorghinum. And GF-1 could be fully inhibited cultivated on the medium which contained 0.1-0.2 g·mL^-1 herbal extracts， e.g.： Cinnamomum cassia， Syringa oblate， Cyclocarya paliurus， Bletilla striata， Houpoea officinalis， Illicium verum or Cnidium monnieri. The results provide theoretical references for the control of tuber rot of Bletilla striata.

Key words： Bletilla striata， tuber rot， pathogen isolation and identification， Epicoccum sorghinum， Chinese herbal extracts

白及（Bletilla striata）為蘭科（Orchidaceae）白及屬（Bletilla）多年生草本植物，別名白芨、連及草、利知子、甘根等。白及屬植物全球有6種，均分布在亞洲，其中中國有4種，分別為白及、小白及、華白及、黃花白及（中國植物志，1999）。白及具有止血補肺、生肌止痛之功效，用于防治咯血、吐血、慢性胃潰瘍及腫瘤、外傷出血、瘡瘍腫毒、皮膚皸裂等癥（中華人民共和國藥典，2020）；此外，白及葉態優美、花大色艷、花期長，可在園林景觀中用于布置花壇、花境或花海（石晶，2010；朱嬌等，2020）。此外，白及還可用于制作粘合劑、漿絲綢、面膜或涂料以及釀酒等（劉光斌等，2005；Gouvg et al.， 2009）。因此，白及是一種兼具藥用、觀賞和工業價值的多用途植物。

近年來，隨著市場需求量的逐年上升，種植規模不斷擴大，各類病害頻繁爆發，如葉斑病（柯尚艷等，2018；Zhou et al.， 2018）、葉褐斑病和銹病等（宋莉莎，2019），嚴重影響了白及的產量和質量以及觀賞價值。根腐病是白及的常見病害之一，大多發生在6—8月，地下塊莖出現褐色病斑，內部呈黑褐色軟腐狀，并伴有腥臭味，整個根部維管束被破壞，失去輸水能力；地上莖稈、葉片基部和葉鞘早期表現為褐色干枯狀長條形病斑，邊緣黃色暈染狀，后期則干枯至死，病株易連根莖從土中拔出，發病塊莖呈木質化纖維。整體發病率在15%左右，危害較大，一旦受害就會嚴重影響藥材的品質和產量。該病害易與葉斑病混淆（Zhou et al.， 2018）。目前，雖然研究報道表明引起白及根腐病的病原菌主要是尖孢鐮刀菌 （Fusarium oxysporum）和腐皮鐮刀菌（F. solani）（孫樂樂等，2013；宋莉莎，2019），但這些研究并未報道引起根腐病的地上部癥狀的病原菌。鑒于以上情況，在廣西地區引起白及根腐病的病原菌是否與葉斑病致病菌一致或者與根腐病致病菌一致目前尚不清楚。中藥材提取物具有低污染、低毒、低殘留的特點，廣泛用于中藥材病害防治，如厚樸和蛇床子提取液分別對黃芪和五味子根腐病具有很好的防治效果（劉瑩等，2009；馬偉等，2010）。然而，這些中藥材提取物對白及病害的防治效果還需要驗證。本文以白及根腐病為研究對象，采用常規組織分離法分離不同組織部位的病原菌，通過形態學且結合分子生物學技術鑒定病原菌，并采用菌絲生長速率法測定中藥材提取液對病原菌的抑制效果，以期明確鑒定廣西地區根腐病的病原菌，并篩選出能夠抑制病原菌的中藥材提取物，為白及根腐病防治提供理論指導。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

2021年6月，于桂林市雁山區（地處110°17′ E、25°01′ N）采集白及病株，初步判斷為葉斑病或根腐病。該病害多發生在6月中旬至8月初，整體發病率在15%左右，發病初期地上部無癥狀，地下部根系和塊莖出現褐色病斑，塊莖切開后呈黑褐色軟腐狀，并伴有腥臭味；隨著病情的加深，當地下塊莖出現1/3～1/2腐爛時，根系完全腐爛，地上莖稈開始出現褐色，葉片尖部和基部出現不規則病斑，病斑中央深褐色，邊緣黃褐色至淡黃色，直至萎蔫，莖稈容易被抽出（圖1）。A. 田間病株; B. 田間病株莖稈; C. 病株塊莖; D. 健康塊莖; E. 健康植株。

