紅涼傘根化學(xué)成分及抗炎活性研究

摘 要：紅涼傘（Ardisia crenata var. bicolor）為貴州苗族常用藥，具有清喉利咽、消腫止痛、祛風(fēng)除濕等功效。為研究紅涼傘根化學(xué)成分及體外抗炎活性，該文采用硅膠柱色譜、Sephadex LH-20凝膠柱色譜、ODS反相柱色譜及半制備HPLC等方法對紅涼傘根70%乙醇提取物進行系統(tǒng)性研究，結(jié)合NMR、MS等現(xiàn)代波譜技術(shù)分析及文獻對比進行化合物結(jié)構(gòu)鑒定。采用脂多糖（LPS）誘導(dǎo)的小鼠RAW 264.7巨噬細胞的NO生成模型，評價化合物的抗炎活性。結(jié)果表明：（1）從紅涼傘根70%乙醇提取物中分離得到10個化合物，分別鑒定為11-O-沒食子酰巖白菜素（1）、11-O-（4-O-甲基沒食子酰）巖白菜素（2）、11-O-香草酰巖白菜素（3）、6-O-（4-羥基苯甲酰基）巖白菜素（4）、11-丁香酰巖白菜素（5）、11-O-（3′，4′-二甲基沒食子酸）-巖白菜素（6）、去甲氧基巖白菜素（7）、micractinin A（8）、monomethyl olivetol（9）、鄰苯二甲酸二丁酯（10），其中化合物4、8、9為首次從紫金牛屬中分離得到。（2）體外抗炎活性實驗結(jié)果表明，化合物1-4對小鼠RAW 264.7細胞的NO生成具有明顯的抑制作用（P＜0.01），在20 μmol·mL^-1濃度下，NO抑制率分別為67.09%、66.50%、59.83%、36.47%。該研究結(jié)果豐富了紅涼傘根的化學(xué)成分，明確了其部分抗炎活性物質(zhì)基礎(chǔ)，為其藥材資源的開發(fā)利用提供了理論依據(jù)。

關(guān)鍵詞：紅涼傘根，化學(xué)成分，分離純化，結(jié)構(gòu)鑒定，巖白菜素，抗炎活性

中圖分類號：Q946 文獻標識碼：A 文章編號：1000-3142（2024）02-0373-09

基金項目：國家重點研發(fā)計劃項目（2018YFC1708100）；貴州高層次創(chuàng)新人才培養(yǎng)項目（黔科合人才［2015］4032）；貴州省基礎(chǔ)科學(xué)重點項目（黔科合基礎(chǔ)［2019］1402）；貴州省科技計劃項目（黔科合基礎(chǔ)-ZK［2023］一般419）；貴州中醫(yī)藥大學(xué)科研創(chuàng)新和探索專項（2018YFC170810102）；貴州中醫(yī)藥大學(xué)科研創(chuàng)新和探索專項（2018YFC170810209）。

第一作者：葉洪波（1997-），碩士研究生，主要從事中藥民族藥藥效物質(zhì)基礎(chǔ)及活性評價，（E-mail）yehongbo020060@163.com。

^*通信作者：周英，博士，教授，主要從事中藥、民族藥化學(xué)成分及中藥新藥研究，（E-mail）yingzhou71@126.com。

Chemical constituents and their anti-inflammatory activities from the roots of Ardisia crenata var. bicolor YE Hongbo， ZHOU Yongqiang， LIAO Zhangrong， WEI Xin， YIN Xin， LI Jiaxin， ZHOU Ying^*

（ Guizhou University of Traditional Chinese Medicine， Guiyang 550025， China ）

Abstract： Ardisia crenata var. bicolor is a common medicine used by Miao Minority in Guizhou， which has the effects of clearing throat and benefiting pharynx， reducing swelling and relieving pain， dispelling wind and dehumidifying. In order to study the chemical constituents and anti-inflammatory activities of A. crenata var. bicolor roots， the 70% ethanol extact was separated and purified by silica gel column chromatography， Sephadex LH-20 gel column chromatography， ODS reverse column chromatography and semi-preparative HPLC. The structures of the compounds were identified by spectral data of NMR， MS and published literatures. Using lipopolysaccharide（LPS）-activated RAW 264.7 cell line model in vitro， compounds 1-4 were evaluated for the inhibition against nitric oxide（NO） production. The results were as follows： （1） Ten compounds were isolated from the 70% ethanol extract and identified as 11-O-galloylbergenin （1）， 11-O-（4-O-methylgalloyl） bergenin （2）， 11-O-vanilloylbergenin （3）， 6-O-（4-hydroxy benzoyl） bergenin （4）， 11-syringylbergenin （5）， 11-O-（3′，4′-dimethylgalloyl）-bergenin （6）， demethoxybergenin （7）， micractinin A （8）， monomethyl olivetol （9）， and dibutyl phthalate （10）. Among them， compounds 4， 8， 9 were obtained from Ardisia for the first time. （2） The results of anti-inflammatory activities in vitro showed that compounds 1-4 could significantly inhibit NO release in RAW 264.7 cells （Plt;0.01）， and the inhibition rates of compounds at the concentration of 20 μmol·mL^-1 were 67.09%， 66.50%， 59.83%， 36.47%， respectively. This study enriches the chemical constituents of A. crenata var. bicolor roots， clarifies the material basis of its anti-inflammatory activities， verifies the scientificity of its traditional usage， and provides new insight and scientific evidence for its rational development and utilization of the medicinal resources.