1.2 試驗方法

1.2.1 病原菌的分離 參照常規組織分離法（方中達，1998），從發病植株上采集病葉、葉鞘和地下塊莖，沖洗干凈，在病健交界處切下約 5 mm×5 mm 的小塊組織；先用75%的酒精處理30 s，再用0.1%濃度的升汞溶液消毒 60 s、無菌水沖洗晾干、無菌濾紙吸干水分后移置于 PDA 培養基上；在每個培養皿中（Φ=90 mm）放入3～4 塊組織，于25℃恒溫條件下培養3 d，對其進行純化培養。采用平板劃線法進行菌種純化，即在無菌操作臺中用接種環挑取菌絲，在PDA平板上劃線，進行編號后繼續置于 25℃ 恒溫條件下培養，純化至出現單個的菌落即可。

1.2.2 病原菌的致病性測定

1.2.2.1 室內回接 將3年生的白及組培苗健康植株采回實驗室，采取創傷接種法進行接種。用無菌水沖洗葉片和塊莖，用無菌濾紙吸干表面水分，在超凈工作臺內操作，步驟如下：用解剖刀將葉片背面輕輕刮傷（約 5 mm×5 mm）；對塊莖采用刺傷接種法，使用直徑5 mm的打孔器在菌落邊緣打取菌餅；將帶有菌絲那一面覆蓋在葉片和塊莖的傷口處，以接種PDA 培養基的健康白及葉片和塊莖為對照組；每個葉片處理3個傷口，粘貼菌餅，重復 3 次；每個塊莖從中間切開，各處理1個傷口，粘貼菌餅，重復3次。將樣品平鋪于帶有濕潤吸水紙的平盤內，做保濕處理，6 d 后統計感病數和發病率。計算公式：發病率=（感病數/接種總數）×100%。

1.2.2.2 田間回接 選擇室內回接致病的菌株，進一步進行田間回接驗證。選擇健康植株的葉片，用解剖刀輕輕割傷葉片上表面，面積約 5 mm×5 mm，使用直徑5 mm的打孔器取培養基中生長良好的病原菌菌餅，將帶有菌絲的一面貼向葉片，并利用透明膠布粘附到已接種的葉片部位；以無菌的 PDA 培養基作對照。每個處理 3 株，每張葉片粘貼 3個菌餅，共計9個接種部位。用保鮮袋罩住 24 h，6 d 后統計感病數和發病率。計算公式：發病率=（感病數/接種總數）×100%。

1.2.2.3 致病菌重新分離 對田間回接致病的植株進行再次分離，驗證是否符合柯赫式法則，病原菌的分離方法同1.2.1。

1.2.3 病原菌的形態學鑒定 對田間回接致病的病原菌，挑取生長良好的病原菌菌落，采用插片培養法置于含有 PDA培養基的一次性培養皿中，在25℃ 恒溫條件下培養，3～5 d 后觀察菌絲體、分生孢子的形態，用leika正置式顯微鏡DM2500拍照，并測量分生孢子大小（長、寬）及菌絲直徑。同時，查閱文獻資料進行初步鑒定。

1.2.4 病原菌的分子生物學鑒定 刮取菌絲，用液氮研磨法破壁，采用CTAB法提取病原菌菌絲的 DNA。采用真菌通用引物對ITS1/ITS4進行PCR擴增，將獲得的DNA片段進行1%的瓊脂糖凝膠電泳檢驗。 PCR產物的純化和測序由武漢擎科創新生物有限科技公司完成，將所得序列與GenBank （http： //www.ncbi.nlm.nih.gov） 中核酸數據進行BLAST分析，利用Vector NTIAdvance 11 進行比對，通過MEGA 5.0 進行UPGMA分析生成系統發育樹。通過同源性分析，對病原菌菌種進行分子水平鑒定（李若瑜等，2002）。

1.2.5 中藥材提取物對根腐病病原菌的抑制效應 把7種備試中藥材于烘箱中60℃烘干，粉碎，過40目篩（孔徑0.425 mm），密封后于-20℃下保存待用。將乙醇作為溶劑，采用3次振蕩浸提法提取（韓建華等，2002），合并3次濾液進行減壓濃縮至質量濃度為1 g·mL^-1，密封后于4℃冰箱中保存。采用菌絲生長速率法（吳文君，1988）測定中藥材提取液對白及根腐病致病菌的抑制效果。取質量濃度1 g·mL^-1的中藥提取液加入PDA培養基中，搖勻，參照前人的濃度設計梯度制成濃度分別為0.05、0.1、0.2 g·mL^-1的帶藥平板（馬偉等，2010；劉瑩等，2019），以加入無菌水的PDA培養基為空白對照。選用直徑為5 mm的打孔器，打取菌落邊緣的菌餅，接種于帶藥平板上，每組處理重復3次，于25℃恒溫下培養。培養48 h，每隔24 h用十字交叉法測量菌落直徑，連續記錄7次結果，計算抑制生長率。計算公式：抑制生長率=［（對照菌落直徑-處理菌落直徑）/（對照菌落直徑-菌餅直徑5.0 mm）］×100%。

2 結果與分析

2.1 病原菌的分離

根據田間癥狀，初步判斷為根腐病或葉斑病。從感病植株的葉片、葉鞘和塊莖的病健交界處分別取樣，分離病原菌，共分離出病原菌18株（真菌14株、細菌4株）。其中，從葉片中分離得到2株真菌和1株細菌，從葉鞘中分離得到9株真菌和2株細菌，從塊莖中分離得到3株真菌和1株細菌，這說明分離的菌種相對較多且較為復雜，但不同組織部位均沒有分離到霉菌。真菌編號為GF-1～GF-14，細菌編號為GB-1～GB-4，其中GF-1和GF-7在葉片、葉鞘以及塊莖中均能分離得到。圖2：A示部分分離的菌株。

2.2 病原菌的致病性測定

分別對18株菌株進行室內回接，接種3 d后觀察，發現真菌GF-1、GF-4、GF-5和GF-7出現較明顯的致病癥狀（圖2：B），6 d 后統計發病率（表1）。對室內接種發病率較高的GF-1、GF-4、GF-5和GF-7等進行田間回接，發現僅GF-1接種部位呈現黑斑、有燒焦狀、中間部位干枯（圖3：A），室內回接有明顯的黃色暈斑（圖2：B中的GF-1），切開根莖后有腐爛（圖2：C），與田間采取病株時的病害癥狀基本一致；其他菌株因致病病斑和對照組沒有繼續擴大或者無感病癥狀而接種部位干枯（圖3：B-E）。從接種GF-1的發病組織中重新分離獲得的病原菌，經純化培養后與接種的病原菌完全一致，符合柯赫式法則，這充分表明分離獲得的病原菌為該病的致病菌。

2.3 病原菌形態學鑒定

病原菌GF-1在 PDA培養基上，于25℃恒溫條件下培養 5 d ，長出白色絨絮狀菌落，菌絲匍匐向外、向上生長，氣生，菌落絮狀，白色，圓形，菌落背部中心褐色或黑褐色，周圍綠褐色至黃褐色（圖4：A，B）。菌絲無色，生長較快，有隔膜，直徑為3.2～6.9 μm，其分生孢子梗多分枝；厚垣孢子為長方形或橢圓形，大小為 （6.5～9.6） μm×（6.5～7.1） μm，分生孢子散生，呈卵形，大小為（5.3～8.9）μm×（1.4～3.6）μm（圖4：C，D）。菌落培養5 d 后直徑為5.2～7.0 cm（培養皿Φ=90 mm）。對照中國真菌志沒有發現類似的真菌種類，經查閱相關文獻資料（Aveskamp et al.，2010），初步判斷GF-1病原菌為附球菌屬病原菌。

2.4 病原菌ITS 區的序列系統發育分析

對菌株 GF-1 的 ITS rDNA 的 PCＲ 擴增產物進行測序、校對、剪切和拼接，獲得全長為552 bp的序列。將序列與 GenBank 中的相關數據進行一致性分析，結果表明菌株 GF-1的ITS 序列（TSB1G643013）與甘蔗的高粱附球菌（E. sorghinum，MN493119.1）序列一致性最高，為99.62%，而與白及中分離的A. 分離的4個菌株; B. 4個菌株室內回接; C. GF-1室內回接塊莖; D. 對照塊莖。

高粱附球菌（E. sorghinum，MF948994.1）序列一致性為98.88%。將這些序列利用MEGA 5.0構建系統進化樹，該序列與甘蔗分離的高粱附球菌（E. sorghinum，MN493119.1）聚為同一族，親緣關系最近，與已分離鑒定的白及高粱附球菌（E. sorghinum， MF948994.1）的親緣關系相對較遠，后者與煙草高粱附球菌（E. sorghinum，KJ767080.1）聚為同一族，這可能是因致病菌自身容易變異而引起的，這些病原菌在分子進化方向上存在一定差異（圖5）。