Key words： Ardisia crenata var. bicolor root， chemical constituents， isolation and purification， structure identification， bergenin， anti-inflammatory activity

紅涼傘（Ardisia crenata var. bicolor）為紫金牛屬（Ardisia）植物朱砂根（A. crenata） 的變種，主要分布于我國華東、中南、西南等地，以根入藥，具有清喉利咽、消腫止痛、祛風(fēng)除濕等功效（中國科學(xué)院北京植物研究所，1974；國家藥典委員會，2020）。紅涼傘作為貴州特色苗藥八爪金龍三大基原植物之一，收載于2003年版《貴州省中藥材、民族藥材質(zhì)量標準》，在貴州苗族地區(qū)具有悠久的藥用歷史（貴州省藥品監(jiān)督管理局，2003），常用于咽炎、慢性支氣管炎等疾病的治療。此外，《本草綱目》中記載的“苗高尺許，葉似冬青葉，背甚赤”“主治咽喉腫痹，磨水或醋咽之，甚良?！苯沂玖思t涼傘在咽炎治療中具有良好藥用價值（童家赟等，2017）。

現(xiàn)有研究表明，紅涼傘根中含有三萜皂苷類、香豆素類、糖苷類及甾體類化學(xué)成分（章為，2007；鄒萍等，2009；王雪，2011），具有較強的抗氧化、抗腫瘤等藥理活性（胡志霞等，2020；韓金芮，2021）。基于紅涼傘在貴州苗族地區(qū)的廣泛使用及其良好的抗炎生物活性，為進一步闡明紅涼傘根中的抗炎活性物質(zhì)基礎(chǔ)，為后續(xù)的開發(fā)與利用提供理論依據(jù)，本文在前期研究基礎(chǔ)上（葉洪波等，2022；Ye et al.，2022），對其70%乙醇提取物進行化學(xué)成分研究，采用柱色譜、制備型高效液相等分離技術(shù)，從水飽和正丁醇和乙酸乙酯萃取部位分離鑒定得到10個化合物（化合物1-10的結(jié)構(gòu)如圖1所示），并采用脂多糖（lipopolysaccharide，LPS）誘導(dǎo)的小鼠RAW 264.7巨噬細胞炎癥模型評價化合物的抗炎活性，結(jié)果發(fā)現(xiàn)巖白菜素類成分具有較好抗炎活性。本研究結(jié)果豐富了紅涼傘根的抗炎活性物質(zhì)基礎(chǔ)，可為紅涼傘根資源的綜合開發(fā)與利用提供參考。

1 材料與儀器

紅涼傘于2019年10月采集于貴州省雷公山地區(qū)，經(jīng)貴州中醫(yī)藥大學(xué)藥學(xué)院魏升華教授鑒定為紫金?？谱辖鹋僦参锛t涼傘（Ardisia crenata var. bicolor）。憑證標本（No. 20190815）保存于貴州中醫(yī)藥大學(xué)中藥民族藥重點實驗室。

DRX-500 AVANCE III-600 MHz超導(dǎo)核磁共振儀、BRUKER AVANCE NEO-400 MHz超導(dǎo)核磁共振儀（德國Bruker公司）；RID-20A示差折光檢測器、Shimadzu LC-16D半制備型高效液相色譜（HPLC）儀（日本島津公司）；JEOL JMSHX110A型質(zhì)譜（MS）儀（德國JEOL公司）；AAPI 3200型質(zhì)譜（MS）儀（美國Sciex公司）；LCQ-DECA XP型LC-（ESI）MS質(zhì)譜儀（美國Themo Finniga公司）；RE-2000A旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器（上海亞榮生化儀器廠）；HERACELL150i/240i細胞培養(yǎng)箱（美國Themo Finniga公司）。C₁₈反相柱填料ODS-A-HG（日本YMC公司）；半制備柱（ 250 mm×10 mm，5 μm，日本島津公司）；凝膠柱色譜填料（GE Healthcare Bio-Sciences， Uppsala， Sweden；LH-20）；柱層析硅膠（80～100、200～300目，青島海洋化工廠）。脂多糖（LPS，北京索萊寶科技有限公司）；Cell Counting Kit-8（CCK8，中國biosharp公司）；胎牛血清（fetal bovine serum，F(xiàn)BS）、 DEME 培養(yǎng)基（美國Gibco公司）；NO檢測試劑盒（南京建成生物工程研究所）；地塞米松（dexamethasone，DEX，美國Sigma公司）。二氯甲烷、石油醚、乙酸乙酯、甲醇（均為天津市富宇精細化工有限公司生產(chǎn)的分析純）。

2 提取與分離

取干燥紅涼傘根15.8 kg，粉碎成粗粉，以液料比10∶1（V/V）的70%乙醇加熱回流提取2次，每次2 h，合并過濾后的提取液，減壓回收溶劑，得到紅涼傘根浸膏5.1 kg。浸膏加適量蒸餾水混懸后依次用等體積石油醚、乙酸乙酯、水飽和正丁醇進行萃取，減壓濃縮得到3個萃取部位。

取350.0 g水飽和正丁醇萃取物，加入甲醇使其完全溶解，80目硅膠與樣品溶液1∶1（m/m）拌勻，揮干溶劑備用。采用高于樣品10倍量的200～300目硅膠，二氯甲烷濕法裝柱，干法上樣，以二氯甲烷-甲醇（1∶0～0∶1，V/V）進行梯度洗脫。減壓回收溶劑，薄層硅膠板監(jiān)視成分，合并相同組分，共得到8個流分（A-H）。流分D（15.4 g）經(jīng)ODS柱色譜干法上樣，以甲醇-水（1∶9～9∶1，V/V）進行梯度洗脫，正相薄層硅膠板監(jiān)視，合并相同組分，得到9個流分（D1-D9）。流分D8經(jīng)半制備型高效液相甲醇-水（40∶60，V/V）洗脫，得化合物1（20.0 mg）。

取150.0 g乙酸乙酯層萃取物，加入乙酸乙酯使其完全溶解，80目硅膠與樣品1∶1（m/m）混合均勻，揮干溶劑備用。200～300目硅膠與樣品1∶10（m/m）濕法裝柱，干法加入拌好樣品的硅膠，以二氯甲烷-甲醇（1∶0～0∶1，V/V）梯度洗脫。回收溶劑，正相薄層硅膠板監(jiān)視成分，合并相同的組分，得到7個流分（EA-EH）。流分EA（6.7 g）經(jīng)ODS梯度洗脫后，經(jīng)半制備型高效液相甲醇-水（79∶21，V/V）分離，得到化合物9（1.4 mg）。 流分EB（1.7 g）經(jīng)ODS梯度洗脫后，經(jīng)半制備型高效液相甲醇-水（75∶25，V/V）分離，得到化合物8（0.6 mg）。流分ED（10.0 g）上清液經(jīng)ODS反向柱層析梯度洗脫，回收流動相后正相薄層板監(jiān)視成分，得到6個流分（ED1-ED6）。ED4經(jīng)半制備型高效液相甲醇-水（42∶58，V/V）分離，得化合物2（2.4 mg）；ED5經(jīng)硅膠柱色譜二氯甲烷-甲醇（15∶1～5∶1，V/V）梯度洗脫，得到化合物3（1.5 mg）、4（1.2 mg）；ED6經(jīng)硅膠柱色譜二氯甲烷-甲醇（15∶1～5∶1，V/V）梯度洗脫，半制備型高效液相甲醇-水（56∶44，V/V）分離，得到化合物5（2.5 mg）和化合物6（4.5 mg）。流分EE（5.9 g）上清液經(jīng)ODS反向色譜柱層析梯度洗脫，回收流動相后正相薄層板監(jiān)視成分，合并相同的組分，得到6個流分（EE1-EE6）。EE2采用硅膠色譜柱和半制備型高效液相甲醇-水（40∶60，V/V）分離，得到化合物7（3.5 mg）；EE6經(jīng)半制備型高效液相甲醇-水（89∶11，V/V）分離，得到化合物10（5.0 mg）。