2.5 中藥材提取物對白及根腐病致病菌的抑制效果

中藥材提取物對根腐病致病菌的抑制效果如圖6和表2所示。與含無菌水培養的菌落（對照）相比，培養基中分別含有0.1、0.2 g·mL^-1的7種中藥材提取物能夠完全抑制GF-1菌落的生長。當培養基中添加低濃度（0.05 g·mL^-1）的提取物時，肉桂和丁香提取物仍能完全抑制菌落的生長，八角提取物抑制菌的生長率達到99.6%；而低濃度的青錢柳、白及、 厚樸和蛇床子卻不能完全抑制菌病原菌（Rhizoctonia sp.）引起白及塊莖腐爛病癥狀相似。根腐病發病率高，對藥材產量和品質危害很大，目前已成為影響三七、白術、黃芪等多種藥用植物生產的主要病害，并發現鐮刀屬真菌為主要病原菌（沈清清等，2014）。孫樂樂等（2013）報道，引起云南地區白及根腐病的病原菌是尖孢鐮刀菌（Fusarium oxysporum）和腐皮鐮刀菌（F. solani）；宋莉沙（2019）鑒定了貴州地區白及根腐病致病菌是腐皮鐮刀菌（F. solani）。本研究通過調查、致病菌分離，結合形態學和分子序列鑒定，發現引起廣西桂林地區白及根腐病的致病菌與前人（Perelló amp; Moreno， 2005;Aldo et al.， 2010；Oliveira et al.， 2017；朱香，2018；Zhou et al.， 2018）的報道不同，鑒定為附球菌屬真菌高粱附球菌（Epicoccum sorghinum）。該病菌鑒定時間較晚，國內于2018年后才逐漸報道，引起多種園藝植物葉斑病、褐斑病或環斑病（Yu et al.， 2019；Laurel et al.， 2021）。該致病菌引起白及葉斑?。╖hou et al.， 2018）的葉片出現褐色斑塊，周圍有黃色暈圈；而本研究發現該病菌早期引起白及地下塊莖腐爛，有腥臭味，后期導致莖基部和葉鞘基部長條形灰褐色斑塊，斑塊中央呈干枯狀、周圍黃色暈圈；而分子序列聚類則不是同一族，親緣關系相對較遠，這說明可能屬于不同生理小種引起的不同病害。

3.2 中草藥提取物對白及根腐病病原菌的抑制效應

化學農藥常用于藥用植物根腐病的防治，雖然具有療效快、操作方便、價格低廉等優點，但易造成農藥殘留量超標，從而影響藥材的品質；而植物源殺菌劑具有安全無毒害的作用，但控制藥用植物根腐病的效果較慢，并且易受環境影響（穆向榮等，2014）。丁香酚是丁香提取物的主要成分，通過干擾微生物的細胞膜結構起到抗菌作用（于未博，2020）；北細辛主要化學成分為萜類化合物，具有提高免疫力功能、抗菌等功效，蛇床子主要成分蛇床子素具有較好的速效性（馬偉，2010；肖瑤，2019）；劉瑩等（2009）發現厚樸主要活性成分厚樸酚具有抗炎抗菌等作用；趙慶芳等（2011）發現同種物質丙酮溶液的抑菌效果明顯好于水溶液。高粱附球菌 （E. sorghinum）能分泌一種類似于苯乙酸的毒素，不僅具有很強的致病性（朱香，2018），而且該病原菌寄主范圍廣泛，易感染葫蘆科、豆科、十字花科、楊柳科、禾本科、馬齒莧科、百合科及天南星科的植物（李潤根等，2020）。目前，未見有關該致病菌的生物防治研究。本研究利用乙醇提取了7種中藥材的提取物，觀察了對白及致病病原菌的室內抑制作用，發現0.1 g·mL^-1和0.2 g·mL^-1的青錢柳、白及、厚樸、八角、肉桂、蛇床子、丁香的提取物均能完全抑制高粱附球菌（E. sorghinum）的生長，0.05 g·mL^-1的八角、肉桂和丁香的提取物也基本能完全抑制生長，抑制生長率達到99.6%或100%。因此，這些中藥材提取物室內抑制菌的生長非常顯著，而室外田間抑制效果以及施用濃度卻還有待進一步研究。

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（責任編輯 蔣巧媛）