3 結(jié)構(gòu)鑒定

化合物1 無色針晶。ESI-MS m/z： 481" ［M+H］⁺，分子式為C₂₁H₂₀O₁₃。¹H-NMR （400 MHz， C₅D₅N） δ： 7.92 （2H， s， H-2′， 6′）， 7.79 （1H， s， H-7）， 5.34 （1H， dd， J =12.1， 2.0 Hz， H-10b）， 5.27 （1H， d， J =10.3 Hz， H-4a）， 4.81 （1H， dd， J =12.1， 6.7 Hz， H-4）， 4.58 （1H， dd， J =10.3， 9.3 Hz， H-11）， 4.49 （1H， dd， J =9.3， 8.3 Hz， H-11）， 4.38 （1H， ddd， J =9.0， 6.6， 2.1 Hz， H-3）， 4.19 （1H， dd， J =9.9， 8.3 Hz， H-2）， 3.97 （3H， s， 9-OCH₃）；¹³C-NMR （100 MHz， C₅D₅N） δ： 167.3 （C-7′）， 164.4 （C-6）， 152.8 （C-8）， 149.4 （C-10）， 147.7 （C-3′， 5′）， 142.1 （C-9）， 141.4 （C-4′）， 120.7 （C-1′）， 119.5 （C-6a）， 116.4 （C-10a）， 111.3 （C-7）， 110.4 （C-2′， 6′）， 81.1 （C-4a）， 80.6 （C-2）， 75.3 （C-4）， 74.2 （C-10b）， 71.6 （C-3）， 64.5 （C-11）， 60.3 （9-OCH₃）。以上數(shù)據(jù)與文獻（葉海亞等，1996）報道基本一致，故鑒定化合物1為11-O-沒食子酰巖白菜素（11-O-galloylbergenin）。

化合物2 白色固體粉末。ESI-MS m/z： 493" ［M-H］^-，分子式為C₂₂H₂₂O₁₃。¹H-NMR （400 MHz， C₅D₅N） δ： 7.79 （2H， s， H-2′， 6′）， 7.78 （1H， s， H-7）， 5.34 （1H， dd， J =12.1， 2.1 Hz， H-11）， 5.29 （1H， d， J =10.3 Hz， H-10b）， 4.84 （1H， dd， J =12.1， 6.5 Hz， H-11）， 4.54～4.61 （1H， m， H-4a）， 4.49 （1H， t， J =8.8 Hz， H-4）， 4.39 （1H， ddd， J =8.9， 6.5， 2.1 Hz， H-2）， 4.19 （1H， dd， J =10.0， 8.3 Hz， H-3）， 4.03 （3H， s， 4′-OCH₃）， 3.96 （3H， s， 9-OCH₃）; ¹³C-NMR （100 MHz， C₅D₅N） δ： 167.0 （C-7′）， 164.4 （C-6）， 152.9 （C-8）， 152.5 （C-3′， 5′）， 149.4 （C-10）， 142.1 （C-9）， 141.8 （C-4′）， 126.1 （C-1′）， 119.6 （C-6a）， 116.4 （C-10a）， 111.4 （C-7）， 110.3 （C-2′， 6′）， 81.2 （C-4a）， 80.5 （C-2）， 75.4 （C-4）， 74.3 （C-10b）， 71.6 （C-3）， 64.8 （C-11）， 60.3 （4′-OCH₃）， 60.2 （9-OCH₃）。以上數(shù)據(jù)與文獻（左國營等，2007）報道基本一致，故鑒定化合物2為11-O-（4-O-甲基沒食子酰）巖白菜素［11-O-（4-O-methylgalloyl） bergenin）］。

化合物3 白色固體粉末。ESI-MS m/z： 477" ［M-H］^-，分子式為C₂₂H₂₂O₁₂。¹H-NMR （400 MHz， CD₃OD） δ： 7.60 （1H， dd， J =8.5， 2.1 Hz， H-6′）， 7.48 （1H， d， J =2.1 Hz， H-2′）， 7.08 （1H， s， H-7）， 6.99 （1H， d， J =8.5 Hz， H-5′）， 5.03 （1H， d， J =10.4 Hz， H-10b）， 4.90 （1H， m， H-11）， 4.38 （1H， dd， J =12.2， 6.9 Hz， H-11）， 4.10 （1H， dd， J =10.5， 9.4 Hz， H-4a）， 3.96 （1H， ddd， J =9.4， 7.0， 2.0 Hz， H-2）， 3.91 （3H， s， 3′-OCH₃）， 3.88 （3H， s， 9-OCH₃）， 3.84 （1H， t， J =9.0 Hz， H-4）， 3.54 （1H， dd， J =10.0， 8.6 Hz， H-3）; ¹³C-NMR （100 MHz， CD₃OD） δ： 167.8 （C-7′）， 165.7 （C-6）， 153.7 （C-4′）， 152.4 （C-8）， 149.4 （C-10）， 147.6 （C-3′）， 142.3 （C-9）， 123.7 （C-6′）， 123.5 （C-1′）， 119.4 （C-6a）， 117.2 （C-10a）， 117.0 （C-5′）， 111.9 （C-2′）， 111.2 （C-7）， 81.3 （C-4a）， 80.6 （C-2）， 75.5 （C-4）， 74.4 （C-10b）， 71.9 （C-3）， 64.9 （C-11）， 60.9 （9-OCH₃）， 56.4 （4′-OCH₃）。以上數(shù)據(jù)與文獻（Jia et al.，1995）報道基本一致，故鑒定化合物3為11-O-香草酰巖白菜素（11-O-vanilloylbergenin）。

化合物4 黃色固體。ESI-MS m/z： 447" ［M-H］^-，分子式為C₂₁H₂₀O₁₁。¹H-NMR （400 MHz， C₅D₅N） δ： 8.27 （2H， d， J =8.5 Hz， H-2′， 6′）， 7.77 （1H， s， H-7）， 7.15 （2H， d， J =8.4 Hz， H-3′， 5′）， 5.44 （1H， dd， J =12.0， 2.1 Hz， H-11）， 5.34 （1H， d， J =10.4 Hz， H-10b）， 4.83 （1H， dd， J =12.0， 7.0 Hz， H-11）， 4.68 （1H， dd， J =10.1， 9.6 Hz， H-4a）， 4.52 （1H， t， J =8.8 Hz， H-4）， 4.45 （1H， ddd， J =9.4， 6.9， 2.1 Hz， H-2）， 4.22 （1H， dd， J =9.9， 8.4 Hz， H-3）， 3.97 （3H， s， 9-OCH₃）; ¹³C-NMR （100 MHz， C₅D₅N） δ： 167.0 （C-7′）， 164.7 （C-6）， 164.2 （C-4′）， 153.1 （C-8）， 149.7 （C-10）， 142.4 （C-9）， 132.9 （C-2′， 6′）， 121.5 （C-1′）， 119.9 （C-6a）， 116.7 （C-10a）， 116.6 （C-3′， 5′）， 111.6 （C-7）， 81.5 （C-4a）， 80.9 （C-2）， 75.7 （C-4）， 74.5 （C-10b）， 72.0 （C-3）， 64.9 （C-11）， 60.6 （9-OCH₃）。以上數(shù)據(jù)與文獻（Lin et al.，2012）報道基本一致，故鑒定化合物4為6-O-（4-羥基苯甲酰）巖白菜素［6-O-（4-hydroxy benzoyl） bergenin）］。

化合物5 白色固體粉末。ESI-MS m/z： 531" ［M+Na］⁺，分子式為C₂₃H₂₄O₁₃。¹H-NMR （400 MHz， C₅D₅N） δ： 7.79 （2H， s， H-2′， 6′）， 7.78 （1H， s， H-7）， 5.33 （1H， d， J =10.4 Hz， H-10b）， 4.90 （1H， m， H-11）， 4.70 （1H， dd， J =11.8， 8.4 Hz， H-11）， 4.69 （1H， dd， J =10.4， 9.3 Hz， H-4a）， 4.52 （1H， t， J =8.7 Hz， H-4）， 4.50 （1H， ddd， J =9.7， 7.1， 2.3 Hz， H-2）， 4.18 （1H， t， J =9.0 Hz， H-3）， 3.99 （3H， s， 9-OCH₃）， 3.89 （6H， s， 3′， 5′-OCH₃）；¹³C-NMR （100 MHz， C₅D₅N） δ： 167.0 （C-7′）， 164.6 （C-6）， 153.3 （C-8）， 149.8 （C-3′， 5′）， 149.2 （C-10）， 143.5 （C-4′）， 142.4 （C-9）， 120.1 （C-1′）， 120.0 （C-6a）， 116.6 （C-10a）， 111.7 （C-7）， 108.5 （C-2′， 6′）， 81.4 （C-4a）， 80.7 （C-2）， 75.7 （C-4）， 74.4 （C-10b）， 72.6 （C-3）， 65.5 （C-11）， 60.6 （9-OCH₃）， 56.7 （3′， 5′-OCH₃）。以上數(shù)據(jù)與文獻（張翠仙等，2010）報道基本一致，故鑒定化合物5為11-丁香酰巖白菜素（11-syringyl-bergenin）。

化合物6 白色固體粉末。ESI-MS m/z： 507" ［M-H］^-，分子式為C₂₃H₂₄O₁₃。¹H-NMR （400 MHz， C₅D₅N） δ： 7.90 （1H， d， J =2.0 Hz， H-6′）， 7.78 （1H， s， H-7）， 7.55 （1H， d， J =2.0 Hz， H-2′）， 5.51 （1H， dd， J =12.0， 2.2 Hz， H-11）， 5.33 （1H， d， J =10.4 Hz， H-10b）， 4.77 （1H， dd， J =12.0， 7.6 Hz， H-11）， 4.66 （1H， ddd， J =9.8， 7.6， 2.2 Hz， H-4a）， 4.51 （1H， t， J =8.9 Hz， H-4）， 4.46 （1H， ddd， J =9.8， 7.6， 2.2 Hz， H-2）， 4.19 （1H， dd， J =9.9， 8.4 Hz， H-3）， 3.99 （3H， s， 3′-OCH₃）， 3.92 （3H， s， 4′-OCH₃）， 3.86 （3H， s， 9-OCH₃）；¹³C-NMR （100 MHz， C₅D₅N） δ： 166.9 （C-7′）， 164.7 （C-6）， 154.3 （C-4′）， 153.2 （C-8）， 152.6 （C-3′）， 149.7 （C-10）， 142.5 （C-5′）， 142.4 （C-9）， 126.1 （C-1′）， 119.9 （C-6a）， 116.6 （C-10a）， 112.9 （C-2′）， 111.7 （C-7）， 105.7 （C-6′）， 81.4 （C-4a）， 80.6 （C-2）， 75.7 （C-4）， 74.4 （C-10b）， 72.2 （C-3）， 65.4 （C-11）， 60.7 （4′-OCH₃）， 60.6 （9-OCH₃）， 56.4 （3′-OCH₃）。以上數(shù)據(jù)與文獻（Jia et al.，1995）報道基本一致，故鑒定化合物6為11-O-（3′，4′-二甲基沒食子酸）-巖白菜素［11-O-（3′，4′-dimethylgalloyl）-bergenin）］。

化合物7 白色固體粉末。HR-FAB-MS m/z： 299.075 1" ［M+H］⁺ （Calcd. for C₁₃H₁₅O₈： 299.076 7），分子式為C₁₃H₁₄O₈。¹H-NMR （400 MHz， CD₃OD） δ： 6.99 （1H， d， J =2.4 Hz， H-7）， 6.53 （1H， d， J =2.4 Hz， H-9）， 4.93 （1H， d， J =10.4 Hz， H-10b）， 4.05 （1H， dd， J =10.2， 9.2 Hz， H-4a）， 4.01 （1H， d， J =10.0 Hz， H-11）， 3.81 （1H， t， J =9.0 Hz， H-4）， 3.69 （1H， m， H-11）， 3.65 （1H， m，H-2）， 3.42 （1H， t， J =9.1 Hz， H-3）；¹³C-NMR （100 MHz， CD₃OD） δ： 165.8 （C-6）， 160.3 （C-8）， 157.4 （C-10）， 126.1 （C-6a）， 115.7 （C-10a）， 110.3 （C-9）， 110.0 （C-7）， 83.1 （C-2）， 81.4 （C-4a）， 75.6 （C-4）， 74.3 （C-10b）， 71.9 （C-3）， 62.7 （C-11）。以上數(shù)據(jù)與文獻（Megumi et al.，2020）報道基本一致，故鑒定化合物7為去甲氧基巖白菜素（demethoxybergenin）。

化合物8 白色固體粉末。HR-FAB-MS m/z： 649.341 4" ［M+Na］⁺，（Calcd. for C₂₉H₅₄O₁₄Na： 649.341 1），分子式為C₂₉H₅₄O₁₄。¹H-NMR （400 MHz， CD₃OD） δ： 4.87 （1H， m， H-1′）， 4.25 （1H， d， J =7.2 Hz， H-1″）， 4.16 （1H， d， J =1.8 Hz， H-1）， 4.14 （1H， d， J =2.8 Hz， H-1）， 3.99 （1H， p， J =5.1 Hz， H-2）， 3.89 （3H， m， H-2′， 3′， 4″）， 3.87 （1H， m， H-3）， 3.85 （1H， d， J =5.2 Hz， H-2″）， 3.78 （1H， d， J =3.5 Hz， H-4′）， 3.75 （1H， d， J =3.1 Hz， H-5′）， 3.72 （1H， t， J =2.4 Hz， H-5″）， 3.71 （1H， d， J =2.0 Hz， H-6″），" 3.68 （1H， m， H-6′）， 3.67 （1H， d， J =4.6 Hz， H-3）， 3.52 （1H， m， H-3″）， 2.36 （2H， t， J =7.5 Hz， H-2′′′）， 1.62 （2H， t， J =7.4 Hz， H-3′′′）， 1.26～1.31 （16H， m， H-4′′′～13′′′）， 0.90 （3H， t， J =7.0 Hz， H-14′′′）; ¹³C-NMR （100 MHz， CD₃OD） δ： 175.5 （C-1′′′）， 105.3 （C-1″）， 100.5 （C-1′）， 74.7 （C-5″）， 74.6 （C-3″）， 72.5 （C-2″）， 72.1 （C-3）， 71.5 （C-4″）， 71.1 （C-4′）， 70.2 （C-5′）， 70.1 （C-2）， 69.7 （C-3′）， 67.8 （C-6′）， 66.6 （C-1）， 62.7 （C-6″）， 34.9 （C-2′′′）， 33.1， 30.8， 30.6， 30.5， 30.2， 23.7 （C-4′′′～13′′′）， 14.5 （C-14′′′）。以上數(shù)據(jù)與文獻（Tran et al.，2020）報道基本一致，故鑒定化合物8為micractinin A。

化合物9 黃色油狀物。¹H-NMR （600 MHz， CD₃OD） δ： 6.23 （1H， dd， J =2.2， 1.4 Hz， H-6）， 6.22 （1H， dd， J =2.2， 1.4 Hz， H-2）， 6.18 （1H， t， J =2.2 Hz， H-4）， 3.73 （3H， s， 3-OCH₃）， 2.49 （2H， t， J =5.2 Hz， H-1′）， 1.59 （2H， p， J =7.6 Hz， H-2′）， 1.33 （4H， m， H-3′， 4′）， 0.91 （3H， t， J =7.1 Hz， H-5′）; ¹³C-NMR （150 MHz， CD₃OD） δ： 162.3 （C-3）， 159.4 （C-5）， 146.4 （C-1）， 108.9 （C-6）， 106.5 （C-2）， 99.6 （C-4）， 55.5 （3-OCH₃）， 37.1 （C-1′）， 32.6 （C-2′）， 32.2 （C-3′）， 23.6 （C-4′）， 14.4 （C-5′）。以上數(shù)據(jù)與文獻（Mcclanahan amp; Robertson，2004）報道基本一致，故鑒定化合物9為monomethyl olivetol。

化合物10 黃色油狀物。ESI-MS m/z： 279" ［M+H］⁺，分子式為C₁₆H₂₂O₄。¹H-NMR （600 MHz， CD₃OD） δ： 7.73 （2H， dd， J =5.7， 3.3 Hz， H-3， 6）， 7.62 （2H， dd， J =5.7， 3.3 Hz， H-4， 5）， 4.30 （4H， t， J =6.7 Hz， H-1′， 1″）， 1.73 （4H， m， H-2′， 2″）， 1.47 （4H， m， H-3′， 3″）， 0.99 （6H， t， J =7.4 Hz， H-4′， 4″）; ¹³C-NMR （150 MHz， CD₃OD） δ： 169.3 （C-7， 8）， 133.6 （C-1， 2）， 132.3 （C-4， 5）， 129.9 （C-3， 6）， 66.7 （C-1′， 1″）， 31.7 （C-2′， 2″）， 20.3 （C-3′， 3″）， 14.0 （C-4′， 4″）。以上數(shù)據(jù)與文獻（趙邯濤等，2022）報道基本一致，故鑒定化合物10為鄰苯二甲酸二丁酯（dibutyl phthalate）。

4 抗炎活性測定

采用Cell Counting Kit-8（CCK8）試劑盒檢測藥物對小鼠巨噬細胞RAW 264.7的細胞毒作用，采用Griess法檢測細胞NO的釋放量（于玲玲等，2021；王研等，2022）。

4.1 CCK8試驗

取對數(shù)生長期的RAW 264.7細胞，調(diào)整細胞密度至每毫升1×10⁵個，接種于96孔板中（每孔100" μL），設(shè)置給藥組和空白對照組。在37℃、5% CO₂的恒溫細胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h，按照CCK8試劑盒說明書進行后續(xù)實驗操作，于450 nm處測定光密度（optical density， OD）。細胞活力評價公式：細胞存活率（%）=（OD_給藥組/OD_{空白對照組}）×100。用GraphPad Prism 8軟件處理實驗數(shù)據(jù)，結(jié)果如圖2所示。由圖2可知，在20 μmol·mL^-1濃度下，化合物1-4的細胞存活率均在90%以上。因此，化合物對小鼠RAW 264.7細胞無細胞毒作用。

4.2 NO釋放量試驗

取對數(shù)生長期的RAW 264.7細胞，接種于96孔板中，加入脂多糖（LPS）誘導(dǎo)巨噬細胞形成炎癥模型，同時加入20 μmol·mL^-1的待測化合物，試驗還設(shè)置空白對照組、模型組及陽性對照組（地塞米松），每組3個復(fù)孔。在37℃、5% CO₂恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h。按照NO試劑盒說明書操作，于540 nm處測定OD值。NO抑制率計算公式：R_I（%）=［（C_LPS組-C_給藥組）/（C_LPS組-C_{空白對照組}）］×100（其中C表示NO含量）。

數(shù)據(jù)采用GraphPad Prism 8統(tǒng)計分析軟件進行單因素方差分析（one-way ANOVA）和方差齊性檢驗進行組間比較，數(shù)據(jù)以均值±標準差（x±s）表示，Plt;0.01表示有顯著性，Plt;0.05表示有統(tǒng)計學(xué)意義，結(jié)果如表1和圖3所示。

與空白對照組相比，模型組細胞NO含量顯著增加（P＜0.01），表明造模成功。與模型組相比，在20 μmol·mL^-1濃度下，給藥組所有化合物對RAW 264.7小鼠巨噬細胞NO釋放均具有一定的抑制作用，其中化合物4抑制率最小，為36.47%，化合物1抑制率最大，為67.09%。

5 討論與結(jié)論

本研究從紅涼傘根70%乙醇提取部位分離鑒定10個單體化合物，包括7個巖白菜素類衍生物（化合物1-7）和3個其他化合物（化合物8-10），其中化合物4、8、9為首次從紫金牛屬中分離得到。

炎癥是機體在受到機體內(nèi)外物理、化學(xué)等刺激時作出的生理反應(yīng)，通常表現(xiàn)為紅、腫、熱、痛等癥狀。適當(dāng)?shù)难装Y反應(yīng)有助于機體抵御損傷，促進傷口愈合，但過度炎癥反應(yīng)會對人體正常組織器官造成損傷且可能促進某些疾病的發(fā)生與發(fā)展（李麗等，2023；劉雅清等，2023）。NO在炎癥級聯(lián)反應(yīng)，特別是炎癥反應(yīng)的發(fā)生和信號傳導(dǎo)方面起到關(guān)鍵調(diào)節(jié)作用（羊波等，2016）。有研究發(fā)現(xiàn)，巖白菜素通過影響細胞炎癥因子的釋放、生物酶活性及相關(guān)炎癥通路蛋白的表達來起到良好的抗炎作用（de Oliveira et al.，2019；鄭勝眉等，2020；藍穎等，2021）。

本研究采用LPS誘導(dǎo)RAW 264.7細胞產(chǎn)生NO為評價模型，篩選了化合物1-4對NO生成的抑制作用。本研究結(jié)果顯示，化合物1-4對LPS誘導(dǎo)RAW 264.7細胞產(chǎn)生NO均具有不同程度的抑制作用，其中化合物1-3抑制作用較強，20 μmol·mL^-1濃度下NO抑制率分別為69.81%、67.09%和66.50%，與40 μg·mL^-1濃度下DEX抑制率相當(dāng)。結(jié)合構(gòu)效關(guān)系分析，巖白菜素類化合物苯環(huán)上3′，4′，5′位羥基或甲氧基的取代可能是其發(fā)揮抗炎作用的關(guān)鍵官能團。巖白菜素及其衍生物已被報道具有較強的抗炎、抗艾滋病毒、抗糖尿病等生物活性（Piacente et al.，1996；Zhang amp; Lee，2003；Li et al.，2005；張東東等，2020；周金娜等，2020），其中良好的抗炎活性，在本研究中得到進一步證實，其抗炎機制可能與減少相關(guān)炎癥因子的釋放、降低炎癥通路蛋白的表達有關(guān)。綜上所述，紅涼傘根化學(xué)成分的良好抗炎活性為其作為咽喉疾病用藥提供科學(xué)依據(jù)。本研究結(jié)果豐富了紅涼傘的化學(xué)成分，明確了其具有抗炎效果的物質(zhì)基礎(chǔ)，驗證了其在貴州苗族地區(qū)用法的科學(xué)性，為藥材資源的進一步開發(fā)與利用提供了重要依據(jù)。

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（責(zé)任編輯 鄧斯麗）